人miR-1908慢病毒载体构建及在人脂肪前体细胞中的表达验证

目的 构建人miR-1908慢病毒表达载体,包被病毒并检测其在人脂肪前体细胞中过表达效果。方法 以人脂肪细胞基因组DNA为模板,PCR高保真扩增包含miR-1908区域上下游各100bp左右的基因组DNA,亚克隆入慢病毒表达载体,与包装质粒共转染HEK-293T细胞,包装病毒,收取病毒上清,纯化后感染人脂肪前体细胞,36 h开始观察荧光标记,72 h收取细胞,抽提RNA,Realtime PCR检测慢病毒感染下miR-1908的相应表达量。结果 成功构建人miR-1908慢病毒表达载体,包装获得的病毒感染人脂肪前体细胞的效率可达到70%以上,miR-1908过表达水平可接近2倍。结论 本研究成功构建了人miR-1908慢病毒过表达载体,包被的慢病毒可以在人脂肪前体细胞中实现过表达效果,为后续功能研究奠定了基础。     

小鼠miR-29c过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建小鼠miR-29c过表达重组慢病毒载体,并对表达产物进行鉴定。方法应用PCR法从小鼠MLE-12细胞中提取pre-miR-29c基因,测序后将其克隆到pLenti-CMV-EGFP慢病毒载体,通过PCR筛选及测序对阳性克隆进行鉴定。将miR-29c过表达慢病毒载体转染至293T细胞,进行慢病毒的包装和滴度测定。以RT-PCR检测慢病毒转染MLE-12细胞中miR-29c的表达量。结果构建miR-29c慢病毒表达载体Lv-miR-29c经PCR和测序鉴定正确,并获得滴度为5.65×108 IU/ml的病毒浓缩液,转染MLE-12细胞后miR-29c基因成功过表达。结论成功构建miR-29c过表达慢病毒载体,为进一步研究miR-29c的功能奠定实验基础。     

靶向人ERG基因的siRNA重组慢病毒表达载体的构建

目的构建靶向人ERG基因的siRNA重组慢病毒表达载体。方法针对人ERG基因的mRAN序列,设计特异性干扰序列,两端引入酶切位点,人工合成OligoDNA,退火后与双酶切的pLVX-shRNA2慢病毒载体质粒连接,构建慢病毒载体质粒pLVX-shRNA2-ERGsiRNA,通过测序鉴定连接正确后,以293T细胞包装得到荷载ERGsiRNA基因的慢病毒;根据293T细胞表达绿色荧光蛋白水平计算病毒滴度;病毒感染前列腺癌VCaP细胞株,通过实时荧光定量PCR检测ERGmRNA的表达。结果测序结果表明,靶向人ERG基因的siRNA慢病毒表达载体构建成功,包装后的慢病毒滴度为1.1×108TU/ml。感染VCaP细胞后,实验组和对照组相比ERGmRNA的表达水平显著降低,siRNA对ERG表达的干扰效率为87.46%。结论成功构建靶向人ERG基因的siRNA慢病毒表达载体。     

慢病毒介导的稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基基因的WRL68细胞株构建

目的利用慢病毒载体构建稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的WRL68细胞株。方法采用PCR方法合成GCLC基因全长,经Not I、Nsi I酶切后克隆到慢病毒载体LV6上;采用PCR、酶切、测序鉴定重组质粒LV6-GCLC;将重组质粒转染293T细胞,收集培养上清并感染WRL68细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定过表达细胞株。采用增强型绿色荧光蛋白检测转染情况,采用Real-time PCR及Western blotting鉴定所构建的细胞株;MTT法检测细胞活性;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞谷胱甘肽(GSH)含量。结果 PCR、酶切及测序结果表明重组慢病毒载体构建成功;重组慢病毒转染293T细胞后可观察到荧光及蛋白表达,包装过表达慢病毒并检测其浓缩滴度为1.0×109 TU/ml;用1μg/ml嘌呤霉素成功筛选出稳定过表达细胞株;GCLC过表达组中GCLC的m RNA和蛋白的表达量高于空载体转染组及对照组(P0.05);GCLC过表达组、空载体转染组及对照组的细胞活性间比较,差异无统计学意义(P0.05);GCLC过表达组GSH含量明显高于空载体转染组及对照组(P0.05)。结论成功构建了稳定过表达人GCLC的WRL68细胞株。     

Hsa miR-7慢病毒表达载体的构建及其在人卵巢癌细胞HO8910-PM中表达的有效性

目的：构建Hsa miR-7的慢病毒表达载体,感染人卵巢癌细胞HO8910-PM后检测微小RNA 7（miR-7）及其靶基因血管内皮生长因子受体（EGFR）的表达,为研究miR-7在HO8910-PM中的生物学功能奠定基础。方法：将聚合酶链反应（PCR）扩增得到的miR-7前体序列pre-miR-7和慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1经酶切后连接产生pLVX-miR-7-IRES-ZsGreen1,经酶切及测序鉴定正确后在HEK293T细胞中包装病毒,病毒浓缩后感染HO8910-PM用实时荧光定量PCR（qPCR）方法检测感染后的HO8910-PM中pre-miR-7和miR-7的表达,qPCR及蛋白质印迹（Western blot）方法检测其靶基因EGFR的表达。结果：酶切及测序结果示慢病毒表达载体pLVX-miR-7-IRES-ZsGreen1构建正确,病毒浓缩液感染HO8910-PM后能有效提高pre-miR-7的表达（t=17.909,P=0.004）和miR-7的表达（t=35.320,P=0.024）,并能有效降低其靶基因EGFR的mRNA的表达（t=8.83,P=0.005）及蛋白的表达（t=22.14,P=0.002）。结论：成功构建了pLVX-miR-7-IRES-ZsGreen1慢病毒表达载体及稳定表达miR-7的HO8910-PM细胞亚系。     

人NSD2基因特异性shRNA慢病毒载体构建及沉默效果评价

目的:构建针对人NSD2基因的shRNA慢病毒载体,并观察其在人肾293T细胞中沉默效果,从而为进一步研究NSD2基因在其他肿瘤细胞系中的表达及影响奠定基础。方法:以NSD2基因为靶标,设计并合成2条互补寡核苷酸序列(NSD2 shRNA-1,NSD2 shRNA-2)克隆至PLKO-puro重组慢病毒载体中,形成新的重组慢病毒载体PLKO-NSD2-puro。然后与包装质粒PMDL、PV5VG、PREV在293T细胞中进行包装,产生重组慢病毒颗粒,并进一步感染293T细胞,通过提取蛋白进行Western Blot检测NSD2基因沉默效果。结果:通过PCR鉴定和DNA测序鉴定证明NSD2 shRNA-1,NSD2 shRNA-2重组shRNA慢病毒表达质粒中插入了目的 DNA片段。且通过Western Blot检测NSD2基因沉默效果,证明了NSD2 shRNA构建效果不错,可以进一步运用于与NSD2相关的肿瘤细胞细胞系中。结论:成功构建了人的NSD2基因shRNA真核表达的慢病毒载体,为进一步应用于其他与NSD2相关的癌细胞系,针对NSD2基因的肿瘤治疗研究奠定基础。     

负载ERRα基因片段慢病毒构建及表达

目的构建编码人雌激素相关受体α(hERRα)的慢病毒载体,并测定其滴度,观察hERRα基因在体外的表达情况及其对人肺癌细胞A549增殖的影响。方法采用PCR扩增hERRα基因片段,插入转移载体pW-PXLD,用磷酸钙法将pWPXLD-hERRα、psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒,浓缩后测定病毒滴度,再将病毒感染A549细胞,用蛋白印迹方法测定感染病毒的A549细胞中hERRα的表达。选择合适滴度的病毒感染A549细胞,采用cell-titer的方法检测感染病毒的A549细胞的活力。结果测序结果显示成功构建了重组质粒pWPXLD-hERRα,测定浓缩后的病毒滴度为1.8×108TU/mL,蛋白印迹方法检测到慢病毒感染的A549细胞中hERRα呈阳性表达;cell-titer glo检测结果表明过表达hERRα能促进细胞增殖。结论成功构建了负载hERR基因片段的慢病毒,hERRα能在感染的A549细胞中高效表达,并促进感染病毒的A549细胞增殖。     

miR-19b下调大鼠H9c2心肌细胞Kir2.1蛋白表达

目的:检测miR-19b对大鼠H9c2心肌细胞Kir2.1表达的影响,探讨miRNA参与房颤发生发展的机制。方法:培养大鼠H9c2心肌细胞,构建miR-19b过表达质粒、miR-19b干扰质粒、阴性序列质粒,通过慢病毒载体感染大鼠H9c2心肌细胞;倒置荧光显微镜观察感染效率,qRT-PCR检测H9c2细胞中miR-19b mRNA表达水平。qRT-PCR检测H9c2细胞中Kir2.1mRNA水平。Western blot检测H9c2细胞中Kir2.1蛋白表达水平。结果:miR-19b慢病毒载体成功感染H9c2细胞;qRT-PCR检测,与阴性序列组相比,miR-19b过表达组Kir2.1 mRNA表达水平降低,miR-19b干扰组Kir2.1 mRNA表达水平升高;Western blot检测,与阴性序列质粒组相比,miR-19b过表达组Kir2.1蛋白表达水平降低,miR-19b干扰组Kir2.1蛋白表达水平升高。结论:miR-19b抑制KCNJ2的转录,下调Kir2.1蛋白表达,提示mi-19b可能参与房颤的发生发展。     

慢病毒介导β-珠蛋白基因添加在β-地中海贫血基因治疗中的应用

目的:构建全长人β-珠蛋白基因慢病毒载体,稳定转染K562细胞使得β-珠蛋白高效表达,为β-珠蛋白基因添加治疗奠定基础。方法:采用PCR扩增人正常β-珠蛋白基因,加上Sph I和Not I两个酶切位点进行T载体克隆,获得重组质粒p UC57-β-globin。用限制性内切酶连接目的基因片段和慢病毒载体,筛选获得慢病毒表达载体LV-β-globin,测序。将慢病毒载体转染293T细胞,包装病毒。用LV-β-globin感染K562细胞。采用流式细胞仪检测荧光效率,运用实时PCR及Western Blotting检测K562细胞中β-珠蛋白mRNA及蛋白表达情况。结果:通过PCR获得长度为2 128 bp的目的基因。连接p UC57载体和慢病毒表达载体,慢病毒表达载体LV-β-globin构建成功,序列正确。LV-β-globin转染K562细胞72 h后,显示大量绿色荧光表达,荧光效率为94.8%。β-珠蛋白mRNA 2-ΔΔCt值为4.080±0.078,高于对照组;β-珠蛋白灰度值为1.063±0.082,高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建并包装含人β-珠蛋白基因的慢病毒载体并高效稳定表达。     

小鼠 Tox3 基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3~N克隆人慢病毒表达载体pCDH—MCS—T2A—copGFP—MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染HEK293FF细胞,包装重组慢病毒LV—Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测Tox3mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Westernblot）法检测T0x3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV—Tox3;RT—PCR及Westernblot结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV—Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。     

RyR2-shRNA重组慢病毒载体的构建及其对离体心肌细胞RyR2基因表达的影响

目的构建携带RyR2-shRNA的慢病毒载体,并检测其对小鼠离体心肌细胞中RyR2的基因沉默效果。方法设计并合成针对小鼠RyR2基因的shDNA,克隆入含U6启动子和EGFP报告基因的慢病毒载体psiHIV-U6-eGFP,构建表达RyR2-shRNA的慢病毒载体,通过将慢病毒转移质粒和包装质粒共转染293T细胞,得到重组慢病毒载体颗粒,然后离体感染小鼠心肌细胞,采用Real-timePCR检测RyR2在mRNA水平的沉默效应。结果经测序证实RNAi慢病毒载体构建成功并成功包装。流式细胞仪测得重组慢病毒感染小鼠心肌细胞的阳性率达80%以上。Real-timePCR证实,重组慢病毒Lenti-siRyR2感染的小鼠心肌细胞中RyR2在mRNA水平基因抑制率达90%以上。结论成功构建了表达RyR2-shRNA的重组慢病毒表达载体,并在小鼠心肌细胞中实现有效的基因沉默效应。     

小鼠Tox3基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3基因克隆入慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染HEK293FT细胞,包装重组慢病毒LV-Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Tox3 mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Western blot）法检测TOX3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV-Tox3;RT-PCR及Western blot 结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV-Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。     

食物致敏性评价表达人IgE高亲和力受体αβγ的大鼠嗜碱性白血病粒细胞2H3细胞株的建立及鉴定

目的建立稳定表达人IgE高亲和力受体alpha、beta和gamma链(human high affinity receptor containing alpha, beta and gamma chain,hFcεRIαβγ)的大鼠嗜碱性白血病粒细胞(rat basophil leukemia,RBL)-2H3细胞株。方法将包装好的载有hFcεRIαβγ慢病毒感染目的细胞RBL-2H3细胞,实时PCR检测细胞hFcεRIαβγ的表达水平,流式细胞仪分选hFcεRIα表达阳性细胞,并检测分选后细胞hFcεRIα的表达水平。结果成功构建重组慢病毒表达载体GV348-hFcεRIαβγ和慢病毒颗粒;慢病毒能够有效感染RBL-2H3细胞,hFcεRIαβγ在RBL-2H3细胞中成功表达,hFcεRIα在RBL-2H3细胞蛋白水平成功表达。结论初步构建了hFcεRIαβγ/RBL-2H3细胞,相较于RBL-2H3细胞,该细胞表达hFcεRIα,可与人血清IgE特异性结合,能够更好地应用于食品致敏性评价体系中。     

miR-145真核表达载体的构建及表达

目的构建miR-145的真核表达载体,为研究miR-145在结肠癌中的生物学功能奠定基础。方法设计并应用PCR扩增miR-145基因片段,将其导入真核表达载体pCMV-myc中构建重组质粒pCMV-miR-145后,将重组质粒转染入结肠癌细胞系HCT116中,运用RT-PCR检测miR-145的表达情况。结果酶切及DNA测序证实miR-145被正确克隆入真核表达载体pCMV-myc中,该重组质粒能在HCT-116细胞中高效表达miR-145。结论成功构建了miR-145的真核表达载体pCMV-miR-145,该载体能有效高表达miR-145。     

TGF-βⅡR单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白携带miR-29b抗肝纤维化的研究

目的 观察TGF-βⅡR单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白(简称新型载体)携带miR-29b对体外培养肝星状细胞(HSC)的转染效率和治疗效果,为今后肝纤维化基因治疗提供新载体.方法 脂质体、新型载体和慢病毒携带miR-29b治疗体外培养的HSC,荧光显微镜和流式细胞术观察转染效率,实时荧光定量RT-PCR和Western Blot技术分析collagen α(1) (Ⅰ) mRNA和蛋白表达水平.结果 与对照组比较,慢病毒组的转染效率最高,为70％;其次为新型载体组,为58％;最后为脂质体组,为29％.各载体组collagen α1(Ⅰ) mRNA表现出不同的下降,与对照组比较,慢病毒组下降70％(t=6.316,P＜0.01),新型载体组为50％(t=4.082,P＜0.01),脂质体组为38％(t =3.014,P＜0.05).各载体组collagen α1 (Ⅰ)蛋白也表现出不同的下降,慢病毒组下降为59％(t=4.209,P＜0.01);新型载体组为41％(t =4.033,P＜0.01;);脂质体组为27％(f=2.842,P＜0.05).结论 笔者构建的新型载体具有较高的转染效率,并且携带miR-29b具有较好的抗肝纤维化效果.     

Wnt-3a/eGFP双表达基因慢病毒载体的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建双表达基因慢病毒载体pLV.EX3d.P/puro-EF1A>Wnt-3a>IRES/eGFP,用携带目的基因Wnt-3a及示踪基因增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒转导大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs),建立能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型。方法基于GatewayTM技术构建双表达基因慢病毒载体,经293FT包装并释放出病毒转导rBMSCs,检测Wnt-3a以及β-catenin的表达水平。结果经测序证实目的基因Wnt-3a及示踪基因eGFP片段按正确方向重组入目的载体中。用含Wnt-3a/eGFP的病毒上清转导rBMSCs,转导率超过85%。RT-PCR证实rBMSCs-Wnt3a过表达wnt-3a和β-catenin。结论携带目的基因Wnt-3a及示踪基因eGFP的慢病毒可以稳定转染rBMSCs,构建了能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型。     

构建siRNA慢病毒载体抑制A549细胞株VEGF受体KDR基因的表达

目的构建针对血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR基因的siRNA慢病毒载体,鉴定其对肺癌细胞株A549基因干扰效果。方法设计合成针对KDR编码区的三条siRNA序列及阴性对照序列,克隆到PGCL-GFP载体,构建重组质粒,行PCR鉴定、DNA测序分析;转染人肺癌细胞株A549,Real-Time PCR及Western blot分别检测KDR mRNA、蛋白水平变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期。结果成功构建pGCL/KDR-siRNA重组质粒。A549干扰组KDR mRNA表达率下降,KDR蛋白表达量明显减少,细胞周期改变。结论构建的pGCL/KDR-siRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制A549细胞株KDR基因的表达。