去泛素化酶YOD1调控肝脏脂代谢的初步研究

目的：探索去泛素化酶YOD1在肝脏营养代谢中发挥的作用。方法：通过Q?PCR检测高脂饮食C57BL/6小鼠、db/db小鼠肝脏中以及油酸（oleic acid,OA）处理后的Hepa1?6细胞内,YOD1的表达情况。在C57BL/6小鼠中,通过Q?PCR法检测YOD1的组织分布及不同营养状态下的表达情况。对Hepa1?6细胞中给予OA处理,通过甘油三酯试剂盒检测细胞内甘油三脂含量,并利用油红染色观察细胞内脂滴。经Q?PCR和蛋白免疫印迹法检测细胞内相关基因的mRNA及蛋白水平。结果：短期高脂饮食后,肝脏中YOD1的mRNA水平显著下降。而与对照组db/+小鼠相比,db/db小鼠肝脏中YOD1的mRNA水平无变化。但是,经OA处理后,Hepa1?6细胞内的YOD1的mRNA水平明显减少。另外,YOD1主要表达于肝脏中。小鼠禁食后,肝脏YOD1的mRNA水平显著增加,而再喂食后显著下降。此外,过表达YOD1的Hepa1?6细胞中OA诱导的脂质堆积明显减少,且SREBP?1c的剪切被抑制。结论：本研究初步发现,去泛素化酶YOD1的表达水平受营养状态调控,并通过抑制SREBP?1c的剪切影响肝细胞的脂代谢。     

小鼠肝癌细胞外泌体对树突状细胞成熟与功能的影响

目的 探讨小鼠肝癌细胞(Hepa1-6)来源的外泌体对树突状细胞成熟和功能的影响.方法 提取小鼠Hepa1-6细胞的外泌体,用透射电镜来鉴定外泌体的外形,Western blot方法测定外泌体的标志蛋白CD63和TSG101的表达,使用小鼠Hepa 1-6细胞外泌体冲击树突状细胞(DCs),DCs成熟相关表面分子CD40、CD80、CD83、CD86、MHC-Ⅱ的表达使用流式细胞术检测;将小鼠T淋巴细胞和小鼠Hepa1-6细胞外泌体致敏的DCs一起孵育5d,使用CFSE染色标记和流式法来测定共孵育T细胞的分裂增殖情况.结果 透射电镜可以观察到从Hepa1-6细胞的上清液中收集到的外泌体,表现为圆形或类圆形膜性囊泡样结构,符合外泌体的典型特征;Western blot检测表明小鼠Hepa1-6细胞来源的外泌体表达CD63、TSG101标志性蛋白,不表达细胞色素C;从小鼠Hepa1-6细胞提取来的外泌体致敏DCs,可上调表面MHC-Ⅱ类分子、成熟标志分子CD83和共刺激分子CD40、CD80、CD86(P ＜0.05).且随着外泌体浓度的增加,DC表面分子表达增高;同时可促进T淋巴细胞的增殖(P＜0.05).结论 小鼠Hepa 1-6细胞提取的外泌体可促进DC2.4的朝向成熟表型分化,并促进T细胞的增殖.     

MR对小鼠原代棕色脂肪细胞功能的影响

目的:使用小鼠原代棕色脂肪细胞,研究盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor,MR)对其功能的影响?方法:使用MR激动剂醛固酮?MR拮抗剂螺内酯?糖皮质激素可的松分别作用于小鼠原代棕色脂肪细胞,观察棕色脂肪细胞相关基因的改变?结果:MR的配体(盐皮质激素)可显著增加其功能基因非偶联蛋白1(uncoupling protein-1,UCP1)?细胞死亡诱导DNA碎片因子-α-样效应结合区域蛋白(the cell death-inducing DNA fragmentation factor-α-like effector domain-containing protein,CIDEA)?过氧化酶增殖活化受体α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha,PGC1α)的表达,同时也促进分化基因脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)的表达,相反MR的拮抗剂可抑制棕色脂肪细胞功能基因的表达?另一方面, 盐皮质激素还可以协同糖皮质激素共同调节棕色脂肪细胞功能基因UCP1的变化?结论:MR是调控原代棕色脂肪细胞功能的重要因子?     

ATG5 介导肝癌细胞对抗营养危机的作用研究

目的 探索在小鼠肿瘤细胞中对抗营养缺乏的分子途径。方法 构建ATG 5 基因表达的质粒并瞬 时转染至细胞内;用不同靶基因的si-RNAs 转染到细胞来沉默基因的表达;不同条件下提取小鼠正常肝细胞 AML-12 和肝癌细胞Hepa1-6 的RNA 和蛋白;用qRT-PCR 检测基因的表达;用Western blot 检测蛋白的表达; 用流式细胞仪检测细胞周期;用CCK-8 的试剂测定细胞活性。结果 与小鼠正常肝细胞AML-12 比较,肝癌 细胞Hepa1-6 对缺血引发的细胞死亡有抵抗性。缺血使Hepa1-6 细胞内诱导自噬相关蛋白ATG5 表达升高 （P <0.05）;沉默内源ATG 5 基因后Hepa1-6 细胞对缺血的敏感性升高,且ATG5 诱导细胞周期抑制蛋白p21（cip1/ waf1）表达增加使细胞滞留在G1 期。结论 在营养缺乏的环境中,Hepa1-6 细胞内ATG5 表达升高,且ATG5 增加p21（cip1/waf1）的表达量使细胞滞留在G1 期,可能与对抗缺血引起的死亡有关。     

姜黄素诱导小鼠皮下前脂肪细胞棕色化的作用及机制

目的：本研究探究了姜黄素促进白色脂肪细胞棕色化的作用及其潜在机制。方法：抽提小鼠皮下原代脂肪细胞,并诱导其分化成熟。予姜黄素（10、20、40 μmol/L）孵育48 h,油红O染色观察脂肪细胞脂滴形态;使用线粒体绿色荧光探针（Mito Tracker Green）检测白色脂肪细胞内线粒体数量;运用线粒体超氧化物红色荧光探针（Mito SOX Red）测定细胞线粒体内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平;应用ATP试剂盒检测细胞内ATP含量;Real?time PCR检测棕色化相关标志性基因的表达水平;最后利用β3肾上腺素能受体（β3 adrenergic receptor,β3?AR）拮抗剂（SR59230A）进行阻断实验。结果：姜黄素能够减小脂肪细胞脂滴大小,增加脂肪细胞线粒体数量（P < 0.001）。同时,低剂量姜黄素（10、20 μmol/L）可减少线粒体ROS产生（P < 0.01）,提高细胞内ATP含量（P < 0.05）。姜黄素干预能上调棕色脂肪标志性基因［β3?AR基因、PPARγ共激活因子?1α（PPARγ coactivator?1α,PGC1α）、解偶联蛋白1（uncoupling protein 1,Ucp1）］的mRNA表达水平（P < 0.05）。而阻断β3?AR则能抑制姜黄素促进白色脂肪细胞棕色化的作用。结论：姜黄素通过β3?AR促进白色脂肪细胞线粒体生物合成并改善其功能,诱导白色脂肪细胞棕色化。     

HepG2细胞胰岛素抵抗模型中脂代谢的改变

目的:探讨胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)对肝细胞脂代谢酶的影响?方法:用不同浓度胰岛素刺激HepG2细胞,建立肝细胞IR模型;用油红O染色观察细胞形态及胞内脂滴形成;应用甘油三酯(triglyceride,TG)检测试剂盒检测细胞中TG含量;Real-time PCR检测乙酰辅酶a羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)?肝型脂肪酸结合蛋白(liver-type fatty acid-binding protein,L-FABP)?脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)?肉碱棕榈酰转移酶(carnitine palmitoyltransferase 1,CPT1)?微粒体甘油三酯转移蛋白(microsomal triglyceride transfer protein,MTP)等脂代谢相关因子及转录因子胆固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1c)?过氧化物酶体增生物激活受体α(peroxisome proliferator activated receptor α,PPARα)的mRNA表达水平?结果:用浓度1×10-4 mol/L的胰岛素刺激细胞36 h后形成IR?IR细胞内脂滴增多,TG含量增加;IR细胞内脂合成相关的ACC?SREBP-1c的mRNA水平较对照组升高;LPL?CPT1?MTP?PPARα的mRNA水平较对照组降低;L-FABP mRNA水平与对照组相比无差异?结论:IR通过提高肝细胞脂合成?降低脂氧化过程,导致肝细胞内脂质异常堆积?     

pcDNA3-MAGE-1真核表达载体的构建及其在Hepal-6细胞中的稳定表达

目的:构建真核表达载体,并在小鼠肝癌Hepa1-6细胞中稳定表达,观察转染细胞的增殖能力和致瘤能力。方法:用PCR方法扩增SMMC-7721人肝癌细胞株MAGE-1全长序列,连接到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达pcDNA3-MAGE-1,脂质体法转染小鼠Hepa1-6细胞。G418筛选阳性克隆(Hepa1-6- MAGE-1),用RT-PCR和Western blotting检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;MTT 法检测Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞生长和增殖的变化;分别以Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞接种于C57BL /6j小鼠右侧背部皮下,观察Hepa1-6- MAGE-1细胞的致瘤能力。结果:构建MAGE-1的真核表达载体转染Hepa1-6细胞,PT-PCR与Western boltting检测分别在Hepa1-6- MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组细胞增殖无统计学差异;两组各10只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠肝癌Hepa1-6细胞株,并具有很好的增殖和致瘤能力。     

厚朴酚对脂肪酸诱导HepG2细胞脂质积蓄的作用及机制研究

目的:研究藿朴夏苓汤中主要成分之一厚朴酚改善OA+PA诱导HepG2细胞脂质积蓄的作用及机制。方法:采用双荧光素酶报告基因活性分析筛选藿朴夏苓汤中各成分对CPT1α-luc荧光素酶活性的影响;采用分子对接研究厚朴酚与PPARα的相互作用;采用免疫荧光分析测定HepG2细胞的PPARα蛋白表达。将HepG2细胞分为对照组(DMSO)、模型组(OA+PA)、厚朴酚低、中、高剂量组(2.5,10,40μmol/L)和非诺贝特组(10μmol/L)。1 mmol/L的OA+PA处理HepG2细胞24 h构建脂质积蓄细胞模型,2.5,10,40μmol/L厚朴酚处理24 h。油红O染色观察脂滴聚集情况,采用全自动生化仪检测细胞内甘油三酯(TG)含量,使用实时荧光定量PCR检测与脂质合成、摄取和氧化分解相关基因的mRNA表达。结果:厚朴酚通过Cys276、Lys358、Thr279等氢键方式与PPARα的LBD进行分子-蛋白质相互作用,提高CPT1α-luc荧光素酶报告基因活性;厚朴酚通过促进PPARα核易位,提高PPARα和CPT1-α的mRNA表达水平。油红染色实验显示,与对照组比较,模型组中HepG2细胞内红色脂滴聚集和TG水平明显增加,模型组细胞内主要脂质合成和转运基因(FAS、CD36、FABP1和FATP2)的mRNA表达水平显著升高,而脂质氧化代谢基因(PPARα、CPT1-α和ACO)则显著降低(P0.01),差异有统计学意义。与模型组比较,厚朴酚中、高剂量组均可明显降低细胞内红色脂滴聚集和细胞内TG水平,抑制脂质合成和转运基因FAS、CD36、FABP1和FATP2的基因表达,而提高脂质氧化代谢基因PPARα、CPT1-α和ACO的表达(P0.05,P0.01),差异有统计学意义。PPARα敲减实验显示,与模型组比较,厚朴酚失去了降低细胞内红色脂滴聚集和细胞内TG水平,以及失去对脂质合成、转运和氧化代谢相关基因的调控作用,差异无统计学意义(P0.05)。结论:藿朴夏苓汤成分厚朴酚通过激动PPARα信号,提高脂质氧化分解作用,并降低脂质合成、摄取,从而减少HepG2细胞模型脂质蓄积。     

共轭亚油酸改善肥胖糖尿病小鼠的糖脂代谢

目的分析共轭亚油酸（CLA）对肥胖糖尿病（db/db）小鼠糖脂代谢的改善效果。方法将db/db 小鼠分为生理盐水组和 CLA实验组分别给予生理盐水,CLA混合物灌胃处理,测量小鼠体质量、饮食摄入量、饮水量、口服糖耐量、甘油三酯、总胆固醇 水平。HE染色和油红“O”染色检测肝脏病理学改变和脂肪酸含量。荧光定量PCR和Western blot 实验检测PPARα、PPARγ、 CD36、CHREBP和SREBP-1c 等基因表达水平。分别用共轭亚油酸和亚油酸处理HepG2 细胞,检测PPARα、ACC、P-ACC、 CD36等基因的表达。同时检测细胞上清中乙酰辅酶A的含量。结果共轭亚油酸能减少db/db小鼠饮食、饮水量,有效减轻小 鼠体重,降低血清甘油三酯和胆固醇水平（P<0.05）。共轭亚油酸能降低db/db小鼠空腹血糖,提高糖耐量。肝脏病理学切片和 油红“O”染色结果表明共轭亚油酸能减少肝脏里脂滴累积,有效改善脂代谢。共轭亚油酸能上调肝脏组织PPARα表达（P< 0.05）,下调CD36表达（P<0.001）。细胞实验显示共轭亚油酸能上调PPARα（P<0.001）,上调P-ACC,同时下调CD36（P<0.01）表 达;ELISA结果显示CLA处理后细胞中乙酰辅酶A显著上调（P<0.01）。结论两种共轭亚油酸同分异构体混合物能够明显改 善db/db小鼠糖脂代谢,降低空腹血糖,提高糖耐量,对肥胖、糖尿病动物模型产生综合性的治疗效果。其作用机制可能是通过 上调转录因子PPARα,下调脂质转运蛋白CD36,促进ACC磷酸化来调控糖脂代谢。     

DMSO处理的Hepa1-6细胞诱导小鼠建立肝癌特异性免疫及其机制研究

【实验背景】 肿瘤疫苗在近几年的飞速发展为临床的肿瘤生物治疗提供了新的思路。我们在前期研究中,偶然发现了DMSO处理Hepa1-6细胞不但能抑制细胞的增殖,而且将经过DMSO处理小鼠肝癌细胞Hepa1-6(D-hep细胞)接种于C57BL/6J小鼠皮下后,肿瘤出现先生长后消退的现象,而且在消退小鼠皮下再次接种Hepa1-6时,无肿瘤形成。这一现象提示,经过DMSO处理后的Hepa1-6细胞可以诱导小鼠建立肿瘤特异性免疫,用DMSO处理肿瘤细胞可能可以成为制备肿瘤活疫苗的新方法。国内外尚无关于该方法的相关报道。 【实验目的】 证实经DMSO处理后的Hepa1-6细胞可以诱导小鼠建立肿瘤特异性免疫,并对其相关机制作初步探讨。 【实验方法及结果】 (1)在C57小鼠和NOD/SCID小鼠皮下分别接种Hepa1-6和D-hep细胞,证实了D-hep细胞在C57小鼠皮下先成瘤再消退,而在NOD/SCID小鼠皮下肿瘤则持续生长的特性,证明D-Hep细胞成瘤特性的改变是由于小鼠免疫系统的参与导致的。(2)在肿瘤消退过程中,以及消退后再次接种Hepa1-6后的数个时间点,脾脏细胞中CD4和CD8阳性的central memory T细胞和effective memory T细胞比例有明显的上升,同时NKT细胞在早期也有明显上升,血清IFN-γ检测也显示上升曲线与流式检测结果一致。我们还观察到接种Hepa1-6后,相比于野生型C57小鼠,接种了D-hep细胞的小鼠(D-hep小鼠)Treg细胞比例上升缓慢。(3)将接种了D-hep小鼠和野生型C57小鼠脾脏细胞取出,利用CFSE标记脾脏细胞,与Hepa1-6细胞和Hepa1-6细胞裂解液共培养,发现CFSE荧光强度有多峰表现;同时,利用CCK-8法检测共培养后的肿瘤细胞活力,发现D-hep小鼠组的肿瘤细胞增殖活力明显下降。(4)对D-hep细胞和Hepa1-6细胞的表达谱芯片进行分析发现,变化数量最多,最为明显的是趋化因子和趋化因子受体一类基因,特别是其中CCL17的上升表达,提示了D-hep细胞可能通过募集和激活NKT细胞和nave CTL细胞增强了抗原提成和免疫识别能力。 【实验结论】 本研究证明了经过DMSO处理的Hepa1-6细胞具有诱导小鼠建立针对Hepa1-6细胞的肿瘤特异性免疫的能力,并阐明了在抗肿瘤免疫过程中,主要由NKT细胞和CD8阳性effective memory T细胞双重介导。本研究在国际上首次发现了基于DMSO的一种新的制备肿瘤疫苗的方法,为临床的肿瘤生物治疗提供了新的思路,具有潜在的临床治疗应用价值。     

羟基肉桂酸对HepG2和C2C12细胞糖脂代谢的调节作用

目的 研究羟基肉桂酸对HepG2细胞脂质堆积和葡萄糖消耗及C2C12细胞葡萄糖摄取的调节作用及其机制.方法 利用油酸诱导HepG2细胞建立脂质堆积模型,通过油红O染色法观察不同浓度羟基肉桂酸对脂质堆积的作用,并检测细胞内总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量;同时,采用MTT法检测羟基肉桂酸对细胞活力的影响;通过葡萄糖消耗实验和葡萄糖摄取实验检测羟基肉桂酸对细胞葡萄糖利用的影响;采用实时荧光定量PCR技术分析糖脂代谢关键基因的表达.结果 羟基肉桂酸能够显著抑制油酸诱导的HepG2细胞脂质堆积,同时降低细胞中TC和TG含量;羟基肉桂酸还能够显著增强细胞对葡萄糖的消耗,促进葡萄糖的摄取,显著降低固醇调节元件结合蛋白-1a、-1c、-2和脂肪酸合酶,乙酰辅酶A羧化酶和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的mRNA表达水平,同时升高过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)的表达.结论羟基肉桂酸具有调节细胞糖脂代谢的作用,能够改善HepG2细胞中的脂质堆积,并且显著提高葡萄糖的利用率.其作用机制可能与激活PPAR等关键基因的表达有关.     

全反式维甲酸诱导肝癌细胞Hepa1-6成熟和分化过程中的自噬

目的探讨不同浓度全反式维甲酸（ATRA）对小鼠肝癌细胞Hepa1-6成熟分化及细胞自噬水平的影响。方法以小鼠肝癌 细胞Hepa1-6为研究对象,分别给予0.1、1、10 μmol/L浓度的ATRA处理,荧光定量PCR和Western blot检测肝细胞相关标志基 因的表达,吲哚菁绿（ICG）及过碘酸-希夫（PAS）染色检测小鼠肝癌细胞Hepa1-6的成熟功能,透射电镜观测细胞连接及自噬小 体,选择最适的ATRA作用浓度;Western blot检测自噬相关标志蛋白的表达,ptfLC3质粒转染细胞后共聚焦观察自噬流变化, 检测自噬流是否通畅。结果相较于空白对照组,ATRA可呈浓度依赖性抑制肝前体标志蛋白AFP的表达,并促进肝细胞成熟 标志ALB、CK18、TAT和ApoB的表达,ICG及PAS染色提示阳性细胞数明显增多;透射电镜结果显示ATRA诱导组的紧密连接 和细胞骨架明显增多,可见高尔基复合体以及较多的自噬小体和自噬溶酶体。均以10 μmol/L组最为显著,作为最适终浓度。 自噬相关标志蛋白LC3-II、Beclin-1、RAB7、P62的表达不同程度增高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明显增加（P<0.05）,激光共聚焦可 见10 μmol/LATRA处理组细胞胞浆内绿色亮点的自噬小体及红色亮点的自噬溶酶体均较对照组明显增多。结论ATRA可诱 导小鼠肝癌细胞Hepa1-6的成熟分化,并促进细胞自噬水平增高。     

肺癌细胞抑制CD4+T细胞 IFN-γ基因表达的机制研究

目的:研究肺癌细胞能否直接影响CD4+T 细胞干扰素-γ(IFN-γ)基因启动子甲基化水平?方法:ELISA法检测肺癌组(n = 30)及健康对照组(n = 30)血浆IFN-γ水平;免疫磁珠分选两组外周血CD4+T 细胞(n = 8),提取DNA后经亚硫酸氢盐修饰,PCR扩增 IFN-γ基因启动子进行TA克隆测序,测序结果采用生物信息学软件进行分析;建立健康人CD4+T 细胞与肺腺癌细胞株SPC-A1体外Transwell共培养体系(n = 6),并设健康人CD4+T 细胞单独培养为对照组,培养5 d后分别收集CD4+T 细胞?CD4+T 细胞按上述法进行TA克隆测序?同时CD4+T 细胞经anti-CD3?anti-CD28刺激6?24 h,ELISA法检测两组上清IFN-γ表达水平,RT-PCR检测CD4+T 细胞IFN-γ mRNA表达水平?结果:肺癌组血浆IFN-γ水平显著低于健康对照组[(69.30 ± 38.56) pg/ml vs (92.62 ± 34.75) pg/ml,P = 0.017];肺癌组CD4+T 细胞IFN-γ基因启动子甲基化水平显著高于健康对照组(84.6% vs 68.6%,P < 0.001);肺癌患者血浆IFN-γ水平与其基因启动子甲基化率呈负相关(r = -0.850 3,P = 0.010 7)?体外Transwell共培养实验中,与对照组相比,实验组CD4+T 细胞anti-CD3?anti-CD28刺激6?24 h,IFN-γ表达水平显著下降[6 h:(14.53 ± 7.12) pg/ml vs (36.14 ± 23.51) pg/ml,24 h:(7.81 ± 4.02) pg/ml vs (24.85 ± 15.58) pg/ml],6 h对照组CD4+T 细胞IFN-γ mRNA表达水平为实验组的2.37倍?实验组CD4+T 细胞IFN-γ基因启动子甲基化水平显著高于对照组(85.4% vs 70.9%)?结论:肺癌细胞可诱导CD4+T 细胞IFN-γ基因启动子发生高甲基化,进而导致IFN-γ基因表达下调,可能对肺癌患者的免疫抑制起重要作用?     

可溶性虫卵抗原对小鼠骨髓源性树突状细胞表型及Th17细胞分化的影响

目的:探讨日本血吸虫可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)致敏小鼠骨髓源性树突状细胞(dendritic cells,DCs)后对其细胞表型及Th17细胞分化的影响?方法:收集BALB/c小鼠骨髓细胞,应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)?白介素(interleukin,IL)-4定向诱导小鼠骨髓细胞向DCs分化;流式细胞仪检测SEA刺激培养后DCs表面分子的表达情况;流式细胞术检测DCs 分泌IL-6?IL-23的水平,ELISA法检测DCs分泌转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的水平;SEA刺激DCs与CD4+T细胞共培养后检测培养上清中IL-6?TGF-β?IL-23和IL-17细胞因子水平?结果:诱导培养出可供实验用的高纯度DCs;SEA刺激DCs能表达较高水平的CD80?CD86?CD40?组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅱ类分子;SEA刺激DCs产生IL-6和TGF-β明显增多;SEA刺激的共培养细胞上清中IL-17水平增高?结论:SEA能够促进DCs成熟,并诱导CD4+T细胞向Th17细胞分化?     

DUSP9真核表达载体的构建及其在Hepa1-6肝细胞中的表达

目的构建小鼠DUSP9基因真核表达载体,并在小鼠Hepa1-6肝细胞中表达DUSP9蛋白。方法采用RT-PCR方法,从小鼠肝组织获取DUSP9cDNA片断,经双酶切、连接重组至真核表达载体pEGFP-N1,构建pEGFP-DUSP9重组质粒,双酶切及DNA测序对该重组质粒进行鉴定。脂质体介导pEGFP-DUSP9转染Hepa1-6肝细胞,实时荧光定量PCR、Western blot检测DUSP9mRNA及蛋白表达水平的变化。结果 pEGFP-DUSP9重组质粒经双酶切及测序鉴定证明构建完全正确,成功转染Hepa1-6肝细胞并高效表达,检测到明显上调的DUSP9mRNA和蛋白表达水平。结论成功构建真核表达载体pEGFP-DUSP9,并在Hepa1-6肝细胞中表达了DUSP9蛋白,可为研究DUSP9的生理功能及了解其在糖、脂代谢、胰岛素抵抗进程中的作用奠定坚实的基础。     

四妙丸提取物乙醇提取部位对肝脏脂质蓄积的作用

研究四妙丸提取物的60%乙醇洗脱部位（ESMW）对肝脏脂质蓄积的改善作用及其机制。采用甘油三酯（TG）试剂盒、BODIPY荧光染色、QPCR、Western blot、油红O染色、AMPKα敲减等方法检测四妙丸提取物ESMW对游离脂肪酸诱导的肝细胞脂质蓄积的改善作用;并在高脂饲喂小鼠中,通过检测ESMW对高脂饮食小鼠的口服糖耐量、血脂、肝脏脂质水平、肝组织脂代谢相关mRNA及蛋白表达等生化指标,验证ESMW对肝脏脂质蓄积的改善作用及其机制。结果表明,ESMW通过调节AMPK信号通路抑制游离脂肪酸诱导的肝原代细胞脂质堆积;显著改善了高脂饮食小鼠肝脏的脂质堆积,且该药效的发挥与AMPK信号通路有关。     

新生小鼠颅盖骨间充质干细胞原代培养模型的建立

目的:探索新生小鼠颅盖骨间充质干细胞原代培养的方法?方法:取新生小鼠颅盖骨,采用胶原酶消化获得间充质干细胞,观察细胞的形态及增殖情况,通过细胞周期分析细胞增殖能力,通过流式测定细胞表面标志来分析细胞纯度,对细胞进行成骨成脂诱导分化,并分别予茜素红及油红O染色定性,荧光定量PCR检测成骨标志基因Osteocalcin及成脂标志基因PPARγ?Fabp4表达情况?结果:培养出的纺锤形细胞均一性好?增殖能力强?流式测定细胞表面标志显示细胞纯度好,高表达CD29?CD44,几乎不表达CD34?CD45?诱导分化后分化率高,茜素红染色及油红O染色分别可见较多矿化结节及脂滴,荧光定量PCR显示随分化相关标志基因均明显增高?结论:本研究成功建立了新生小鼠颅盖骨间充质干细胞原代培养模型,为进一步研究间充质干细胞奠定基础?     

不同葡萄糖浓度对INS-1细胞PPARδ表达的影响

目的 研究不同葡萄糖浓度对大鼠INS-1 细胞PPARδ表达的影响,以初步阐明PPARδ在胰岛细胞糖脂代谢关联中的作用.方法 分别用含3、11、20 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养基,培养INS-1细胞24 h后,冻融法裂解细胞,检测INS-1细胞内的甘油三酯水平.提取RNA和核蛋白,RT-PCR半定量检测PPARδ mRNA,Western blot 检测PPARδ蛋白表达.结果 随着葡萄糖浓度的升高INS-1细胞内甘油三酯含量增高,而PPARδ mRNA和蛋白的表达均明显降低.结论 葡萄糖促进,INS-1细胞内甘油三酯沉积,而PPARδ的表达下降可能是高糖条件下胰岛细胞脂质沉积的重要原因.     

SULT2B1影响小鼠Hepa1-6肝癌细胞的HIF-1α，糖酵解及血管新生

 目的 研究羟基类固醇硫酸基转移酶SULT2B1对小鼠Hepa1-6肝癌细胞HIF-1α、糖酵解及血管新生能力的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 分别用SULT2B1过表达及干扰载体感染Hepa1-6细胞,采用real-time PCR和Western blot检测过表达/干扰SULT2B1对HIF-1α表达水平的影响,同时检测糖酵解相关基因HK Ⅱ和LDH的mRNA表达水平。CCK-8法检测干扰SULT2B1的肿瘤条件培养基(tumor conditioned medium,TCM)对小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3增殖能力的影响,并检测VEGF的mRNA表达水平。建立Hepa1-6细胞裸鼠移植瘤模型,免疫组化染色检测裸鼠瘤组织中CD34的表达水平。结果 过表达/干扰 SULT2B1可分别上调/下调HIF-1α的mRNA及蛋白表达水平,且干扰SULT2B1可使HK Ⅱ和LDH的mRNA表达水平降低,过表达发生相反的变化(P<0.05)。干扰SULT2B1的TCM可抑制bEnd.3细胞的增殖能力,并降低VEGF的mRNA表达水平(P<0.05)。同时,干扰SULT2B1可降低Hepa1-6细胞移植瘤在裸鼠体内的生长并降低瘤组织中的微血管密度(P<0.05)。结论 干扰SULT2B1可抑制Hepa1-6细胞的糖酵解及血管新生能力,其作用主要与下调HIF-1α、HK Ⅱ、LDH及VEGF的表达水平有关。     

mTORC1-HIF1α通路基因在人CD8+调节T细胞中的表达及意义

目的:探讨mTORC1-HIF1α通路基因在人CD8+调节性T细胞中的表达及意义?方法:建立人卵巢癌细胞系SKOV3与健康人CD8+ T细胞体外共培养体系,设置CD8+T细胞单独培养组为对照组?共培养5 d后,收集各组CD8+T细胞,荧光定量PCR检测2组CD8+T细胞中mTORC1-HIF1α通路基因(mTORC1?HIF1α?Glut1?PKM2?GPI?TPI?Eno1及LDHα)mRNA表达水平;Western blot 检测2组CD8+T细胞中mTORC1-HIF1α通路基因(mTORC1?HIF1α及PKM2)蛋白表达水平;收集14例卵巢癌,12例卵巢良性肿瘤及12例健康体检者外周血,磁珠阳选法分离CD8+T细胞,荧光定量PCR检测卵巢癌患者CD8+T细胞中mTORC1-HIF1α通路基因mRNA表达水平,并与卵巢良性肿瘤及健康体检者做比较研究?结果:与单独培养组相比,共培养组CD8+ T细胞mTORC1?HIF1α?PKM2?GPI及TPI mRNA表达水平显著降低(P < 0.05);Western blot 结果显示,共培养组CD8+ T细胞mTORC1?HIF1α及PKM2蛋白表达水平也显著低于对照组(P < 0.05);卵巢癌组CD8+ T细胞中mTORC1?HIF1α?Glut1?PKM2?GPI及TPI表达量显著低于健康对照组(P < 0.05);卵巢癌组mTORC1?PKM2?GPI及TPI表达量明显低于卵巢良性肿瘤组(P < 0.05);卵巢良性组mTORC1-HIF1α通路各基因表达水平与健康对照组间无显著性差异?结论:卵巢癌微环境诱导的CD8+调节性T细胞低表达mTORC1-HIF1α通路基因,mTORC1-HIF1α通路在卵巢癌微环境中CD8+调节性T细胞代谢及分化过程中具有重要意义?