靶向wnt-1基因的RNA干涉质粒构建及抑制U251细胞增殖的实验研究

目的构建靶向wnt-1基因的RNA干涉表达载体,转染人胶质瘤细胞U251中,研究该质粒的抑瘤效果。方法根据siRNA设计原则,通过软件设计,选取含有21个核苷酸(21nt)靶序列,形成siRNA的DNA模板并克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中,获得靶向抑制wnt-1基因表达的siRNA表达载体,并经酶切测序鉴定。用该干涉质粒转染U251细胞,通过逆转录PCR、Western blotting方法检测wnt-1基因mRNA和蛋白表达水平,用MTT法、流式细胞术初步评价对U251细胞的增生、细胞周期影响。结果成功构建针对靶向wnt-1基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-wnt-1 RNA干涉质粒,可显著抑制U251细胞wnt-1基因的mRNA和蛋白表达。MTT法分析转染细胞增生明显抑制,流式细胞仪分析细胞周期证实转染后比空白对照组受到阻滞。结论靶向wnt-1基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-wnt-1 RNA干涉质粒构建成功,并可特异性的沉默wnt-1基因蛋白表达,使细胞增长减慢,细胞周期阻滞,本实验通过wnt-1的RNA干涉,为由wnt-1介导的wnt信号通路在胶质瘤发病机制中的抑瘤作用提供了依据,并为进一步该基因的基因治疗临床实验提供了可靠基础。     

人醛缩酶A干扰RNA真核表达载体的构建

目的 构建4个人醛缩酶A （aldolaseA,ALDOA）公共序列的干扰RNA真核表达载体,转染人脑神经胶质细胞U251细胞,为醛缩酶A成为人脑肿瘤标志物提供实验基础和有价值的资料.方法 ①构建4个新靶点醛缩酶A干扰RNA真核表达载体并用双酶切和测序鉴定;②用脂质体法瞬时转染上述4个载体到U251细胞株.结果 ①成功构建了4个新靶点的醛缩酶A干扰RNA真核表达载体即pGPU6/GFP/Neo-ALDOA-1,pGPU6/GFP/Neo-ALDOA-2,pGPU6/GFP/Neo-ALDOA-3和pGPU6/GFP/Neo-ALDOA-4;②在U251细胞中有绿色荧光蛋白表达.结论 成功构建并筛选出效果最好的新靶点MBP干扰RNA真核表达载体.     

人脑胶质瘤CDK2干扰RNA新靶点的检验

目的 构建4个新靶点CDK2干扰RNA真核表达载体,转染人脑胶质细胞瘤SHG44细胞,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测mRNA表达,获得干扰效果最好的真核表达载体,为CDK2成为人脑肿瘤标志物提供有价值的资料.方法 (1)构建4个新靶点CDK2干扰RNA真核表达载体并用双酶切和测序鉴定;(2)用脂质体法瞬时转染上述4个载体到SHG44细胞株;(3)通过 RT-PCR 比较转染后CDK2 mRNA表达量,选出干扰效果最好的一个载体.结果 (1)成功构建了4个新靶点CDK2干扰RNA真核表达载体即pGPU6/GFP/Neo-CDK2-1、pGPU6/GFP/Neo-CDK2-2、pGPU6/GFP/Neo-CDK2-3、pGPU6/GFP/Neo-CDK2-4;(2)CDK2 mRNA表达明显受抑制,并获得效果最好的CDK2干扰RNA真核表达载体.结论 成功构建并筛选出效果最好的新靶点CDK2干扰RNA真核表达载体,使SHG44细胞的CDK2 mRNA表达明显降低.     

靶向survivin的siRNA表达载体的构建及生物活性鉴定

目的 构建靶向survivin的siRNA表达载体。方法 设计合成靶向Survivin的siRNA相应DNA模板单链,将其克隆入空质粒pRNAT-U6．1／Neo,模板链两端分别设计两个不同的酶切位点,退火形成siRNA载体插入片段。用限制性酶切将空载体线性化,T4DNA连接酶将siRNA片段插入空载体中,对该重组表达载体进行鉴定,获得RNA干扰质粒载体pRNAT-U6．1／Neo-sur-vivin。脂质体法将pRNAT-U6．1／Neo-survivin导入膀胱癌T24细胞株,实时定量PCR法检测对T24细胞survivin基因表达的抑制情况。结果 PCR、酶切鉴定、DNA测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变。重组载体能干扰T24细胞survivin基因的表达,并具有新霉素抗性。能够用G-418筛选稳定转化的细胞株。结论 成功构建了靶向survivin基因表达的RNA干扰质粒载体pR-NAT-U6．1／Neo-survivin。并转染膀胱癌细胞株,为进一步运用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。     

shRNA稳定转染抑制氯离子通道蛋白1基因的表达对小鼠肝癌细胞的影响

目的 将shRNA 稳定转染至小鼠肝癌细胞株Hca-F 中,使得氯离子通道蛋白1(CLIC1)基因表达抑制,观察肿瘤细胞的增殖、细胞周期、凋亡情况以及迁移能力的变化.方法 设计并合成理论上最佳的shRNA 序列,进而将其插入pGPU6 /GFP /Neo 质粒中,经测序和双酶切验证载体构建成功后以梭华-Sofast 将DNA 质粒稳定转染至小鼠肝癌细胞株Hca-F 中,经Real-time RT-PCR 验证CLIC1 mRNA 表达下调后,应用CCK-8 试剂盒和流式细胞仪检测干扰前后的Hca-F 细胞,对比观察细胞的增殖、细胞周期和凋亡情况的变化,应用Transwell 小室检验其迁移能力的变化.结果 pGPU6 /GFP /Neo-shRNA 对CLIC1 mRNA 抑制效果明显,抑制率达57%.经该表达质粒的干扰后,Hca-F 细胞的增殖能力明显增强,停留于G2 /M 期的细胞明显增多,凋亡细胞显著减少,Transwell 小室中穿膜细胞数量明显减少.结论 CLIC1 基因具有抑制小鼠肝癌细胞的增殖和促进其凋亡的作用,并且参与细胞周期中G2 /M 期的调节,同时能够促进肿瘤细胞的迁移.     

白血病细胞株K562和SHI-1糖基转移酶表达的差异

目的 探讨白血病细胞株K562与SHI-1糖基转移酶表达的差异。方法应用RT-PCR法研究白血病细胞株K562与Sill-1糖基转移酶mRNA表达的差异。结果K562和SHI-1细胞株均表达0GnT、βGnT1、β3GnT5、βGalT2，但表达量不同。K562细胞株主要表达ppGalNacT2、T4、T5、T7，但表达量有差异，而SHI-1细胞株ppGalNacT1、T2、T3、T4均有表达但表达量亦有不同。     

MMP-26基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建基质金属蛋白酶-26（MMP-26）小干扰RNA（siRNA）表达质粒,以研究其对人肿瘤细胞MMP-26基因表达的沉默效果,探索肿瘤基因治疗的新途径.方法 根据MMP-26基因mRNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列,克隆到空载体pSUPERIOR.puro中,构建重组质粒,同时设计构建分别针对GFP和β-actin的干扰质粒作为阴性对照和阳性对照,并进行酶切鉴定和测序分析.结果 酶切及测序证实重组质粒构建成功.结论 利用RNA干扰（RNAi）技术可成功构建siRNA表达载体.     

血管内皮生长因子C靶向RNA干扰重组载体的构建和效应检测

目的:构建针对人血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体,并观察其在胃癌细胞中的干扰效果。方法:实验于2006-02/2007-02在河南省分子医学重点学科开放实验室完成。①实验材料:小干扰RNA表达载体pSilencer3.1为美国Ambion公司产品;胃癌细胞SGC7901为河南省分子医学重点学科开放实验室保存;血管内皮生长因子C基因的干扰片断和聚合酶链反应引物(152bp)由上海生工生物公司合成。②实验过程:根据pSilencer3.1-H1载体要求设计靶向血管内皮生长因子C基因的两对小干扰RNA,退火后连接入载体相应位点,构建重组表达质粒。经酶切和测序鉴定后分别转染胃癌细胞株SGC-7901,经G418筛选,获得稳定表达的细胞株。③实验评估:采用反转录-聚合酶链反应和Westernblot法检测血管内皮生长因子CmRNA和蛋白水平的表达。结果:①重组质粒的酶切、核苷酸序列分析结果:经酶切和测序鉴定证实成功构建了血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体,建立了稳定转染细胞株。②稳定转染的细胞株中血管内皮生长因子CmRNA和蛋白表达:反转录-聚合酶链反应和Western blot显示转染后血管内皮生长因子C表达与对照组相比有不同程度的降低,以pSilencer3.1-neo-VEGF-C1尤为明显,抑制血管内皮生长因子C表达,不影响细胞的生长。结论:成功构建了血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体及稳定转染的胃癌细胞株。     

β3GnT2、β3GnT8真核表达载体的构建及胃癌AGS、胶质瘤U251细胞株中β3GnT8cDNASNP的分布

目的 β3GnT2和β3GnT8的克隆及真核表达载体的构建.方法 RT-PCR法检测β3GnT2、β3GnT8在胃癌、胶质瘤、乳腺癌三类癌细胞株中的表达;PCR扩增带酶切位点β3GnT2、β3GnT8全长编码片段并构建真核表达载体pEGFP-C1-β3GnT2、pEGFP-C1-β3GnT8.结果 β3GnT2、β3G...     

小鼠α1,3-半乳糖基转移酶RNA干扰重组慢病毒的构建与鉴定

背景:研究表明,通过抑制α1,3-半乳糖基转移酶的生成而减少甚至避免供体Gala(1,3)Gal的生成,是渡过器官移植后超急性排斥反应的一条切实可行的方法.目的:构建小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的RNA干扰慢病毒载体,有效沉默小鼠血管内皮细胞的α1,3-半乳糖基转移酶基因表达,以期为有效控制异种移植超急性排斥反应提供稳定的转染细胞载体.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-07/2007-05在天津医科大学总医院普外研究所完成.材料:慢病毒载体系统(四质粒)购自Tronolab公司,包装细胞293T细胞株购自中科院上海细胞所.方法:在线软件设计小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因发卡小分子干扰RNA片段.合成的双链DNA片段并将其连接到Tele-sh003/U6.2载体的黏性末端,产生重组质粒Tele-sh003/U6.2-shRNN/α1,3-半乳糖基转移酶.对干扰质粒做测序分析.用磷酸钙法将得到的阳性重组子与慢病毒包装质粒共转化293T细胞,72 h后收集含病毒上清液,超速离心后得到重组慢病毒.用实时定量聚合酶链反应测定病毒滴度.主要观察指标:干扰质粒的测序分析,慢病毒颗粒的包装和滴度测定.结果:小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因小发卡RNA片段被成功克隆进Tele-sh003质粒中,测序结果显示干扰质粒小干扰RNA编码序列与设计片段的序列完全一致.所得慢病毒亦为阳性克隆,经定量聚合酶链反应测定病毒滴度为2×108 Tu/mL.结论:成功构建出小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的小发卡RNA慢病毒RNA干扰表达载体,为进一步控制异种移植超急性排斥反应提供了稳定的转染细胞的载体.     

BHRF1基因对丝裂霉素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡影响

目的探讨EB病毒早期基因BHRF1的表达对丝裂霉素诱发胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-BHRF1表达载体,应用脂质体转染法将BHRF1表达载体转染胃癌细胞系SGC7901,MTT法检测细胞生长情况。实验分为细胞对照组、空载体对照组和目的基因转染组,细胞对照组仅接种SGC7901细胞,空载体对照组将pcDNA3.1空载体转染入SGC7901细胞中,目的基因转染组将重组质粒pcDNA3.1-BHRF1转染入SGC7901细胞中。分别培养24、48和72 h后,用浓度为30 mg/L的丝裂霉素处理,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33258荧光染色方法检测凋亡小体。结果 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒构建成功。MTT实验显示目的基因转染能明显拮抗由于丝裂霉素作用导致的细胞生长抑制;BHRF1转染＋丝裂霉素处理组凋亡小体明显少于对照组,细胞凋亡率明显低于对照组,差异均有统计学意义（F=6 250.510,q=56.992、51.613,P〈0.01）。结论 BHRF1基因具有明显拮抗丝裂霉素诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的作用。     

生长抑素受体亚型2、5在胃癌细胞株中的表达及奥曲肽对胃癌细胞分泌VEGF的抑制作用

目的检测SGC－7901胃癌细胞株中生长抑素受体亚型2、5（SSTR－2、SSTR－5）的表达情况及其分泌血管内皮生长因子（VEGF）状况以及奥曲肽对SGC－7901胃癌细胞株分泌VEGF是否有抑制作用。方法采用免疫细胞化学及逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法,检测胃癌细胞株SGC－7901中SSTR－2、SSTR－5的表达;利用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测奥曲肽对胃癌细胞株SGC－7901分泌VEGF的抑制作用。结果SSTR－2、SSTR－5在胃癌细胞SGC－7901均呈阳性表达;SGC－7901胃癌细胞可以自分泌VEGF,呈时间依赖性;奥曲肽（10^-6mol／L－10^-5mol／L）可以抑制SGC－7901胃癌细胞合成分泌VEGF,具有时间一剂量依赖性。结论胃癌细胞株SGC－7901表达SSTR－2、SSTR－5;奥曲肽能够抑制人SGC－7901胃癌细胞中VEGF的分泌,可能是奥曲肽抗血管新生的作用机制之一。     

RNA干扰MBP-1基因对胃癌细胞SGC-7901增殖影响

目的：探讨 MBP-1（c-myc promter binding protein 1,MBP-1）基因表达沉默对胃癌细胞株 SGC-7901细胞增殖影响。方法实验分3组：空白对照组（未转染胃癌细胞）、阴性对照组（转染错义序列）和干扰组（转染 MBP-1 shRNA）。设计2条针对MBP-1基因的小干扰 RNA 片段及1条阴性对照 siRNA,并构建入 pSIREN-retroQ 质粒。将构建的重组 pSIREN-retroQ 质粒通过 Lipofectamine 2000脂质体转染胃癌 SGC-7901细胞,嘌呤霉素筛选稳转株细胞。Real time PCR 和 Western blot 分别检测MBP-1表达。MTT 法对 MBP-1干扰后 SGC-7901细胞增殖进行检测。结果通过 PCR 扩增阳性克隆及测序,说明已成功构建MBP-1干扰及对照重组 pSIREN-retroQ 质粒。通过 Lipofectamine 2000脂质体将重组质粒转染胃癌 SGC-7901细胞,并通过嘌呤霉素筛选2周,说明已成功构建 MBP-1干扰及对照 SGC-7901稳转株细胞。Real time PCR 检测,干扰组 MBP-1 mRNA 相对表达量与空白对照组相比显著下调（P ＜0.05）。Western blot 检测 MBP-1蛋白表达,干扰组 MBP-1表达量与空白对照组相比也都显著下调。MTT 法检测结果表明,MBP-1干扰组细胞在48、72、96和120 h 增殖能力比空白对照组都有显著的升高（P ＜0.05）。结论下调 MBP-1基因表达能明显促进胃癌细胞 SGC-7901的增殖,从而为胃癌基因治疗提供了新靶点。     

shRNA干扰MDR1基因逆转胃癌细胞多药耐药性的研究

目的利用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)技术沉默多药耐药基因1(multidrug resistance,MDR1),探讨其对SGC7901/L-OHP细胞株多药耐药性的逆转作用。方法采用逐步增加药物浓度法建立耐奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)的胃癌细胞株SGC7901/L-OHP,用shRNA技术沉默MDR1基因在SGC7901/L-OHP细胞中的表达,以real-time PCR检测细胞中MDR1mRNA的表达,Western blot检测细胞中P糖蛋白(P-glycopmtein,P-gp)的表达,MTT法检测转染后SGC7901/L-OHP细胞对L-OHP和5-FU的敏感性。结果shRNA沉默SGC7901/L-OHP细胞株MDR1基因后,与空白组和阴性质粒组比较,MDR1mRNA表达抑制(P0.01),且P-gp表达下调(P0.05)。干扰后的SGC7901/L-OHP细胞对L-OHP和5-FU的敏感性显著升高(P0.05)。结论shRNA可有效沉默SGC7901/L-OHP胃癌耐药细胞株MDR1基因的表达,提高耐药的胃癌细胞对化疗药的敏感性。     

c-FLIP调节TRAIL诱导胃癌细胞凋亡敏感性的研究

目的探讨凋亡抑制蛋白c-FLIP对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法采用RNAi技术干扰c-FLIP的表达,MTT法测定细胞活力、采用Hoechst 33258染色及流式细胞仪检测细胞凋亡,定量PCR和Western blot法检测c-FLIP,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(caspase-8)的表达。结果特异性的RNAi能够显著抑制c-FLIP mRNA和蛋白的表达。单独使用不同浓度TRAIL处理SGC7901细胞24 h后,发现细胞的存活率有所降低,但没有显著差异。在干扰c-FLIP表达的同时用TRAIL 100 ng/ml作用胃癌细胞SGC7901不同时间(6 h,12 h,24 h),发现作用24 h后,细胞的存活率为对照组的62.8%,显著降低(P0.05),而处理后不同时间的对照组细胞存活率无显著差异(P0.05)。凋亡实验显示在二者共同作用SGC7901细胞24 h后,能够促进细胞的凋亡。Western blot结果显示二者共同作用24 h后,c-FLIP显著降低、caspase-8及激活型caspase-8(p-18)的表达均显著升高。结论抑制c-FLIP的表达增强了TRAIL诱导胃癌细胞SGC7901的凋亡。     

胃癌耐药细胞株SGC7901/DDP的建立及其耐药机制研究

目的建立人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/DDP,并对其生物学特性及发生多药耐药的可能机制进行初步评价。方法采用逐步递增顺铂浓度持续作用法诱导获得SGC7901/DDP,采用CCK-8法检测药物敏感性,并计算半数抑制浓（IC50）和耐药指数RI,流式细胞仪分析细胞周期分布与细胞内罗丹明123积累量;采用实时荧光定量PCR检测耐药相关基因MDR-1、MRP-1、MRP-2、MRP-3、 MRP-5、ERCC1、 Survivin的mRNA表达,及凋亡相关基因Bax、Caspase-3、Bcl-2的mRNA的表达。用Western blotting法检测耐药胃癌细胞株SGC7901/DDP与其亲代药物敏感胃癌细胞株 SGC7901凋亡相关蛋白 Survivin及耐药相关蛋白P-糖蛋白的表达。结果成功建立胃癌耐药细胞株SGC7901/DDP,对顺铂的耐药指数为9.86,并对盐酸阿霉素,氟尿嘧啶交叉耐药,SGC7901/DDP细胞与亲本细胞SGC7901相比,生长缓慢,倍增时间延长,细胞周期分析发现S期细胞减少,G1、G2期细胞增多,细胞蓄积罗丹明123能力下降,MDR-1、MRP-1、MRP-2、MRP-3、MRP-5、ERCC1、Survivin、Bcl-2表达升高,细胞凋亡相关基因Bax、Caspase-3表达下降, Survivin、P-糖蛋白上升。结论耐药机制可能与MDR-1、MRP-1、MRP-2、MRP-3、MRP-5、ERCC1、Survivin、Bcl-2的表达上调和Bax、Caspase-3表达下调有关,以及Survivin与P-糖蛋白表达上调,提示多种耐药机制参与顺铂引起的胃癌细胞耐药。     

重组pEGFP-C1-Smad4表达载体的构建及在SGC7901细胞中的表达

目的：构建pEGFP-C1-Smad4表达载体,并观察其在人胃癌SGC7901细胞中的表达。方法： 应用基因重组技术,构建增强绿色荧光蛋白与Smad4的融合表达载体,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析,用基因转染技术将其转入人胃癌SGC7901细胞,荧光显微镜、Western blot检测其表达。结果： 酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入的目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确,在转染的人胃癌SGC7901细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测到Smad4在蛋白水平的表达。结论：pEGFP-C1-Smad4表达载体便于观察转染细胞中EGFP-C1-Smad4融合蛋白的表达情况,为进一步研究Smad4在胃癌发生中的作用奠定基础。     

层黏素受体靶向RNA干扰质粒载体的构建

目的 构建层黏素受体RNA干扰质粒,为探讨抑制层黏素受体过表达在胆管癌免疫逃逸中的作用奠定基础.方法 PCR法获得U6启动子序列以及产生siRNA的相应DNA模板序列,将其克隆入pGenesil-3获得RNA干扰载体pGenesil-shLNR.脂质体法将pGenesil-shLNR导入胆管癌细胞QBC939,免疫组化法检测对胆管癌细胞QBC939LNR表达的抑制情况.结果 所构建的载体pGenesil-shLNR能够干扰QBC939细胞中LNR的表达,并且具有新霉素抗性,能够用G-418筛选稳定转化的细胞株.结论 成功构建了抑制胆管癌细胞QBC939表达LNR的RNA干扰质粒载体.     

人血小板源性生长因子A基因发夹结构小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：血小板源性生长因子对诱发视网膜色素上皮细胞移行、最终导致增生性玻璃体视网膜病变起到了重要作用。构建人血小板源性生长因子A具有发夹结构小干扰RNA（shRNA）表达质粒，以观察其对人血小板源性生长因子A基因表达的沉默效果。 方法：实验于2007—04／2007—07在吉林大学第一临床医院传染科研究室完成。根据血小板源性生长因子A基因mRNA序列，设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列，克隆到空载体pGPU6／GFP／Neo中，构建重组质粒，同时设计构建分别针对人GAPDH干扰质粒作为阳性对照,不针对任何特异基因的质粒作为阴性对照。通过酶切鉴定和测序验证阳性克隆。 结果：经重组质粒筛选，重组质粒测序鉴定与设计的shRNA转录模板序列相同，均证实重组质粒构建成功。 结论：利用RNA干扰技术路线可成功构建靶向人血小板源性生长因子A的发夹结构小干扰RNA表达载体。     

靶向转酮醇酶样基因1 siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建针对转酮醇酶样基因1(TKTL1)特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体并检测其沉默效应。方法采用人U6 SnRNA启动子,分别把被9 bp序列间隔的19 bp长短的TKTL1靶序列的反向重复序列,置于pEGFP-C1-U6质粒载体中,构建成TKTL1短发夹环RNA,产生重组质粒pEGFP-C1-U6/TKTL1,分别用PstⅠ和SalⅠ酶切鉴定及测序分析,并将重组质粒转染人结肠癌细胞株LoVo,通过RT-PCR检测TKTL1基因表达水平的变化。结果酶切鉴定与DNA测序分析证明,TKTL1基因的siRNA表达载体构建正确,RT-PCR结果表明转染重组质粒的LoVo细胞TKTL1基因的表达水平明显降低。结论成功构建了针对TKTL1基因的siRNA表达载体,转染LoVo细胞后可显著抑制TKTL1基因表达。