HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义.方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性.结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6, 限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37 ℃,诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L. 结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

The differential expression of HSV -1 UL12 gene in E.coil BL21 and E.coli Rosetta

目的 构建Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV -1)的UL12基因原核重组表达质粒pET32a - ULI2,比较重组表达质粒pET32a -UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta表达产量与生物学活性.方法 使用PCR的方法扩增出HSV -1的UL12基因,克隆至原核表达质粒pET32a(+),构建出重组质粒pET32a - UL12,分别转化E.coli BL21和E coli Rosetta菌.经SDS - PAGE鉴定分析目的蛋白的表达差异,并比较在两种菌中目的蛋白的活性.结果 重组质粒pET32a - UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta的包涵体中均表达出了碱性核酸酶融合蛋白,E.coli Rosetta中表达的碱性核酸酶融合蛋白表达量较大,而E.coliBL21中表达的碱性核酸酶活性更高.结论 成功构建了表达出了具有较高活性的HSV -1碱性核酸酶融合蛋白,为进一步研究抗HSV -1药物奠定了基础.     

抗菌肽Cecropin B-肿瘤血管生长抑制因子 Kringle5融合蛋白表达载体的构建及其表达

通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽Cecropin B(CB)基因,从ThioA/L15-7上卸下肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)基因,将两者按正确的阅读框架融合并定向克隆至大肠杆菌高效表达载体pET32a上,构建成pET32a/CB-K5重组载体。重组载体转化BL21(DE3)细胞后,提取质粒进行PCR鉴定和序列分析,证明重组质粒pET32a/CB-K5阅读框架和融合基因序列均与预期相符。实验结果显示,成功地构建了抗菌肽CecropinB(CB)和肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)融合蛋白的表达载体pET32a/CB-K5。转化E.coliBL21(DE3),SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,融合蛋白以包涵体的形式在重组转化菌株中获得高效表达,表达量达到菌体总蛋白的50%。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒UL12基因在大肠杆菌BL21和Rosetta菌中的差异表达

目的构建Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)的UL12基因原核重组表达质粒pET32a-UL12,比较重组表达质粒pET32a-UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta表达产量与生物学活性。方法使用PCR的方法扩增出HSV-1的UL12基因,克隆至原核表达质粒pET32a(+),构建出重组质粒pET32a-UL12,分别转化E.coli BL21和E.coli Rosetta菌。经SDS-PAGE鉴定分析目的蛋白的表达差异,并比较在两种菌中目的蛋白的活性。结果重组质粒pET32a-UL12在E.coli BL21和E.coliRosetta的包涵体中均表达出了碱性核酸酶融合蛋白,E.coli Rosetta中表达的碱性核酸酶融合蛋白表达量较大,而E.coliBL21中表达的碱性核酸酶活性更高。结论成功构建了表达出了具有较高活性的HSV-1碱性核酸酶融合蛋白,为进一步研究抗HSV-1药物奠定了基础。     

Construction and Expression of pacA and gtfB-cat of Streptococcus Mutans Fused with ctxB in Prokaryotic Cells

目的:构建含变形链球菌表面蛋白A区编码基因(pacA)、葡糖基转移酶催化区编码基因(gtfB-cat)及霍乱毒素B亚单位编码基因(ctxB)的嵌合表达质粒并表达目的蛋白.方法:将目的基因pacA、gtfB-cat、ctxB克隆至原核克隆载体pET32-a(+)构建嵌合质粒pET-pacA-cat-ctxB,将其转入表达宿主菌E.coliBL21(DE3),并测量其表达情况.结果:构建的重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,证实目的基因均正确插入到载体pET-32a(+)中,插入的相位正确,未改变目的基因的阅读框架,经诱导后表达目的蛋白,分子质量大小与预期一致.结论:成功构建了嵌合质粒pET-pa-cA-cat-ctxB,且它们均在原核细胞内获得正确表达.     

变形链球菌pacA和gtfB-cat与ctxB嵌合表达质粒的构建及表达

目的:构建含变形链球菌表面蛋白A区编码基因(pacA)、葡糖基转移酶催化区编码基因(gtfB-cat)及霍乱毒素B亚单位编码基因(ctxB)的嵌合表达质粒并表达目的蛋白。方法:将目的基因pacA、gtfB-cat、ctxB克隆至原核克隆载体pET32-a(+)构建嵌合质粒pET-pacA-cat-ctxB,将其转入表达宿主菌E.coliBL21(DE3),并测量其表达情况。结果:构建的重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,证实目的基因均正确插入到载体pET-32a(+)中,插入的相位正确,未改变目的基因的阅读框架,经诱导后表达目的蛋白,分子质量大小与预期一致。结论:成功构建了嵌合质粒pET-pacA-cat-ctxB,且它们均在原核细胞内获得正确表达。     

Tipα基因原核表达质粒的构建及其诱导条件的优化

目的 构建肿瘤坏死因子α诱导蛋白(Tipα)基因的原核表达载体,并优化诱导实验条件使其在大肠杆菌中表达.方法 提取幽门螺杆菌(H pylori) 26695菌株总DNA,用PCR方法扩增位于H.pylori 0596的Tipα基因编码序列.将Tipα基因与pET29a载体同时经BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切、纯化及连接后,构建pET29a-Tipα原核表达质粒,转化至宿主菌Top10F'中.优化实验条件使pET29a-Tipα原核质粒表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot方法进行鉴定.结果 pET29a-Tipα原核表达质粒经双酶切证实插入片段分子量为519 bp DNA条带,测序结果与H.pylori 0596的Tipα基因编码序列相一致.当诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度为1.0 mmol/L,30℃诱导培养4h时,诱导目的蛋白表达量最高.Western blot结果证实,表达的重组蛋白可与Tipα抗体产生分子量约为21.8 KD的特异性条带.结论 成功构建了pET29a-Tipα原核表达质粒,并优化实验条件使其在大肠杆菌中表达了Tipα重组蛋白.     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.     

梅毒螺旋体重组蛋白Tp0463的表达与抗原性鉴定

目的表达梅毒螺旋体(Tp)重组蛋白Tp0463(rTp0463)并鉴定其抗原性,为进一步探讨其在梅毒血清学诊断和免疫保护中的作用奠定基础。方法 PCR扩增Tp0463基因,构建原核表达重组体pET-28a(+)/Tp0463,转化宿主菌诱导表达重组蛋白,Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白,Westernblot鉴定表达产物的抗原性。结果成功构建了原核表达重组体pET-28a(+)/Tp0463,经诱导高效表达了一分子量大约为16KDa的重组蛋白,以包涵体表达形式为主,纯化蛋白的纯度>90%;Westernblot结果显示纯化蛋白能被梅毒患者混合血清特异性识别。结论高效表达了rTp0463,该重组抗原有良好的抗原性。     

CREKA/tTF融合蛋白表达及活性鉴定

目的制备用于靶向肿瘤血管中的凝血血浆蛋白的CREKA/tTF融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法利用PCR技术构建CREKA与tTF的融合基因,克隆至表达载体pET22b(+),在E.coli BL21中表达,镍亲和色谱柱纯化,梯度透析复性。利用凝血时间,结合荧光定量测定等实验在体外鉴定该融合蛋白的活性。结果获得序列正确的CREKA/tTF/pET22b(+)重组子,融合蛋白在E.coli BL21中高效表达。纯化后的融合蛋白具有引起血液凝固的功能,且能与凝血血浆蛋白结合。结论成功构建CREKA/tTF/pET22b(+)重组子,CREKA/tTF融合蛋白具有TF凝血活性及CREKA的结合活性。     

铜绿假单胞菌外排泵MexA蛋白原核表达纯化

目的 构建MexA原核表达载体,并实现MexA原核表达、纯化.方法 从多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再经PCR扩增出mexA基因,酶切纯化后克隆到原核表达载体PQE30,构建重组表达载体PQE30/mexA,PCR及酶切鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot检测有无蛋白的表达.结果 已获得长约1.5kb PCR产物,酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆了mexA基因,序列分析结果与PA01mexA序列相同.SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量40kDa处有表达条带,诱导表达之菌体,超声破碎后,目的蛋白主要以包涵体形式存在.结论 获得mexA基因,并在E.coliM15中成功表达.融合蛋白纯化后作免疫原,为制备多克隆抗体打下基础.     

丹参柯巴基焦磷酸合酶基因的优化表达、纯化及抗体制备

用含丹参柯巴基焦磷酸合酶(Salvia miltiorrhiza copalyl diphosphate synthase，SmCPS)基因的重组质粒pET32CPS转化大肠杆菌BL21trxB (DE3)进行诱导表达，SDS-PAGE结果表明SmCPS基因在大肠杆菌中获得了表达；对影响可溶性表达的4个因素，即诱导温度、IPTG诱导浓度、诱导时宿主菌的密度(A₆₀₀)和诱导时间进行了优化。结果发现在宿主菌A₆₀₀达到1.0时加入0.4 mmol·L^-1 IPTG，在20 ℃诱导培养8 h表达的可溶性蛋白量最高，约占细胞总蛋白的35.6%。用Ni²⁺亲和色谱法纯化表达产物，纯化蛋白产率达到12.3 mg·L^-1。将纯化蛋白免疫制备兔源SmCPS抗血清，ELISA测定效价为1∶24 300，且经Western blotting鉴定该抗体可特异性识别SmCPS抗原，获得了效价高、免疫反应性好的SmCPS多克隆抗体，为进一步从蛋白水平研究SmCPS表达与丹参酮类有效成分生物合成相关性提供了物质基础。     

葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因的克隆、表达和纯化

目的构建表达金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)抗体结合区基因SPA-ZZ的pET-32a-ZZ表达载体,在大肠杆菌BL21中进行高效表达并初步纯化。方法用PCR从pEZZ18中克隆SPA抗体结合区基因ZZ,构建重组表达质粒pET32-ZZ,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,IPTG诱导表达,表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE),并用Q-Sephrose Fast Flow柱进行初步纯化。结果得到了高效表达SPA-ZZ的pET32-ZZ表达载体,表达产物经SDS-PAGE检测相对分子质量为41 000,初步纯化后可得到较纯的表达蛋白。结论SPA抗体结合区蛋白ZZ能在大肠杆菌中高效表达,为SPA-ZZ的应用奠定了一定的基础。     

pET15b-pep-1-p27mt的构建、表达及意义

构建细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)PEP-1和细胞周期抑制蛋白p27mt的重组体,并在大肠杆菌中表达。将已构建的表达细胞周期抑制蛋白p27mt的基因,克隆入pET15b-pep-1原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果:成功地构建PEP-1-p27mt融合蛋白原核表达载体,并在IPTG诱导下获得特异性的表达。PEP-1-p27mt融合蛋白表达载体的构建,为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡提供了理论基础。     

线虫抗凝血蛋白AcaNAP7基因克隆、表达及抗凝活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达犬钩虫线虫抗凝血蛋白NAP7(AcaNAP7)成熟蛋白,并鉴定表达产物的抗凝活性。方法根据AcaNAP7的核苷酸序列设计引物,从克隆质粒pUCm-T/AcaNAP7中扩增编码AcaNAP7成熟蛋白的基因;扩增产物经双酶切定向克隆到原核表达载体PET-32a中;构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化的部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝血活性。结果克隆了编码AcaNAP7成熟蛋白的基因并构建了重组表达质粒pET-32a/AcaNAP7;在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达了融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白,产物主要以可溶形式存在;镍琼脂糖凝胶亲和纯化获得了纯度高达92%的目的蛋白;纯化产物能明显延长PT及aPTT,其延长PT比延长aPTT更有效。结论在大肠杆菌中成功表达了AcaNAP7融合蛋白,表达产物具有抗凝活性。该实验为进一步研究AcaNAP7的功能及应用奠定了基础。