单管双向等位基因专一性扩增方法在近交系小鼠遗传检测中的应用

目的将新近建立的单管双向等位基因专一性扩增(single-tube bi-directional allele specific amplification,SB-ASA)方法用于分析近交系小鼠基因组中的单核苷酸多态性(SNP)。方法以5个近交系小鼠为研究对象,采用SB-ASA方法对其16个SNP位点进行检测,并通过双盲实验和测序验证该方法的可靠性;且考察了该方法中PCR反应各成分及扩增条件对结果的影响。结果16个SNP位点,SB-ASA都成功地对5个品系小鼠进行了分型,与测序结果完全一致;双盲实验结果显示通过3个SNP位点即可鉴别5个品系。结论SB-ASA方法可用于近交系小鼠SNP的遗传检测,可望作为一种新的分子生物学遗传检测方法推广应用。     

4个近交系小鼠SNP位点的测定

目的将新近建立的单管双向等位基因专一性扩增（single-tube bi—directional allele specific amplification，SB—ASA）方法用于分析国内近交系小鼠基因组中的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。方法以国内4个近交系小鼠为研究对象，采用SB-ASA方法对其16个SNP位点进行检测，并通过测序进行验证。结果16个SNP位点，SB-ASA都成功地对4个品系小鼠进行了分型，与测序结果完全一致。结论SB—ASA方法可以准确地检测国内近交系小鼠SNP位点等位基因型。     

高保真酶特异性检测大鼠SNP基因型新方法

目的应用高保真酶(Pfu)和3’末端修饰引物在单管双向等位基因特异性扩增(SB-ASA)中区分SNP基因型,建立高保真酶特异性检测SNP基因型的新方法。方法选取近交系大鼠SNP位点,以RS8149053为例,设计两个外部引物和两个等位基因特异性引物,四引物3’末端进行硫代磷酸化修饰,应用高保真聚合酶(Pfu)进行特异性扩增,扩增结果测序验证其可靠性。结果在RS8149053 SNP位点(C/T)上,等位基因型CC扩增出179 bp目的片段,基因型TT扩增出597 bp目的片段,基因型不同则扩增出分子量不同的片段,目的条带测序结果与Rat Genome Database数据库基因型结果一致,高保真酶扩增结果稳定且特异性强。结论高保真酶等位基因特异性扩增技术能有效降低假阳性率,是一种快速、特异的SNP基因分型新方法。     

用PCR-PAGE切胶回收-PCR测序法制备DXS9898基因座等位基因分型标准物

目的：探索一种快速制备X染色体短串联重复序列（short tandem repeat,STR）基因座等位基因分型标准物的简便方法。方法：采用PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）切胶回收-二次PCR-测序的方法制备X-STR基因座等位基因分型标准物。结果：应用此法制备出大量的DXS9898基因座等位基因分型标准物。结论：利用PCR-PAGE切胶回收-PCR测序制备STR基因座等位基因分型标准物是一种简便易行的方法。     

单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性

目的:建立了一种单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性(SNP).方法:以TYP基因外显子1上的3个SNP位点(71G>A、425A>T和758G>A)为例,首先采用PCR预扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段;然后用限制性内切酶将其消化成短片段,在连接酶的作用下与设计的DNA适配器相连;以此连接产物为模板,在单个PCR管中加入一种适配器特异性通用引物和所有等位基因特异性引物进行PCR扩增;最后用琼脂糖凝胶电泳法分离检测PCR扩增产物,并根据扩增片段的大小判断SNP的类型.结果:采用该法成功测定了30名健康中国人的TYP基因中的3个SNP位点,与限制性片段长度多态性法(RFLP)测定结果完全一致.结论:该方法特异性高、结果准确、检测成本低,可用于同时测定多个SNP位点.     

心肌特异性表达人KCNE4转基因小鼠模型的建立

目的本研究旨在建立心肌特异性表达人KCNE4（hKcNE4）基因小鼠模型，为探索hKCNE4基因对特定类型心房颤动的防治作用奠定基础。方法通过RT—PCR克隆hKCNE4基因，使用核酸内切酶和连接酶构建hKCNE4基因心肌特异性表达载体hKCNE4α—MHC-Clone26，经过酶切鉴定、序列分析证实无误后用BamHI酶切获得转基因表达元件hKCNE4-α—MHC-hGHpA。将hKCNE4-α—MHC-hGHpA显微注入小鼠受精卵雄性原核，并将有活力的受精卵移植到代孕小鼠的输卵管。PCR鉴定出代孕鼠所生小鼠中转基因阳性原代（G0）小鼠，运用RT—PCR-测序技术对阳性G0小鼠与野生型小鼠交配所生的一代（G1）小鼠进行检测以识别出表达转基因的阳性小鼠。结果成功克隆了hKCNE4基因，正确构建了hKCNE4基因心肌特异性表达载体hKCNE4-α—MHC-Clone26。代孕鼠共生产86只仔鼠，9只转基因阳性，2只（分别称其为LineA和LineB）转基因在心脏中高表达。对LineA和LineB的阳性后代进行初步表型分析发现其生长发育良好，繁殖力正常，体表心电图无明显异常。结论成功建立心肌特异性表达hKCNFA转基因小鼠模型，为进一步研究hKCNFA基因对特定类型心房颤动的防治作用提供了一种工具。     

基于等位基因特异性引物延伸的高分辨率熔解曲线基因分型方法的建立

目的建立基于等位基因特异引物延伸的高分辨率熔解曲线法(allele-specific-extension high resolution melting curve analysis,ASE-HRM)。方法 ASE-HRM法是在普通高分辨率熔解曲线法(high resolution melting curve analysis,HRM)的PCR反应体系中加入一条等位基因特异性延伸引物(allele-specific-extension,ASE),该引物末端终止于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,匹配一种等位基因。增加热循环次数,使等位基因特异性引物得以延伸。选取rs1869458位点,用ASE-HRM法和直接测序法对194个人源基因组DNA样品进行基因分型。结果通过分析熔解曲线扩增峰,可区分杂合型和纯合型SNP;通过分析有无引物延伸峰,可区分2种纯合型;同时证明长度为11到13个碱基的ASE引物能得到较好的分型结果;使用锁定核酸(locked nucleic acid,LNA)修饰扩增引物可增加扩增产物和延伸产物的解链温度(melting temperature,Tm)差距,简化基因分型。2种方法对所选DNA样品基因分型所得结果完全吻合。结论 ASE-HRM是一种简单、廉价、闭管并能用于检测所有类型SNP的基因分型法。     

联合高分辨率MRI和micro-CT评价桃红四物汤对兔股骨头坏死的修复作用

目的 比较上海地区常用近交系小鼠单核苷酸多态性(SNP)位点分型情况.方法 采用多重PCR-LDR检测技术,选取上海地区2家单位的10个近交系小鼠,对21条染色体上的44个SNP位点进行分型检测,同时,随机选取上海地区2个近交系品系作为双盲样本,对分型方案进行验证,差异位点利用测序法进行验证.结果 同一来源的10个近交系小鼠,同品系间SNP分型结果完全一致;不同种群来源6个品系SNP分型结果提示,BALB/c,FVB,DBA/2和C3H/He在44个位点上分型结果均相同,CBA和C57BL/6分别在7个和2个位点存在差异;差异位点经测序验证结果与SNP分型方案一致.结论 上海地区常用近交系小鼠中,同一来源的品系中SNP遗传质量具有良好稳定性和一致性,不同种群来源的相同品系间SNP分型存在差异.     

瘦素与增食欲素

经典的设计巧妙的"联体共生实验",使得分子生物学家发现了世人瞩目的瘦素.引发一场研究肥胖以及相关领域的科学研究.也非常精确地解释了"联体共生实验"的结果.(1)正常小鼠体内的脂肪细胞能产生一种调节能量代谢和体重的物质--瘦素,并受瘦素的调节,使正常小鼠维护体重和能量代谢.db小鼠因第4对染色体有基因突变,产生瘦素受体缺陷,瘦素不能与受体结合而正常发挥作用,使得db小鼠体内产生大量的瘦素,血中瘦素水平明显增加,当db小鼠和正常小鼠相连,高浓度的瘦素进入正常小鼠体内,使得正常小鼠因瘦素水平增高抑制食欲,拒食出现持续的负能量平衡而饥饿而死.而db小鼠因受体缺陷,对自身的超量瘦素无反应而仍肥胖.(2)ob小鼠因第6对染色体突变,没有瘦素分泌,所以表现为肥胖,当与db小鼠相连时,db小鼠体内高浓度的瘦素进入ob小鼠体内,使得ob小鼠向正常小鼠一样饥饿而死.(3)正常小鼠体内有瘦素产生,与ob小鼠相连以后,瘦素进入ob小鼠体内,影响其体重与能量代谢,使其体重减轻.ob小鼠无瘦素产生,故对正常小鼠无影响.     

人醇脱氢酶ADH1B*2等位基因的克隆与序列分析

目的克隆人醇脱氢酶ADH1B*2等位基因,并对克隆序列进行序列分析。方法用RT-PCR法获得ADH1B基因的cDNA,然后用双酶切得到目的基因并定向克隆到pUC19载体上。经蓝白筛选后,用限制性酶谱和DNA测序以及BLAST比对分析鉴定,并用SNPBLAST比对分析和查询dbSNP数据库,分析所克隆序列的单核苷酸多态性。结果证实所克隆序列为ADH1B*2等位基因。提示ADH1B*2等位基因有2个位点存在单核苷酸多态性。结论成功克隆了ADH1B*2等位基因,并进行了SNP分析。     

日本血吸虫(大陆株)26ku谷胱甘肽转移酶基因真核表达载体构建及序列分析

目的　构建日本血吸虫大陆株 2 6ku谷胱甘肽转移酶 (GST)基因真核表达质粒 pBK SjGST并进行序列分析 ,为进一步进行重组蛋白的表达及保护性免疫研究提供条件。方法　根据日本血吸虫菲律宾株 2 6kuGST核苷酸序列 ,设计合成一对引物 ,以日本血吸虫中国大陆株成虫总RNA为模板 ,通过RT PCR合成日本血吸虫中国大陆株 2 6kuGSTcDNA片段。将其克隆入 pGEM T载体 ,经双酶切及PCR鉴定后 ,再亚克隆入 pBK CMV真核表达质粒 ,构建重组质粒pBK SjGST ,转化到大肠杆菌BL2 1感受态细胞 ,提取重组质粒双酶切鉴定并进行序列分析。结果　PCR、pGEM T SjGST及 pBK SjGST分别经双酶切获得一特异性基因片段 .经测序分析该片段具有一个 670bp的全基因序列 ,而其开放阅读框 (openreadingframe,ORF)为 65 7bp ,编码 2 18个氨基酸 ,并对其基因序列及编码的蛋白质进行了分析。结论　成功地构建了日本血吸虫中国大陆株 2 6kuGST基因真核表达重组质粒 ,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列蛋白激酶磷酸化位点进行分析     

邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯胚胎期暴露对子代大鼠发育的影响

目的通过大鼠孕期邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）暴露,评价DEHP对子代大鼠发育的影响,初步探讨DEHP的发育神经毒性机制。方法成熟雌性Wistar大鼠从妊娠日起用10mg/（kg.d）、100mg/（kg.d）、500mg/（kg.d）及1000mg/（kg.d）DEHP连续灌胃染毒至孕19天。动态观察孕鼠一般自然情况及生产率、仔鼠的体重变化及仔鼠的行为畸胎学指标。结果1000mg/（kg.d）DEHP剂量组孕鼠食欲降低,体重增长受限,而其他各组孕鼠一般自然情况良好;与对照组相比,DEHP不同剂量组生产率受到一定影响,1000mg/（kg.d）DEHP剂量组孕鼠生产率为0,出现吸收胎的现象;10mg/（kg.d）、100mg/（kg.d）、500 mg/（kg.d）各剂量组仔鼠第1天、4天、7天、14天体重比对照组有降低趋势;第21天500 mg/（kg.d）DEHP组的仔鼠体重增长受限,差别具有显著性;仔鼠开眼时间、平面翻正、断崖回避、触须定位、听觉惊愕反射实验各剂量组仔鼠的达标时间均有稍落后于对照组的趋势;负趋地性反射实验显示500 mg/（kg.d）DEHP组与对照组相比,达标时间延迟,空中翻正实验100mg/（kg.d）、500 mg/（kg.d）组与对照组相比,达标时间延迟,差别具有显著性。结论2-乙基DEHP胚胎期暴露影响子代大鼠的发育,存在着一定的剂量反应关系。     

Sox9、siRNA表达载体的构建与鉴定

目的构建Sox9 siRNA表达载体，分析Sox9在软骨肉瘤中的作用机制。方法根据Kou Ⅰ，IkegawaS提椟的Sox9 mRNA序列，设计并合成两端含有酶切位点的64个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接到线性化的pSilencer质粒中，并对重组质粒（命名为pSilencer／Sox9 siRNA）进行酶切及测序鉴定。结果双酶切证实Sox9 siRNA表达载体克隆构建成功，插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致。结论成功构建Sox9 siRNA表达载体。     

CD14基因多态性与变应性哮喘患儿的关系

目的 探讨CD14基因启动子区-159位基因多态性与变应性哮喘易感性的关系，以及对血清总IgE水平的作用。方法 采用聚合酶链反应．限制性片段长度多态性技术检测CD14基因启动子区-159位C／T基因多态性，共检测143例变应性哮喘患儿(患儿组)和72例正常儿童(对照组)。结果 患儿组CD14—159位C／C、C/T和T／T基因型频率分别是0．189、0．469和0．343，与对照组的0．139、0．583和0．278的差异无显著性，两组3种基因型间血清IgE水平差异亦无显著性。结论 CD14基因启动子区-159位C／T基因多态性与变应性哮喘发病无关，与血清IgE水平亦不相关。     

人端粒酶催化亚单位基因单核苷酸多态性与胃癌的关系

目的 探讨人端粒酶催化亚单位基因(human telomerase catalytic subunit,hTERT)Ex2-659A/G位点单核苷酸多态性与胃癌患者发病风险的关系.方法 对甘肃西部三家医院外科手术切除168例胃癌患者(病例组)和同期在上述医院查体的健康人群156例(对照组)进行病例对照研究;采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)对2组进行基因型分析,比较各基因型分布频率和发病风险的关系.结果 病例组hTERT Ex2-659A/G位点从、AG、GG基因型的频率与对照组相比无显著差异.病例组A、G等位基因频率分别为44.74%和55.26%,对照组为43.42%和56.58%,2组A、G等位基因型频率比较有显著性差异(x2=5.373 4,P=0.020 4).与G/G基因型相比,A/G和A/A 2种基因型的个体患胃癌的危险度(OR)分别为0.519 (95% CI:0.310～0.870,P=0.013)、0.550(95% CI:0.255～1.188,P=0.128).结论 hTERT Ex2-659A/G单核苷酸多态性可能为胃癌的保护因素.     

生前酒精摄入大鼠生后早期尾壳核神经元面积定量图像分析

为探讨酒精对大鼠尾壳核神经元发育的影响 ,以 32只SD乳鼠为材料 (酒精组和对照组各 16只 ) ,对生后早期 (1、7、15、2 6d )的大鼠尾壳核神经元的平均面积 (CPuA)进行了定量图像分析研究。结果表明 :①酒精和对照两组动物的CPuA在第 1～ 15d期间均随日龄增长而增大 ,第 15d以后则无显著性变化 ;②酒精生前摄入对神经元由小变大的发育过程有延缓作用 ,此影响在第 1d可以看出 ,第 7d仍未消失 ,而在第 7～ 15d期间存在一个代偿性发育过程。     

xylE转基因小鼠的繁育及其纯合子的筛选

目的 进行转基因小鼠的繁育与纯合子转基因小鼠的筛选。方法 选用致突变xylE转基因原代小鼠31号和9号进行传代，自F2起采用全同胞交配繁育至F3。结果 转基因能遗传且各世代转基因小鼠表型无异常，亦未见近交衰退现象。经不同世代载体回收和转化检验表明，靶基因功能未因世代传递而改变，并从3l号系的F3中筛选出一只纯合雄鼠，经与非转基因雌鼠交配所产4窝28只小鼠，PCR—southern检测均呈阳性，证实为～纯合子。结论 xylE转基因能遗传，4个世代内便筛选出纯合子小鼠，极大地缩短了育种周期。     

CLONING OF APOPROTEIN AI GENE AND OBSERVATIN ON DNA POLYMORPHISM OF APOPROTEIN AI/CII GENE-LOCIIN GENOMIC LIBRARY FROM A LIVER OF CHINESE

For the research on the structure and function of the HDL apoproteins, we have successfully constructed a complete genomic library, in self-prepared EMBL3 lambda vector and the packaging extracts of lysogenic strains BHB2688, BHB2690, from a Chinese fetal liver, which will be widely used in the research on the structure and function of apoproteins. In this study, a DNA sequence polymorphism, revealed by digestion of human DNA with the restriction endonuclease Sst1 and hybridization with an apoprotein AI cDNA probe, has been shown to be located at apoAI/CIII gene-loci. Three gene related fragments (5.7 Kb, 4.0 Kb and 3.0 Kb) were detected. The 5.7 Kb fragment is common and the polymorphism is demonstrated by the presence of either a 4.0 Kb fragment (S1 allele) or the 3.0 Kb fragment (S2 allele). Individuals were genotyped S1S1 or S1S2. Our result showed that the frequency of genotype S1S2 was higher in hypertriglyceridemic subjects than that in normolipidemic subjects.