虎眼万年青EST文库构建和Syntaxin基因的克隆及生物信息学分析

目的构建虎眼万年青 EST 文库,筛选相关基因并对其进行功能鉴定。方法 CTAB 法提取虎眼万年青鳞茎总 RNA,通过SMART 方法构建全长 cDNA 文库,获得库容大于3×106 cfu/ml 的均一化全长 cDNA 文库。随机挑取1440个单克隆测序,并对得到的 EST 序列进行 Blast 分析（NR、NT、Swiss-Prot 和 KEGG）以及 COG 功能分类。结果获得1398条有效 EST 序列,含有1146条单一基因,cDNA 文库平均插入片段长度在1.5 kb 以上,全长率54%,冗余率3.3%。其中两段基因都与 Syntaxin 43基因相似,同源性分别为76%和89%,根据 Blast 比对结果,推断这两个基因片段是同一个 Syntaxin 基因的5'端和3'端。据此设计引物,以虎眼万年青 cDNA 为模板,通过常规的 RT-PCR 扩增得到全长 Syntaxin 基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体,接着导入大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE 和 Western blot 证实该基因在大肠杆菌获得表达。结论首次构建成功虎眼万年青 EST 文库;并从中筛选得到一条和 Syntaxin 具有同源性的基因,实现了 Syntaxin 蛋白在大肠杆菌中的表达,为 Syntaxin 基因功能的鉴定奠定基础。     

重组人凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1在毕赤酵母中表达条件的优化

采用单因子和正交试验对毕赤酵母重组菌株产生人凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(rhLOX-1)的发酵过程进行了优化,确定了最佳发酵条件:0.8%甲醇,1.8%酪蛋白水解物,初始pH 7.0,3×接种量。在此培养条件下,rhLOX-1在毕赤酵母重组菌株中的表达量可超过100 mg/L,比对照提高了1倍以上。本研究为大规模发酵制备rhLOX-1蛋白奠定了基础,更好地满足了LOX-1的理论研究及新药筛选的需要。     

磷酸二酯酶4研究进展

环腺苷酸(cAMP)和环鸟苷酸(cGMP)对于细胞的许多功能有重要作用。磷酸二酯酶(PDEs)催化cAMP和cGMP水解开环分别生成AMP和GMP,这是细胞内降解cAMP和cGMP的唯一途径。PDEs可分为11个家族,其中有8个家族可以水解cAMP,包括能专一性地水解cAMP的PDE家族(如PDE4),和既可水解cAMP又可水解cGMP的PDE家族。PDE4同工酶主要存于在炎症细胞中。PDE4可分为A、B、C、D 4个亚家族,根据其N端的特殊结构,有长、短和超短三种形式。PDE4催化区三维结构的阐明有助于它们功能的研究和相关药物的设计。PDE4通过与其它蛋白如抑制蛋白、A激-酶锚定蛋白(AKAP)以及活化的C激酶1受体(RACK1)等相互作用使cAMP浓度区域化,选择性地调节各种细胞功能。PDE4作为一个治疗靶点,研究其选择性抑制剂具有重要的意义,可以用于治疗由炎症引起的疾病,如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、阿尔采末病(AD)、帕金森病(PD)和中风等由潜在的炎症引起神经元受损造成的中枢神经系统疾病。     

酶在有机溶剂中的生物催化性能及其固定化技术

在有机相中，酶具有与其在水相中相同的晶体结构，能够正确折叠和恢复活性，其活性严重依赖于干燥前水相的pH值，并受有机溶剂中水含量的影响。有机介质中水分子的存在对于保持天然蛋白质的活性构象和控制蛋白质表面基团的离子化状态具有重要作用。盐种类及有机介质对有机相中酶催化反应的对映体选择性有重要的影响。酶经固定化后，底物在酶分子间的传质阻力减少，酶活得以增大。固定化酶介质对固定化酶活具有较大的影响。文章还介绍了有机相中固定化酶的新方法。     

甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1与人CPSF30结合拮抗剂筛选模型的建立及药物筛选

利用酵母双杂交技术研究甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1和人切割与多聚腺苷酸化特异因子30 kDa 亚基 (CPSF30) 的相互作用, 构建了一个酵母模型用于筛选NS1和CPSF30相互作用的拮抗剂, 从而为筛选抗甲型H1N1流感病毒药物奠定基础。采用连续重叠PCR技术克隆得到H1N1流感病毒NS1基因。提取人HeLa细胞RNA, 通过RT-PCR克隆得到人CPSF30基因。将NS1基因克隆到表达载体pGBKT7中获得诱饵载体pGBKNS1, 将CPSF30基因克隆到载体pGADT7中获得捕获载体pGADCPSF; 将pGBKNS1和pGADCPSF共转入酿酒酵母AH109, 获得重组酿酒酵母AH109[pGADCPSF+pGBKNS1]。利用该模型筛选了30余种中成药, 发现双黄连口服液等4种中成药能抑制NS1和CPSF30之间的相互作用。     

人体肠内细菌对人参皂苷-Re的化学修饰

五加科(Araliaccae)植物人参(Panax ginsengC.A.Mayer.)是驰名中外的珍贵药材.近年来有关化学和药理学的大量研究证明,其主要化学成分--人参皂苷具有与人参相同的药理作用;还证明人参的不同部位,不同的生长年限,不同的采收时间及人参的不同的加工方法,其药理效果不尽相同,如人参皂苷-Rg1对人体中枢神经有兴奋作用,而人参皂苷-Rb1则对中枢神经有抑制作用.     

紫杉烷类化合物的生物转化

紫杉醇 (paclitaxel)是从红豆杉树皮或枝叶中提取出来的具有独特抗肿瘤作用的二萜类化合物 ,自1 992年美国FDA批准紫杉醇 (taxol)上市以来 ,其临床适应症不断扩展 ,成为治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤的一线用药。现已上市的紫杉醇类药物从原料来源上可分为 :直接     

抗SARS药物的作用靶点和药物研究抗SARS药物的作用靶点和药物研究

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)是21世纪出现的一种新的由冠状病毒引起的传染性疾病，从2002年底到2003年，拿世界总计发病人数达到8437人，因病死亡813人(2003年7月28日资料)，严重威胁人类的健康，影响着社会发展和经济建设的正常进行。对SARS的预防、诊断、治疗成为医药学界紧急而重要的任务．     

一种快速连接及筛选重组阳性克隆的简便方法

目前 ,生命科学的各个领域已深入到分子生物学水平 ,在将外源基因向质粒载体的克隆过程中 ,常规方法操作的步骤繁琐 ,花费时间长 ,若忽略一些细小因素可导致克隆失败。本实验室在长期的分子克隆工作中 ,积累了一些经验 ,建立了一种快速连接及筛选重组阳性克隆的简便方法。我们以紫杉烯合酶 (taxadienesynthase ,TS)基因向真核表达载体pIGF2中的克隆为例 ,报告如下 ,以供在条件简易情况下的工作者参考使用。1　材料与方法1.1　材料真核表达载体pIGF2由英国Norwich食品研究所Jeenes博士赠送的 pIGF质粒衍生而来。限制性内切酶购于中国协…     

中国红豆杉紫杉烯合成酶cDNA克隆(简报)

紫杉烯合成酶(taxadiene synthase)是抗癌药物紫杉醇生物合成途径的第一个酶,也是关键酶,在红豆杉植物体内催化生成紫杉醇的母核--紫杉烯;它在植物体内低水平的表达和低酶活力被认为是紫杉醇在植物体内含量低微的重要因素.Wildung等已经得到了太平洋红豆杉(Taxus brevifolia)紫杉烯合成酶的cDNA及其核苷酸顺序,长度为2 700 bp,开放阅读框架为2 586 bp,其中包括编码137个氨基酸残基的质体转移肽和725个氨基酸残基的紫杉烯合成酶肽链.我们过去的研究得到一中国红豆杉(T.chinensis)高产紫杉烷类化合物的愈伤组织细胞系,并构建了它的cDNA文库,克隆载体为λgt10.