基于rDNA序列的酵母整合载体的构建及应用

目的构建一个基于rDNA序列的酵母整合载体。方法通过PCR扩增得到酿酒酵母rDNA序列;通过常规分子生物学技术构建以rDNA序列为整合位点的酵母整合载体。为了确证该载体的效能,将青蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶基因克隆到该载体上,构建了含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的整合型酿酒酵母工程菌。提取该工程酵母的基因组,通过紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的特异引物进行扩增,确认紫穗槐-4,11-二烯合酶基因是否已整合到酵母基因组上。发酵酵母工程菌,对发酵产物进行GC—MS检测,确认是否产生紫穗槐-4,11-二烯。结果构建了1个酵母整合载体,具有如下特点：①能将外源基因表达盒序列整合到酿酒酵母rDNA序列上,增加目的基因的拷贝数;②选择标记能反复应用,方便获得多拷贝的整合形式;③整合片段不需要酶切线性化,节省了内切酶,而且简化了操作程序。酵母基因组PCR结果表明,紫穗槐-4,11-二烯合酶基因已经整合到了酵母基因组上。以朱栾倍半萜为标准品,对该酿酒酵母工程菌的代谢产物进行GC—MS检测,发现其能产生紫穗槐-4,11-二烯,产量达到（91．33±7．57）mg／L朱栾倍半萜当量。结论初步成功构建了一个基于rDNA序列的酵母整合载体。     

虎眼万年青EST文库构建和Syntaxin基因的克隆及生物信息学分析

目的构建虎眼万年青 EST 文库,筛选相关基因并对其进行功能鉴定。方法 CTAB 法提取虎眼万年青鳞茎总 RNA,通过SMART 方法构建全长 cDNA 文库,获得库容大于3×106 cfu/ml 的均一化全长 cDNA 文库。随机挑取1440个单克隆测序,并对得到的 EST 序列进行 Blast 分析（NR、NT、Swiss-Prot 和 KEGG）以及 COG 功能分类。结果获得1398条有效 EST 序列,含有1146条单一基因,cDNA 文库平均插入片段长度在1.5 kb 以上,全长率54%,冗余率3.3%。其中两段基因都与 Syntaxin 43基因相似,同源性分别为76%和89%,根据 Blast 比对结果,推断这两个基因片段是同一个 Syntaxin 基因的5'端和3'端。据此设计引物,以虎眼万年青 cDNA 为模板,通过常规的 RT-PCR 扩增得到全长 Syntaxin 基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体,接着导入大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE 和 Western blot 证实该基因在大肠杆菌获得表达。结论首次构建成功虎眼万年青 EST 文库;并从中筛选得到一条和 Syntaxin 具有同源性的基因,实现了 Syntaxin 蛋白在大肠杆菌中的表达,为 Syntaxin 基因功能的鉴定奠定基础。     

曲马多用于抑制大剂量瑞芬太尼中枢敏化的研究

目的:减轻手术患者因术中应用大剂量瑞芬太尼所致的疼痛.方法:选择ASA Ⅰ-Ⅱ级鼻腔手术患者40例,术中用瑞芬太尼维持麻醉.随机分为两组,Ⅰ组为曲马多组,Ⅱ组为安慰剂组.观察术后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时的VAS评分,恶心呕吐评分,Ramesay镇静评分及总体满意度.结果:两组患者的术后VAS及总体满意度评分比较有显著差异(P＜0.01),副作用及镇静评分无显著差异(P＞0.01).绪论:曲马多术毕前使用可降低VAs评分,提高患者总体满意度.     

甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1与人CPSF30结合拮抗剂筛选模型的建立及药物筛选

利用酵母双杂交技术研究甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1和人切割与多聚腺苷酸化特异因子30 kDa 亚基 (CPSF30) 的相互作用, 构建了一个酵母模型用于筛选NS1和CPSF30相互作用的拮抗剂, 从而为筛选抗甲型H1N1流感病毒药物奠定基础。采用连续重叠PCR技术克隆得到H1N1流感病毒NS1基因。提取人HeLa细胞RNA, 通过RT-PCR克隆得到人CPSF30基因。将NS1基因克隆到表达载体pGBKT7中获得诱饵载体pGBKNS1, 将CPSF30基因克隆到载体pGADT7中获得捕获载体pGADCPSF; 将pGBKNS1和pGADCPSF共转入酿酒酵母AH109, 获得重组酿酒酵母AH109[pGADCPSF+pGBKNS1]。利用该模型筛选了30余种中成药, 发现双黄连口服液等4种中成药能抑制NS1和CPSF30之间的相互作用。     

红色荧光蛋白在酿酒酵母中的表达特性研究

目的研究红色荧光蛋白编码基因Dsred在酿酒酵母菌中的快速克隆与表达。方法根据已发表基因序列设计引物,采用连续重叠PCR方法快速克隆获得全长Dsred基因,将其与pMD-18T载体连接后进行测序鉴定。通过In-fusion方法将鉴定正确的pMD-Dsred重组载体与酿酒酵母表达载体pYeDP60进行连接,测序后利用LiAc方法将鉴定正确的pYeDP60-Dsred重组表达载体转化至酿酒酵母菌W303-1B中,PCR扩增筛选阳性克隆,获得的W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌经诱导培养后进行SDS-PAGE电泳分析和绿光激发荧光成像检测。将工程菌分别接种至YPD、YPG、SCG和SCD培养基,培养48、72、96、120和144h后分别测定吸光度(A600)值。取诱导表达后的工程菌(菌液组)进行离心(菌体组)、离心后加甘油(高渗组)处理,分别置于–70、–20、4、28和37℃条件培养,荧光显微镜观察其表达特性。结果连续重叠PCR扩增和测序鉴定结果表明,扩增获得的Dsred基因长为678bp,其序列与已发表的基因序列完全一致;Dsred基因已成功插入pYeDP60-Dsred重组表达载体,且受酵母诱导型启动子GAL10-CYC1调控表达。PCR扩增筛选和SDS-PAGE分析显示,pYeDP60-Dsred重组表达载体已成功导入酿酒酵母菌中,诱导表达产物相对分子质量与预期相符,且诱导后工程菌可在绿光激发下发出红色荧光。4种培养基内工程菌的菌体生长情况无明显差别,重组Dsred红色荧光蛋白表达不会抑制酿酒酵母菌体生长。荧光显微镜观察显示,工程菌经不同处理后,高渗组红色荧光蛋白成熟时间最短,菌液组时间最长;红色荧光蛋白在37℃条件下培养时成熟最早,但降解速度较快。结论成功构建了pYeDP60-Dsred重组酿酒酵母表达载体,实现了Dsred基因在酿酒酵母菌体内的异源表达。红色荧光蛋白表达对酿酒酵母菌体生长无明显影响,且离心保留菌体和加入甘油等缺水高渗处理都有利于红色荧光蛋白的成熟。     

一种用于筛选启动子元件库的酵母检测载体的构建及初步应用

天然药物合成生物学技术是一种采用多基因控制的方式,实现天然产物代谢途径在异源底盘细胞中的重构。启动子是调控基因表达的一种顺式元件,对多基因控制的代谢途径的平衡起着重要的作用。为了筛选获得性能优越的启动子用于多基因控制的代谢途径,一个基于红色荧光蛋白的酵母检测质粒被构建。首先,根据已经发表的红色荧光蛋白基因,设计并合成了一系列引物,通过连续重叠PCR的方法合成了全长红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer,并将该红色荧光蛋白基因导入酿酒酵母,SDS-PAGE、Western blot以及荧光显微镜观察都表明该红色荧光蛋白基因在酿酒酵母中获得了表达。然后,将具备功能的DsRed-Monomer基因与酿酒酵母表达载体pGBT9进行重组,获得能进行启动子文库筛选的启动子检测质粒pGBT9Red。为了检测该质粒的效能,通过PCR从酿酒酵母基因组中克隆得到了6种启动子(包括4种诱导型启动子和2种组成型启动子),并将6种启动子分别克隆到pGBT9Red中,置于红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer上游,通过荧光成像确定启动子对红色荧光蛋白基因表达的调控效率。结果表明,6种启动子(GAL1、GAL2、GAL7、GAL10、TEF2和PGK1)在酿酒酵母中均能调控DsRed-Monomer的表达。该检测质粒的成功构建为进一步进行启动子活性分析和启动子元件文库筛选奠定基础。     

HMG-CoA还原酶和FPP合酶基因拷贝数对紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌产量的影响

从青蒿中克隆了紫穗槐-4,11-二烯合酶基因(ADS)，从酿酒酵母中克隆了HMG-CoA还原酶(HMGR)催化结构域和FPP合酶(FPPS)基因。构建含ADS基因的酿酒酵母表达载体pYeDP60/G/AS，将其转入酿酒酵母，获得能产生紫穗槐-4,11-二烯的酵母工程菌，以朱栾倍半萜为参照，产量为10 μg·L^-1。另外构建了含HMGR和FPPS基因的酵母表达载体pGBT9/A/HMG/G/FPP，将该载体和pYeDP60/G/AS共转入酿酒酵母，得到第二个能产生紫穗槐-4,11-二烯的酵母工程菌，产量为23.6 mg·L^-1，结果表明增加HMG-CoA还原酶和FPP合酶基因的拷贝数能显著增加酵母工程菌的紫穗槐-4,11-二烯产量。     

催化甾体羟基化的P450氧化酶BM3的蛋白质工程的研究进展

<正>甾体关键位点的羟基化在药用甾体的合成中发挥重要作用。为探究细胞色素P450(CYP450)氧化酶BM3在甾体羟基化合成中的潜在应用,基于细胞色素P450 BM3的蛋白质工程逐渐发展起来。在取得的若干P450 BM3突变酶的基础上,通过新一代测序技术和生物信息学分析等方法,筛选出催化甾体羟基化的相关CYP450。根据易错PCR等定向进化技术获得了突变位点信息,进一步采用(饱和)定点突变等进化技术对活性氨基酸位点进行分析,再经过筛     

经皮穴位电刺激对胸腔镜肺叶切除术患者围手术期炎症反应的影响

目的 研究经皮穴位电刺激对胸腔镜肺叶切除术患者炎性反应的影响。方法 选择在电视辅助胸腔镜下行肺叶切除术的患者60例,随机分为经皮穴位电刺激（transcutaneous electrical acupoint stimulation, TEAS）组和假经皮穴位电刺激组（Sham组）,每组30例。TEAS组于麻醉诱导前30min经皮穴位电刺激双侧合谷穴、内关穴、后溪穴及支沟穴,电刺激持续至手术结束。Sham组于上述穴位贴电极片,但不给予电刺激。分别于手术前30min（T1）、单肺通气1h（T2）、手术结束后双肺通气10min（T3)及术后24h（T4)采集颈内静脉血,用流式细胞术检测血清IL-6、IL-10、TNF-α浓度;记录术后3d内的肺部并发症发生率、术后拔除胸管时间和平均住院日。结果 与Sham组比较,TEAS组血清IL-6及IL-10浓度在手术结束双肺通气10min时均显著降低（P＜0.05）;组内比较,两组患者血清IL-6及IL-10水平在手术结束双肺通气10min时均高于术前（P＜0.05）;两组术后肺部并发症、胸管拔除时间及平均住院日差异无统计学意义。结论 经皮穴位电刺激可降低全身麻醉下胸腔镜肺叶切除术患者术中炎性因子的表达,可能对胸腔镜肺叶切除术患者围手术期肺保护存在积极作用。     

青蒿P450 cDNA基因的克隆及生物信息学分析

目的：对青蒿P450 cDNA基因进行克隆和生物信息学分析。方法：通过RT-PCR,从青蒿cDNA中克隆了1个P450基因；通过生物信息学方法,对其结构特点进行分析。结果：该P450 cDNA基因ORF为1 464 bp,编码488个氨基酸,该序列在GenBank上的登录号为DQ667171。编码蛋白是一个中等大小的A型P450,相对分子质量54.992 kDa；等电点8.83,定位于线粒体,和CYP71AV1具有很高的同源性。结论：该青蒿P450和CYP71AV1在进化和性质上很接近,可能在青蒿中执行类似功能。