EGCG对H2O2诱导的螺旋神经节细胞MnSOD基因表达的影响

目的：探讨表没食子儿茶素没食子酸盐（EGCG）在双氧水（H2O2）诱导耳蜗螺旋神经节细胞（SGCs）氧化损伤中对线粒体抗氧化酶基因-MnSOD基因表达的影响。方法：培养离体SGCs,采用半定量RT-PCR方法检测加入不同浓度H2O2和/或EGCG后螺旋神经元MnSOD基因的表达情况。以经典抗氧化剂维生素C作对照。结果：随着H2O2浓度提高,MnSOD基因的表达亦随之升高;在H2O2浓度大于100 μmol/L时MnSOD基因表达明显上调(P<0.05),100 μg/ml EGCG能明显抑制H2O2诱导的MnSOD基因表达(P<0.05)。 结论：EGCG可能通过清除氧自由基,提高MnSOD酶活性,抑制H2O2诱导的螺旋神经节细胞MnSOD基因表达。     

APE/Ref-1基因重组腺病毒的构建表达和鉴定

目的 构建表达氧化还原因子-1（APE／Ref-1）基因的复制缺陷型重组腺病毒，为进一步研究APE／Ref-1在耳蜗螺旋神经节氧化损伤病理过程中的作用机制提供实验基础。方法 应用RT-PCR技术从大鼠脑组织总RNA克隆出APE／Ref-1基因，将APE／Ref-1基因定向克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上，经与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183内同源重组后，转染293细胞进行包装，并反复感染293细胞进行扩增。对其进行安全性、滴度以及活性等检测。采用Western blot对APE／Ref-1蛋白表达进行检测和鉴定。结果 克隆出大鼠APE／Ref-1基因，经测序证实结果正确：得到高滴度的重组腺病毒，提取病毒DNA证实含目的基因。结论 成功构建了表达APE／Ref-1的复制缺陷型重组腺病毒。为进一步研究APE／Ref-1在耳蜗螺旋神经节的氧化损伤过程中作用机制奠定了实验基础。     

大肠癌Ref-1/APE的表达特点及其意义

目的探讨大肠癌氧化还原因子-1(redox factor-1,Ref-1),又称脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrimidinic endonuclease,APE),在大肠癌的表达特点及其与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管密度的关系.方法应用免疫组化S-P法检测110例大肠癌和40例非癌区大肠组织中Ref-1/APE和VEGF的表达,采用血管内皮特异标记物CD31标记并计数肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD),最后分析Ref-1/APE与VEGF和MVD的关系.结果所有大肠癌和非癌区大肠组织都有Ref-1/APE表达,但是其在细胞内的定位有所不同.40例非癌区大肠组织细胞核都有Ref-1/APE表达,仅5例有胞质表达(5/40,12.5%);而110例大肠癌中有79例(79/110,71.81%)细胞质有Ref-1/APE表达,比例显著高于非癌区大肠组织(P＜0.01).而且细胞质Ref-1/APE阳性表达的大肠癌较无细胞质表达者VEGF阳性率显著增加(P＜0.05),MVD也显著增高(P＜0.05).结论大肠癌Ref-1/APE移位于细胞质的异常表达可能涉及大肠癌的发生,并且可能与VEGF表达和肿瘤血管生成有关.     

Apg-2对H_2O_2诱导的BaF3-P210细胞损伤的影响

目的 探讨Apg-2对H2O2诱导的Bcr/Abl阳性BaF3-P210细胞损伤的影响.方法 以H2O2诱导的pMIGR1 空载体感染细胞BaF3-MIGR1和稳定表达Bcr/Abl的BaF3-P210细胞为损伤模型,Western blot和RT-PCR检测H2O2损伤后2组细胞Apg-2表达;建立过表达Apg-2的BaF3-MIGR1细胞(BaF3-MIGR1-Apg2)和BaF3-P210细胞(BaF3-P210-Apg2)H2O2诱导的损伤模型,Western blot检测磷酸化组蛋白(γ-H2AX)的表达,免疫荧光法检测γ-H2AX焦点数.结果 H2O2作用后的BaF3-MIGR1和BaF3-P210细胞的Apg-2蛋白和mRNA水平表达均升高(P<0.05).H2O2作用BaF3-MIGR1和BaF3-MIGR1-Apg2细胞后其γ-H2AX蛋白表达升高,γ-H2AX焦点数亦增加;BaF3-P210和BaF3-P210-Apg2细胞H2O2损伤后γ-H2AX蛋白表达和焦点数均无明显变化.结论 Apg-2可减少H2O2诱导的BaF3-P210细胞γ-H2AX表达,从而可能降低其细胞损伤.     

APE/Ref-1与妇科肿瘤的研究

无嘌呤无嘧啶核酸内切酶(APE)又名氧化还原因子1(Ref-1),是一种多功能蛋白,除了修复AP位点外,还保持很多转录因子的活性还原状态,对维持DNA的稳定和调节细胞因子的表达具有重要作用。目前国内外研究发现APE/Ref-1蛋白在细胞中的表达部位与妇科肿瘤的发生、发展及预后有关,而APE/Ref-1蛋白表达水平的改变与妇科肿瘤放疗的敏感性有关。     

APE1/Ref-1表达在小鼠放射性肺损伤形成中的变化特点

目的 观察小鼠放射性肺损伤过程中DNA损伤修复关键酶脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子(apurinic/aprimidinic endonuclease/redox factor-1,APE1/Ref-1)表达的动态变化,初步探讨APE1/Ref-1在放射性肺损伤发生、发展中的作用.方法 雌性昆明小鼠30只,随机分为照射组18只和对照组12只.照射组用8MV直线加速器给予小鼠全胸20Gy单次照射,对照组佯装照射.在照射后1、3、7、14、28、56d共6个时相点,分批活杀小鼠(照射组3只,对照组2只),观察其全肺大体形态改变,取右肺组织,光镜下观察组织形态学变化,免疫组化SP法检测APE1/Ref-1;取左肺组织,Western blot方法检测APE1/Ref-1蛋白表达.结果 正常小鼠肺组织上皮细胞和内皮细胞中APE1/Ref-1呈胞核表达为主,而在小鼠放射性肺损伤不同阶段肺组织上皮细胞和内皮细胞中APE1/Ref-1表达特征有所改变,呈核浆共同表达和胞浆表达为主;并且APE1/Ref-1表达呈现先增高后降低的趋势,照射后1d开始升高,3d达高峰,且明显高于对照组,此后随着小鼠放射性肺损伤发展逐渐降低,28d降至对照组水平,56d明显低于对照组.结论 电离辐射可以刺激APE1/Ref-1蛋白的表达并使其表达发生由核内转向浆内和先增高后降低的特征改变,表明APE1/Ref-1可能在放射性肺损伤修复过程中起着重要作用.     

芍药苷对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞PCNA及Caspase-3表达的影响

目的探讨芍药苷对过氧化氢(H2O2)诱导SH-SY5Y氧化损伤的保护作用及其可能机制。方法MTT法测定细胞存活率,细胞免疫化学技术检测细胞细胞核增殖抗原(PCNA)、Caspase-3的表达。结果 0.87mmol/L H2O2可使细胞存活率降低,PCNA的表达减少,Caspase-3的表达增加。经过39μg/mL和62.5μg/mL浓度的芍药苷处理后,H2O2诱导的SH-SY5Y细胞存活率明显升高,PCNA的表达明显增加,同时抑制Caspase-3的表达。结论芍药苷可抑制过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,其作用机制可能与其增加细胞PCNA的表达,减少Caspase-3的表达有关。     

人APE1/Ref-1基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建含人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段的真核表达质粒pcDNA3.1 APE1,以期进一步研究该基因对细胞DNA损伤的保护作用.方法 采用RT-PCR法定向克隆人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段,构建pGM-T Easy/APE1质粒,测序鉴定APE1/Ref-1基因cDNA序列正确后,将目的片断亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1 上,构成pcDNA3.1 APE1表达质粒,并用Western blotting法检测转染人脐静脉内皮细胞APE1/Ref-1蛋白的表达水平.结果 经酶切及测序证实APE1/Ref-1基因真核表达质粒pcDNA3.1 APE1构建成功,Western blotting法检测到转染pcDNA3.1 APE1后,细胞内APE1/Ref-1蛋白表达明显增加.结论 成功构建含人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段的真核表达质粒,为探讨APE1/Ref-1对细胞电离辐射损伤的保护作用奠定了基础.     

HSPA1L在H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤中的作用

目的 研究HSPA1L蛋白在H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤中的作用.方法 将SH-SY5Y细胞用不同浓度的H2O2(1 200、800、600、400、200、100、50、0μmol/L)处理24 h,倒置显微镜观察SH-SY5Y细胞形态学的变化,MTF法检测SH-SY5Y细胞存活率,Western-blot检测SH-SY5Y细胞HSPA1L蛋白表达水平的变化.结果 与0 μmol/L组比较,不同浓度H2O2处理后,细胞形态发生了剂量依赖性损伤;SH-SY5Y细胞的存活率随H2O2浓度升高,呈现剂量依赖性降低;HSPA1L蛋白的表达水平随H2O2浓度升高,呈现剂量依赖性升高.结论 HSPA1L在H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型中,呈现剂量依赖性升高,这可能是细胞应对氧化应激损伤的一种补偿机制.     

Bcl2抑制NNK诱导的DNA损伤后修复的分子机制研究

目的 为了探索Bcl2抑制NNK诱导的DNA损伤后修复的分子机制.方法 Western Blotting检测Bcl2、APE1和XRCC1蛋白的表达情况,定量检测AP位点来观察DNA损伤程度,免疫沉淀检测Bcl2蛋白和APE1蛋白,APE1蛋白和XRCC1蛋白相互作用,免疫荧光染色检测Bcl2蛋白的细胞分布情况及其变化,亚细胞结构分离提取蛋白观察Bcl2蛋白在细胞核及线粒体中表达水平及其变化.同位素测定APE1核酸内切酶活性观察Bcl2对APE1核酸内切酶活性的影响及其Bcl2的BH结合域的关系.结果 Bcl2下调APE1核酸内切酶活性与抑制AP住点修复有关.4-(N-甲基-N-亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-丁酮(NNK)与细胞接触导致Bcl2在细胞核中积聚,并且与APE1相互作用,这种相互作用需要Bcl2的所有BH结合域参与.Bcl2的BH结合域的任一缺失导致Bcl2与APE1相互作用的能力和对APE1活性、AP位点修复的抑制作用消失.Bcl2在细胞中的过度表达减少了APE1/XRCC1修复复合物的形成,并且Bcl2纯蛋白在体外直接使APE1/XRCC1复合物分裂从而抑制APE1核酸内切酶活性.结论 Bcl2蛋白下调APE1核酸内切酶活性抑制NNK诱导的DNA损伤后AP位点的修复.     

乳腺癌HER-2基因显色原位杂交与免疫组织化学检测对比研究

目的：对乳腺癌HER-2/neu/c-erbB-2（HER-2）显色原位杂交（chromogenicin situhybridization,CISH）检测和免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）表达两者之间进行对比研究。方法：选择乳腺癌的组织蜡块44例,经HER-2 IHC蛋白表达;阴性9例,（＋）9例,（艹）13例,（）13例。从中选取经HER-2 IHC表达阳性的乳腺癌22例[包括HER-2 IHC表达（＋）9例和HER-2 IHC表达（）13例]作回顾性CISH基因检测。结果：HER-2 IHC表达（＋）9例一组,经CISH基因检测9例均无基因扩增;HER-2 IHC表达（）13例一组,CISH无基因扩增2例（15.38%）,基因检测不理想1例（7.76%）,基因扩增10例,两种检测方法符合率76.92%,两者有高度一致性（P=0.001）。HER-2 IHC表达（）和CISH基因检测扩增与乳腺癌类型间有一定相关性（P〈0.05）。结论：CISH基因检测与IHC表达（）组,两者具有很高的一致性。IHC可作为乳腺癌HER-2筛选的首选方法,对于HER-2 IHC表达（ 卅）病例,经CISH基因检测,两者符合率高,CISH基因检测较IHC更准确,证实HER-2／neu扩增的患者可从采用抗HER-2单克隆抗体治疗中获益。     

ERK1/2信号通路介导丙泊酚对 H2O2诱发的心肌细胞损伤保护作用

目的：研究丙泊酚对 H2 O2诱发的心肌细胞损伤的保护作用及其作用机制。方法采用胰酶消化法获取大鼠胎鼠心肌细胞,以 H2 O2损伤心肌细胞获得心肌缺血再灌注损伤实验模型;加入不同浓度丙泊酚（12.5、25、50μmol·L -1）,MTT 法检测细胞存活率;用硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法分别测定各组细胞培养液中丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性;流式细胞术检测细胞凋亡水平;Western blotting 检测细胞中 ERK1/2、Bcl -2及 Bax 的表达。结果丙泊酚（12.5、25、50μmol·L -1）能抑制由 H2 O2导致的细胞死亡（P 〈0.01）;减少MDA 的产生（P 〈0.01）,提高 SOD 活性（P 〈0.01）;25、50μmol·L -1丙泊酚能抑制由 H2 O2导致的细胞凋亡（P 〈0.05）;25μmol·L -1丙泊酚作用于细胞后能激活 ERK1/2磷酸化,增加 Bcl -2且减少 Bax 的表达。结论丙泊酚通过激活 ERK1/2磷酸化对 H2 O2诱发的心肌细胞损伤起到保护作用。     

erbB1／HER1和erbB2／HER2在肺癌的表达

目的 检测第一和第二人体表皮生长因子受体（human epidermal-growth-factor erceptor 1 and 2,HER1,and HER2）在肺癌组织中的表达,探讨HER1、HER2过度表达与肺癌临床病理的关系。方法 用免疫组化法检测有随访资料的70例肺部（43例鳞癌和27例腺癌）组织中HER1、HER2的表达。结果 肺癌中HER1、HER2、HER1＋2的过度表达率分别为65．7％、41．4％和30．0％。肺癌中HER1、HER2、HERE1＋2的过度表达与肺癌淋巴结转移、TNM分期、患者术后生存率相关。结论 erbB1、erbB2阳是晚期肺部生长的调控基因,干预HER1、HER2、HER1＋2的过度表达可能是治疗晚期肺癌的有效方法。     

5-氨基乙酰丙酸光动力杀伤人鼻咽癌耐药/非耐药细胞株的实验研究

目的 观察5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)光动力学效应对体外培养人鼻咽癌细胞株CNE2及其顺铂耐药株CNE2/DDP的生物作用,探讨光动力治疗多药耐药鼻咽癌的可行性.方法 对CNE2与CNE2/DDP分别加入不同浓度的5-ALA (0.01、0.05、0.10、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L)孵育4 h,予波长为630 nm的半导体激光进行照射,能量密度分别为2、5、10、20 J/cm2,继续孵育24 h,用四唑盐比色法测定细胞存活率;两株细胞与2.0 mmol/L浓度的 5-ALA溶液共孵育4 h后,用流式细胞仪检测细胞内生性光敏剂原卟啉Ⅸ的荧光强度.结果 5-ALA光动力对体外培养的CNE2和CNE2/DDP细胞均有杀伤作用,表现为对5-ALA浓度、激光剂量的量-效依赖关系.激光能量为20 J/cm2时,5-ALA对CNE2和CNE2/DDP细胞的半数杀伤浓度分别为0.07 mmol/L与0.375 mmol/L,二者比较差异显著(P＜0.01);不同5-ALA浓度、不同激光剂量条件下CNE2细胞存活率显著低于CNE2/ DDP (P＜0.05);CNE2和CNE2/DDP的细胞内荧光强度分别为(197.33±1.45)、(106.36±2.31),相差非常显著(P＜0.01).结论 5-ALA-PDT对CNE2和CNE2 /DDP均有杀伤作用,但CNE2/DDP对其敏感性低于CNE2,表明CNE2/DDP对5-ALA-PDT存在一定程度的交叉抗性,增加5-ALA浓度和/或增大激光剂量可以在一定程度上克服这种抵抗.     

二氢睾酮和其受体对雄性大鼠血小板激活、TXA2／PGI2平衡与细胞内钙离子浓度的调节

目的研究生理剂量二氢睾酮（dmydrotestosferone，DHT）和其受体对雄性大鼠血小板激活、TXA2／PGI2平衡与细胞内钙离子浓度的调节。方法血浆睾酮（testosterone，T）应用Advia Centaur免疫检测系统测定（Bayer，Ger-many），血浆DHT应用酶联免疫试剂盒（ELISA kit）推荐方法检测。应用血小板聚集仪测定血小板聚集、血小板黏附仪测定血小板黏附。应用放免法测定TXB2和6-Keto—PGF1α。应用流式细胞仪测定血小板内钙离子浓度。结果去势雄性大鼠每日补充DHT（0．25mg／rat）使其DHT浓度达到生理水平，而且与氟他胺（flutamide）（每两日注射1次5mg／rat）联用不影响DHT浓度达到生理水平。DHT（2nM）显著抑制二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）诱导的血小板的聚集、黏附。氟他胺预处理血小板之后，ADP诱导的血小板的聚集、黏附再次增加。去势雄性大鼠每日补充DHT（0．25mg／rat）降低TXB2和6-keto-PGF1α。的比例，然而两日补充一次氟他胺（5mg／rat）再次增加TXB2和6-keto-PGF1α。的比例。DHT（2nM）明显降低ADP诱导的血小板内钙离子浓度。然而，氟他胺预处理血小板之后ADP诱导的血小板内钙离子浓度再次增加。结论生理水平二氢睾酮介导其受体调节雄性大鼠ADP诱导的血小板聚集、黏附与其调节TXA2／PGI2平衡和血小板内钙离子浓度有关。     

二甲双胍通过COX-2/PGE2/STAT3途径抑制结直肠癌的机制研究

目的 探讨二甲双胍对结直肠癌的抑制作用及相关机制。方法 在体外培养小鼠结肠癌细胞系MC38和人结肠癌细胞系SW480，同时在体内使用氧化偶氮甲烷（AOM）与葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结直肠癌小鼠模型，使用二甲双胍进行干预，通过CCK-8、细胞凋亡试验、Western blotting、苏木精-伊红（HE）染色、免疫组织化学检测、酶联免疫吸附试验（ELISA）、粪便16S rDNA测序来分析二甲双胍是否可抑制结直肠癌的发生、发展，并阐明其机制。结果 不同浓度的二甲双胍分别处理MC38细胞和SW480细胞24 h可在镜下看到，随着二甲双胍浓度的增加，肿瘤细胞数量明显减少。CCK-8法检测结果表明，随着二甲双胍浓度的增加，两种结直肠癌细胞细胞活性率受到抑制。两种结直肠癌细胞加入0、20 mmol/L二甲双胍的细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（P <0.05）。Western blotting结果可见，二甲双胍干预可抑制COX-2蛋白的表达，且随着浓度的增加，COX-2蛋白表达呈药物剂量依赖性减低。两种结直肠癌细胞添加不同浓度二甲双胍后PGE2蛋白水平比较，差异有统计学意义（P <...     

稀土复合固体超强酸SO4^2-／ZrO2-CeO2催化合成冰片

目的：研究一种合成冰片的新方法。方法：在纳米稀土复合固体超强酸SO4^2-／ZrO2-CeO2催化下,通过α-蒎烯与无水草酸酯化-皂化法合成冰片。结果：酯化反应能顺利进行生成草酸冰片酯,草酸冰片酯并口NaOH发生皂化反应后得到冰片。当酯化反应的温度为80℃,反应时间为6h,催化剂的用量为α-蒎烯质量的6％时,冰片的产率为68．7％,产品中正、异冰片含量比约为5：1。结论：该合成方法具有反应条件温和,污染小,产率高,产品质量好等优点。     

顺铂持续压力下HepG2存活细胞中P53、C-myc、Bax、Bcl-2的变化及意义

目的动态观察HepG2细胞在顺铂压力下存活细胞中P53、C-myc、Bax、Bcl-2等的变化,进一步探讨HepG2顺铂耐药的机制.方法采用免疫组化法和RT-PCR法测定在顺铂压力下存活HepG2细胞内凋亡和抗凋亡因子P53、C-myc、Bax、Bcl-2、NF-κB的变化.结果在顺铂压力下存活HepG2细胞P53、C-myc等凋亡相关因子无明显变化.Bcl-2持续升高,Bax逐渐下降,Bcl-2/Bax的比率值呈进行性升高.NF-κB mRNA在7 d后出现明显阳性.结论在顺铂持续压力下HepG2细胞的存活机制与Bcl-2持续升高、Bax逐渐下降有关,NF-κB mRNA的阳性表达可能与细胞存活的后续事件有关.     

用Fura-2双波长荧光法测定低剂量电离辐射对小鼠脾细胞游离钙的影响

目的：探讨低剂量电离辐射免疫增强效应的机理。方法：采用Ｆｕｒａ－２／ＡＭ 双波长荧光测定法研究了低剂量电离辐射全身照射后小鼠脾Ｔ淋巴细胞内游离钙离子浓度（〔Ｃａ２＋ 〕ｉ）对次佳浓度Ｃｏｎ Ａ（５ ｍ ｇ／Ｌ）反应性的变化。结果：静息状态下的小鼠脾淋巴细胞内游离钙离子浓度为９５．０±１４．０ ｎｍ ｏｌ／Ｌ,ＣｏｎＡ 可使小鼠脾Ｔ淋巴细胞内游离钙离子浓度增加６９．４±７．６ ｎｍ ｏｌ／Ｌ,上升至峰值时间为７９．２ ｓ。７５、１００ 和２００ ｍ Ｇｙ 全身照射后２４ ｈ,Ｃｏｎ Ａ 诱导的小鼠脾Ｔ淋巴细胞内游离钙离子动员明显高于假照射组（Ｐ＜ ０．０１）。结论：低剂量电离辐射的免疫兴奋效应与其增强淋巴细胞内〔Ｃａ２＋ 〕ｉ动员等信息传递过程有关