人子宫内膜基质细胞及腺上皮细胞的分离纯化和体外培养

目的：建立人子宫正常内膜、内膜异位症在位及异位子宫内膜的基质及腺上皮细胞分离、培养的方法，为进一步研究子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：15例正常子宫内膜、15例在位子宫内膜及10例异位内膜经胶原酶消化、筛网过滤、差时贴壁等技术进行分离、纯化和体外培养，光镜观察，应用鼠抗人波形蛋白抗体、鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色对间质及上皮细胞进行鉴定。结果：正常子宫内膜和子宫内膜异位症在位子宫内膜标本分离、培养均成功；5例异位内膜标本获得成功．基质细胞和腺上皮细胞纯度均可达95％以上，并均可传代。结论：采用酶解、筛网分离及贴壁能获得纯度较高的基质与腺上皮细胞。人子宫内膜细胞分离体外培养的成功，有助于研究子宫内膜异位症的发病机制．为临床实验提供重要的理论依据．     

子宫内膜异位症在位子宫内膜间质及腺上皮细胞高纯度分离培养技术的改进

目的对子宫内膜异位症(EMs)患者在位子宫内膜间质及腺上皮细胞进行高纯度分离、培养,改进子宫内膜细胞常规培养方法。方法通过酶解、过滤及贴壁纯化,分离和培养7例EMs组及5例正常组在位子宫内膜间质及腺上皮细胞,其中延长EMs组子宫内膜细胞消化时间及缩短其后的贴壁等待时间。结果 12例子宫内膜标本中10例培养成功,原代培养的间质细胞纯度率可达97%以上,原代培养的腺上皮细胞纯度率约95%。改良分离方法后获得的EMs组和正常组的间质及腺上皮细胞纯度及活性均提高。结论 EMs在位子宫内膜分离过程中延长消化时间及缩短贴壁时间,可作为对子宫内膜常规培养方法的改进。     

改良式筛网法人子宫内膜细胞的分离与纯化

目的探讨改良式筛网法在分离子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞中的应用价值。方法通过高浓度胶原酶结合不同浓度、时间消化、过滤及贴壁纯化等技术,应用筛网分离法培养各15例子宫内膜腺上皮和间质细胞,并传代。结果改良式筛网分离法培养中的15例标本中,腺上皮细胞和间质细胞成功率分别为93.3%和93.3%;分离出的腺上皮细胞及间质细胞可体外培养,经分离纯化后腺上皮细胞纯度>90%,间质细胞纯度>98%;两种细胞经传代后间质细胞成功率92.9%;腺上皮细胞传代培养后活力下降,成功率14.3%。结论通过改良式筛网分离法能获得纯度较高的腺上皮细胞与间质细胞;间质细胞可行传代培养;腺上皮细胞传代培养后活力下降,不宜传代。     

一种新的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离纯化及培养方法的探讨

目的:建立一种简捷的分离纯化培养子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的方法。方法:选择子宫全切育龄妇女的新鲜子宫内膜组织,经单酶消化、二次筛网过滤及贴壁纯化技术分离纯化培养人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,光镜及免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。结果:腺上皮细胞漩涡状生长,细胞呈蝌蚪形或类圆型,细胞角蛋白19免疫组化染色阳性,纯度可达92%。基质细胞呈平行状生长,细胞呈梭形或多角形。波形蛋白免疫组化染色阳性,纯度达95%以上。每例子宫肌瘤切除标本可获得(10～25)×106原代基质细胞和(4～6)×106原代腺上皮细胞。结论:该培养方法可获得高产量的纯化的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。     

人正常子宫内膜原代腺上皮细胞的优化分离和培养

目的 优化人正常子宫内膜腺上皮细胞分离和原代培养的方法,提供子宫内膜相关疾病研究的体外细胞模型。方法 采用酶消化、筛网过滤、离心的方法体外分离和培养人子宫内膜腺上皮与间质细胞。腺上皮细胞鉴定采用光学显微镜下观察细胞形态;免疫细胞荧光及免疫细胞化学法检测上皮细胞角蛋白(CK)和间质细胞波形蛋白(Vim)的表达。结果 经诊刮获得的18份标本中有17份分离培养成功;细胞形态符合腺上皮细胞特征,CK免疫荧光及免疫化学染色阳性,Vim染色阴性,纯度达90%以上;正常原代人子宫内膜腺上皮细胞不能传代,培养5～6d后细胞逐渐衰老。结论 改良后的原代培养方法取材简单,克服了污染问题,可获得高纯度及足够数量的人正常子宫内膜腺上皮细胞作为体外实验模型。     

高纯度子宫内膜腺上皮细胞的体外分离和培养

目的:在体外建立子宫内膜腺上皮细胞原代分离和培养的方法,以获得高纯度子宫内膜腺上皮细胞。方法:选择正常子宫内膜组织,通过消化、过滤、选择性贴壁和二次消化等技术进行体外培养。结果:采用胶原酶二次消化法和选择性贴壁法成功实现子宫内膜腺上皮细胞的高纯度分离和原代培养。结论:采用胶原酶二次消化法和选择性贴壁法可高纯度分离子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞。     

原代人子宫内膜细胞分离及培养鉴定

目的：探究原代人子宫内膜细胞分离及培养的简易方法,并对其纯度及生物活性进行鉴定。方法采用胶原酶消化人子宫内膜组织,经2次筛网过滤、离心及贴壁纯化技术,分离、纯化培养人子宫内膜间质细胞（ESC ）和腺上皮细胞（EEC ）,用细胞角蛋白（cytokeratin）和波形蛋白（vimentin）免疫细胞化学染色法和免疫荧光方法对所分离的细胞进行鉴定。结果 ESC呈平行生长,细胞呈梭形或多角形,波形蛋白抗体免疫细胞化学染色呈阳性,纯度达95％以上。EEC呈漩涡状生长,细胞呈多角形或蝌蚪形,细胞角蛋白抗体免疫细胞化学染色呈阳性,纯度可达90％。结论应用胶原酶消化法及二次筛网过滤法成功分离并培养数量、活力和纯度高的子宫内膜细胞,可操作性强,可供具备基本细胞培养条件的实验室进行推广。     

分离培养子宫内膜腺上皮和间质细胞方法的改进

目的:探索一种获得高产量、高纯度子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的分离培养方法.方法:通过高浓度胶原酶和DNase联合消化、过滤及贴壁纯化等技术,分离培养30例子宫内膜腺上皮和间质细胞,并拟传代.结果:29例标本培养成功,每1g子宫内膜组织约可分别得到(40～50)×106个腺上皮细胞和(40～50)×106个间质细胞,细胞产量高.并且腺上皮细胞纯度率约96%,间质细胞纯度率达98%以上.间质细胞可以有限传代,腺上皮细胞不能传代.结论:通过改良步骤,可提高腺上皮和间质细胞产量,同时保证了其纯度及活性,不失为一种较理想的子宫内膜细胞分离培养方法.     

室温酶解结合差速离心法分离子宫内膜腺上皮细胞及活性评估

目的 探讨室温酶解结合改良式差速离心法分离培养人子宫内膜腺上皮细胞的效果及细胞活性评估.方法 选择子宫腺肌症患者在位增殖晚期及分泌期内膜10例,所得内膜分为两份,一份采用室温酶解结合改良式差速离心法（改良组）分离,一份采用37℃水浴消化结合筛网法（对照组）分离,通过细胞计数、细胞免疫化学及MTT法分别比较两种方法分离培养子宫内膜腺上皮细胞的数目、纯度及细胞生长活性.结果 两组中10份标本均获得成功;改良组每g内膜组织可得到（9±1.7）×10^7个腺上皮细胞,免疫细胞化学角蛋白表达阳性,纯度达（97.8±0.002）％;对照组可得到（3.9±0.78）×10^7个腺上皮细胞,角蛋白表达阳性,纯度达（88.6±0.006）％,改良组分离的腺上皮细胞数量和纯度均明显高于对照组（P＜0.05）.MTT结果显示改良组细胞在对数生长期生长活性明显高于对照组（P＜0.05）.结论 采用室温酶解结合改良式差速离心法可高纯度分离子宫内膜腺上皮细胞,并且细胞数量多,活性好,可用于子宫内膜疾病的药物干预及机制学的研究.     

小鼠子宫内膜上皮细胞的分离和原代培养

目的 建立一种高效的子宫内膜上皮细胞分离和体外培养方法,为子宫疾病的发病机制或治疗药物筛选的进一步研究提供一个比较理想和有价值的的实验模型.方法 用酶消化、过滤、离心与差速贴壁纯化相结合的方法分离培养小鼠子宫内膜上皮细胞,以上皮细胞角蛋白为抗原的免疫荧光法对分离培养的细胞进行纯度鉴定.结果 小鼠子宫内膜上皮细胞培养4～...     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学性质

目的：建立人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）分离培养方法,观察细胞形态,探讨BM-MSCs生物学特征。 方法：从人骨髓中利用Percoll分离有核细胞,培养于含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中,台盼蓝拒染法测定细胞增殖状态。应用流式细胞仪测定细胞周期及细胞表面抗原特征。 结果;BM-MSCs具有纤维样细胞形态特征,独特的表型,即CD29、CD44、CD166和HLA-ABC阳性,CD34、CD45和HLA-DR阴性;细胞周期分析显示：12.8%处于S期,76.4%处于G₀/G₁期;细胞生长倍增时间为2~3 d。 结论：BM-MSC_S是一群均一的单克隆细胞,具有独特的增殖特征及表面标记。     

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986     

体外诱导细胞转化为胰岛细胞的研究进展

巢素蛋白（nestin）阳性细胞、成体干细胞（包括间充质干细胞和胰腺导管上皮细胞）和胚胎干细胞是常用的体外诱导转化为胰岛细胞的种子细胞,本文就这三类细胞的来源、实验方法及实验结果的研究进展进行综述。     

动员人外周造血祖细胞定向诱导树突状细胞

目的 探讨由动员人外周造血祖细胞体外培养扩增获得的树突状细胞（DC）的生物学特性, 为临床应用肿瘤树突状细胞疫苗建立制备方法。方法 用CS-3000血细胞分离机分离预经干细胞动员的患者外周血单个核细胞（PBMC）,去除淋巴细胞和单核细胞,阴性选择得到外周造血祖细胞,加入rhGM-CSF和rhIL-4培养10~14 d成为树突状细胞,然后进行形态学检测、细胞表型和T细胞刺激能力分析。结果 由外周造血祖细胞来源的树突状细胞可以达到(0.5~1.0)×108数量级;高倍镜和电镜照片显示典型的树突状细胞形态和超微结构;流式细胞仪分析显示细胞高表达HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原和共刺激分子CD80、CD86;同种混合淋巴细胞反应显示细胞具有高效的刺激静止T淋巴细胞活化增殖的能力。结论 用血细胞分离机分离动员外周造血祖细胞体外定向诱导制备树突状细胞可以作为制备肿瘤疫苗的新途径。     

外源性褪黑激素对小鼠生精细胞凋亡的影响

目的 观察褪黑激素对生精细胞凋亡的影响。方法 HE染色、TUNEL测定(核快红复染)。结果 HE染色下睾丸间质细胞的面积随褪黑激素的增多而减小，与睾酮的浓度变化相一致。TUNEL阳性细胞随褪黑激素的增加有增多的趋势，但超过一定量后(100ug)，不再增多。20～30d的处理组呈现与30～40d的处理组不同的结果。结论 外源性褪黑激素具有促进生精细胞凋亡的作用。这种作用与其对睾酮的抑制作用不相一致。     

大鼠肝星状细胞的分离培养鉴定

目的改良分离培养大鼠肝星状细胞的简便方法。方法经过门静脉插管、推注肝素稀释液、肝脏灌流、胶原酶离体循环消化、过滤、离心分离等步骤,分离肝星状细胞,省去了链霉蛋白酶E消化过程,采用台盼蓝染色排斥法鉴定细胞活率,desmin免疫细胞化学染色法鉴定HSCs纯度。结果每只鼠肝HSCs的得率为0.5~1.0×107,纯度为(92.2±2.0)%,活率为(97.8±0.3)%,数量及活率均符合实验要求。结论该方法简便、廉价、实用,值得进一步探索。     

体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的体外分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其一般的生物学特性.方法通过密度梯度离心法分离MSCs、体外培养传代细胞计数、流式细胞仪检测细胞增殖周期、表面分子测定以及细胞化学染色了解人MSCs一般的特点.结果人MSCs经过体外培养均一地表达CD29、CD44、CD166,而CD34、CD45阴性.细胞化学结果显示,细胞糖原(PAS)强阳性,脂肪(SB)为阴性,5%～10%细胞碱性磷酸酶(ALP)阳性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G2/M所占比例分别为83.11%、5.17%和11.72%.分离细胞在成骨诱导体系下进一步向成骨细胞分化.结论密度梯度离心法能够分离纯化MSCs有其特殊的生物学特点,能够向成骨细胞分化.     

人BMSCs移植小鼠睾丸后向Leydig细胞或产类固醇激素细胞诱导分化的实验研究

目的 研究人体骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）在体内条件下能否向Leydig细胞或产类固醇激素细胞定向诱导分化,及是否发生免疫排斥反应。方法 将分离培养获得的第3代BMSCs经核荧光标记物标记后,制备成细胞悬液,注射至经二甲磺基乙烷(EDS)处理后的20只BALB/c小鼠睾丸内。从移植BMSCs前1 d开始,每隔2 d处死1只小鼠,测尾静脉游离睾酮浓度,对照组为同期未作任何处理BALB/c小鼠20只。同时睾丸组织经荧光显微镜摄片,追踪观察BMSCs,行3β-羟类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)单克隆抗体和鼠抗人细胞核单克隆抗体双重免疫荧光检测,寻找3β-HSD和鼠抗人细胞核单克隆抗体荧光染色均阳性的细胞。结果 EDS对小鼠Leydig细胞有一定杀伤作用;采用睾丸网注射法行人BMSCs移植小鼠睾丸获得了成功,未见免疫排斥反应;移植BMSCs后的睾丸组织未检测到3β-HSD和鼠抗人细胞核单克隆抗体免疫荧光染色均阳性的细胞。结论 采用人BMSCs移植小鼠睾丸的方法获得成功,未见免疫排斥反应,移植后的BMSCs未向Leydig细胞或产类固醇细胞定向分化。     

Mechanism of in Vitro Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells into Neuron-like Cells

Marrowstromalcells (MSCs)arethenon hematopoieticprecursorsinthebonemarrowstromaofadultmammal.Underspecificexperimentalcondi tions,itcandifferentiateintoneuron[1] .Thephe nomenonhasgivenresearchersagreatsurprise .Andnow ,thehotspotistofinditstrueevidence ,…