脱蛋白骨联合VEGF基因转染治疗股骨头缺血坏死

目的探索一种新的方法治疗股骨头早期缺血性坏死（avascular necrosis of the femoral head,AVNFH）。方法69只AVNFH造模成功后的新西兰大白兔随机分成3组。第1组,将脱蛋白骨（deproteinized bone,DPB）复合pcDNA3．1／VEGF165质粒植入坏死的股骨头内,第2组植入DPB,第3组仅在股骨头内钻一隧道。术后3d,1、2、4、8和16周获取标本。RT—PCR、Western blot和免疫组化技术分别检测VEGF165 mRNA、蛋白的表达及安全性。X线大体观察成骨情况,组织形态学分析血管发生和股骨头修复。结果第1组VEGF165 mRNA和蛋白表达术后1周达到高峰,时间持续超过3周,第1组动物术后远膈脏器未检测到VEGF165的表达。血管形成术后2,4周增加,骨形成术后2,4和8周增加,与另两组相比差异有显著性（P〈0．01）。结论VEGF165基因转染可促进局部血管的早期形成,DPB-VEGF复合物可增加骨形成,VEGF基因治疗兔AVNFH有效、安全,脱蛋白骨联合VEGF165基因治疗为骨坏死的修复提供了理论基础。     

pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染骨髓内皮祖细胞后VEGF165的表达

目的:培养和鉴定大鼠内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs),观察pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染大鼠骨髓内皮祖细胞后内皮细胞生长因子165(Vascular endot-helial growth fator-165,VEGF165)的表达.方法:体外培养内皮祖细胞,以免疫细胞化学法检测其表面抗原(CD34、CD133、KDR)的表达.通过pcDNA3.1(+)质粒转染VEGF165后,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测内皮祖细胞培养上清液中VEGF蛋白的水平,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内皮祖细胞中VEGF165mRNA的表达.结果:免疫细胞化学检测表明培养的细胞为大鼠内皮祖细胞,PCR后凝胶电泳显示pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染组在576 bp处可见有明显条带,pcDNA3.1(+)空质粒转染组和未转染组可见微弱的电泳带位于500 bp与600 bp之间,约576bp大小.ELISA检测结果为pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染组上清液中VEGF165水平为(175.8±10.7)pg/ml,pcDNA3.1(+)空质粒组为(10.5±1.6)pg/ml,未转染组为(9.3±1.3)pg/ml.结论:内皮祖细胞体外培养有微量VEGF165表达,应用pcDNA3.1(+)/VEGF165载体转染,可使SD大鼠内皮祖细胞高效表达VEGF165.     

bFGF复合PDPB修复股骨头缺损的实验研究

目的:模拟临床上治疗股骨头坏死的开窗法的手术过程制备缺损模型,并植入bFGF/PDPB(碱性成纤维细胞生长因子+部分脱蛋白骨),以探bFGF对股骨头缺损的治疗作用.方法:成年健康新西兰白兔24只,切开关节囊,在头颈交界处开窗,建立缺损模型.48侧股骨头随机分为3组:A组植入bFGF/PDPB;B组植入PDPB;C组为空白对照.术后2、4、8周处死动物,制备墨汁灌注标本,样本行X线及病理学观察,骨钙含量测定,并进行图像分析.结果:X线、病理学观察及图像分析结果表明:A组在术后2、4周和8周股骨头缺损区修复组织无论在血管生成方面还是在新生骨组织的质量方…     

c-myc通过提高结肠癌细胞LoVo的HIF-1α表达促进血管生成

目的 研究癌基因c-myc对人结肠癌细胞LoVo中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的影响及其对血管生成的作用.方法 构建高表达c-myc的质粒pcDNA3.1-c-myc;将构建好的pcDNA3.1-c-myc质粒转染入LoVo细胞系中,通过Western blot检测c-myc在LoVo细胞中的表达情况.应用real-time PCR和Western blot检测常氧和乏氧状态下LoVo细胞系中HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA水平及HIF-1α的蛋白水平.应用条件培养液培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),观察其形成血管的能力.结果 成功构建pcDNA3.1-c-myc质粒;常氧、乏氧状态下转染pcD-NA3.1-c-myc质粒后,LoVo细胞系中HIF-1α的mRNA水平无变化,VEGF的mRNA水平明显升高,HIF-1α蛋白水平明显增高.高表达c-myc的LoVo细胞上清液培养HUVECs细胞后能增强其成管能力.结论 在LoVo细胞系中高表达c-myc,可以促进细胞HIF-1α和其下游的VEGF表达,从而促进血管生成.     

正、反义VEGF基因转染对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖行为的影响

目的探讨正、反义血管内皮生长因子(VEGF)基因对人增生性瘢痕成纤维细胞(HHSFb)增殖行为的影响。方法采用组织块法获取HHSFb,行细胞免疫化学鉴定。构建靶向VEGF基因pcDNA3.1(+)/hVEGF165(正义组)、pcDNA3.1(-)/hVEGF165(反义组)和空质粒pcDNA3.1(+)(空载体组)转染人成纤维细胞,以及未行转染处理的人成纤维细胞(对照组),共设为4组。经G418筛选获得阳性转染细胞克隆。逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)显示VEGF基因在细胞内的表达,上清行酶联免疫吸附反应(ELISA)检测VEGF蛋白表达水平,MTT测定细胞体外生长情况。结果成功构建正、反义VEGF基因表达载体。经统计学分析,与对照组和空载体相比,正义组VEGF mRNA表达增强,蛋白表达增强;反义组VEGF mRNA表达明显减弱,蛋白表达明显降低。MTT结果显示,转染前后细胞体外生长速度基本一致。结论正义VEGF基因重组质粒对HHSFb内源性VEGF的表达有促进作用,反义VEGF基因重组质粒可有效抑制HHSFb内源性VEGF的表达。     

VEGF165真核表达载体的构建及其在鼠膀胱平滑肌细胞的表达

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF165)真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165,转染鼠膀胱平滑肌细胞并检验其生物学活性.方法 将VEGF165 cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(-),构建真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165;并转染入鼠膀胱平滑肌细胞,采用RT-PCR和免疫荧光染色检测VEGF165基因在鼠膀胱平滑肌细胞中的表达,并用MTT法检测转染后细胞上清液中VEGF165的生物学活性.结果 和结论将构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165转染入鼠膀胱平滑肌细胞后,VEGF的表达增高,转染后细胞上清液具有促使内皮细胞增殖的生物学活性.     

VEGF165和VEGF165b真核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人血管内皮生长因子(VEGF)165和VEGF165b真核表达质粒,为VEGF165和VEGF165b功能研究奠定基础.方法:应用RT-PCR方法从人肺腺癌A549细胞中获得并扩增VEGF165 cDNA,双酶切后与真核表达载体pcDNA3.0连接,构建重组质粒pcDNA3.0-VEGF165,酶切、PCR及...     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.     

干扰 Krüppel 样因子 8表达对肝癌 SMMC7721细胞中血管生成相关因子的调控作用

目的：构建Krüppel样因子8（Krüppel-like factor 8,KLF8）的真核表达质粒及干扰质粒,考查KLF8对人肝癌SMMC7721 细胞中血管生成相关因子的调控作用。方法：构建KLF8的真核表达质粒pcDNA3.1-KLF8,测序确认。构建靶向不同KLF8干扰位点的干扰质粒pGPU6/GFP/Neo-KLF8,筛选出干扰效率最高的pGPU6/GFP/Neo-KLF8。将pcDNA3.1-KLF8、相应的对照质粒 pcDNA3.1,pGPU6/GFP/Neo-KLF8、相应的对照质粒pGPU6/GFP/Neo-ShNC 分别转染人肝癌SMMC7721细胞,共４组。实时荧光定量PCR及Western blot检测KLF8的表达,qPCR检测各组细胞中低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor,HIF）1-α、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、血管生成素（angiopoietin,Ang）1、Ang2、血管生成素受体Tie2及基质金属蛋白酶（matrix metallo-proteinase,MMP）2的mRNA表达。结果：pcDNA3.1-KLF8显著上调KLF8表达（相对表达量为68.8±6.5）,pGPU6/GFP/Neo-KLF8下调KLF8的表达（相对表达量 0.31±0.01）。转染pcDNA3.1-KLF8组与其对照组相比,VEGF、Ang2、HIF1-α及MMP2 mRNA表达增加（P<0.05）,血管生成素受体Tie2、Ang1的mRNA表达无差异（P ＞0.05）;转染pGPU6/GFP/Neo-KLF8组与其对照组相比,Ang2和HIF1-α表达降低（P<0.05）,VEGF、血管生成素受体Tie2、Ang1及MMP2的表达无差异（P ＞0.05）。结论：在肝癌中,KLF8可能通过调控VEGF、Ang2、HIF1-α及MMP2来调控血管生成。     

不同应力对坏死股骨头自身修复过程中血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨不同应力刺激下犬股骨头缺血性坏死后自身修复过程中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白及mRNA的表达变化及意义.方法 健康比格犬24只,通过液氮冷冻法制成犬股骨头坏死,并对坏死股骨头施以不同的应力,根据承受应力环境不同分为低高及中应力组(B、C、D组).对照组(A组)股骨头不做处理.分别于术后4、8周处死实验犬,取股骨头标本,行HE染色观察组织病理学改变,免疫组化染色及定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测VEGF蛋白及mRNA的表达变化.结果 HE染色提示:D组关节软骨、骨小梁的结构和形态较B、C组改善;免疫组化提示:D组股骨头内VEGF蛋白面积积光度在术后第4、8周显著高于其他各组;RT-PCR检测最示:D组股骨头VEGF mRNA的表达率在术后第4、8周高于其他各组,第8周高于第4周(均P＜0.05).结论适当的应力刺激能有效促进犬股骨头骨组织中VEGF蛋白及mRNA的表达,进而有助于促进血管的新生和软骨下骨的重建,可能有利于坏死股骨头的修复.     

Vascular endothelial growth factor gene transfection to enhance the repair of avascular necrosis of the femoral head of rabbit

Avascularnecrosisofthefemoralheadisadebilitatingdiseasethatusuallyleadstodestructionofthehipjointandincreasingmusculoskeletalmorbidityinyoungandmiddleagedpatients Totaljointreplacementiscommonlyusedtotreatdisablingsecondaryosteoarthrosis Althoughthemostrecentimprovementsintotalhipreplacementmaydecreasefailure,thepatientsareusuallyyoungandcurrenthipprostheseswon’tfunctionwellfortheremaininglifeexpectancyofthesepatients Thus,it’snecessarytodelayoreliminatetheneedforhipreplacementbytreatingthis…     

基因修饰的成骨细胞经髓芯减压移植治疗早期股骨头缺血性坏死的实验观察

目的 评价重组人肝细胞生长因子(hHGF)基因修饰的成骨细胞经髓芯减压移植促进早期股骨头缺血坏死的血管新生及局部骨修复的效果.方法 二步酶消化法和差速贴壁法分离培养胎兔成骨细胞,利用脂质体介导hHGF基因转染成骨细胞,然后通过髓芯减压移植于兔缺血坏死的股骨头内,同时设置单纯细胞移植组和髓芯减压组,于术后第2、4、8周通过CT、组织学和微血管墨汁灌注等观察血管形成及成骨情况.结果 分离培养的胎兔成骨细胞经Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶鉴定纯度较高.hHGF基因转染成骨细胞体外及体内检测均有hHGF蛋白的表达.通过髓芯减压移植细胞8周后转基因组和单纯成骨细胞组的新生骨小梁与单纯髓芯减压组比较有差异性,而术后2、4周转基因组的新生血管数(29.5±1.6)和(34.0±1.7)较对照组(20.6±1.9)和(25.6±2.2)差异有统计学意义(P＜0.01).结论 转染hHGF基因的成骨细胞移植于缺血坏死的股骨头后,早期可促进血管新生,并增加骨形成,显著促进坏死骨修复.     

血管内皮细胞生长因子165基因转染对兔骨缺损修复的影响

目的 构建pcDNA3．1-血管内皮细胞生长因子（VEGF）165质粒,观察其对兔骨缺损修复的影响。方法构建成重组真核表达质粒pcDNA3．1-VEGF165;采用30只新西兰大白兔,制备双侧桡骨骨缺损模型,实验组以体积等大的明胶海绵置于创腔,局部直接注射稀释的质粒液200ng;对照组以同量生理盐水代替质粒液,同法处理。于术后1、2、4、6、8和12周行X线照片后获取标本,观察缺损局部组织修复及新生血管并计算微血管密度（MVD）。结果pcDNA3．1-VEGF165质粒构建成功,测序正确。术后X线：1周时两组无明显差别,实验组2周骨痂形成、骨质修复,12周时骨质已正常,对照组表现为修复迟缓;HE染色：实验组2周大量新生血管形成、通血,4周成骨细胞大量增殖、骨小梁形成,12周骨皮质改建完成,骨髓腔再通;对照组经历过程类似,但相对时间延迟,12周时骨髓腔及皮质改建尚未完成。2周时对照组及实验组MVD分别为56．1±6．1、69．1±5．4,均较1周时42．2±6．4、47．0±7．5时增加,组间及组内间差异有统计学意义（t=8．0347,P=0．0000）。结论骨缺损局部直接应用PcDNA3．1-VEGF165质粒液后,可表达并上调VEGF165,具有促进局部微血管形成、加快骨缺损修复的作用。     

Experimental Study of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Therapy for Avascular Necrosis of the Femoral Head

Avascularnecrosisofthefemoralheadisanin creasingcauseofmusculoskeletalmorbidityinyoungandmiddleagedpersons It’sadebilitatingdiseasethatusuallyleadstodestructionofthehipjoint To taljointreplacementiscommonlyusedtotreatdis ablingsecondaryosteoarthrosis Althoughthemostrecentimprovementsintotalhipreplacementmayde creasethefailure ,thepatientsareusuallyyoungandthecurrenthipprothesiswouldn’tfunctionwellfortheremaininglifeexpectancyforthesepatients Forthisreason ,it’snecessarytodelayoreliminatethe…     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞的表达

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞并鉴定

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

纤维蛋白胶复合BMP治疗兔股骨头缺血性坏死的实验研究

【目的】通过局部植入骨形态发生蛋白（BMP），探索股骨头缺血性坏死早期治疗的新方法。【方法】连续肌肉注射地塞米松制造股骨头缺血性坏死（ANFH）的动物模型，将实验动物分为A，B，C3组，于股骨头下钻孔，在A组和B组分别将BMP／FS或单纯的BMP植入孔道，C组作为空白对照。通过大体观察、MRI检查、钙含量测定和组织学观察，研究复合材料对ANFH的修复作用。【结果】MRI观察显示，植入BMP／FS8周后原骨缺损孔道消失，被新生骨所取代。单纯植入BMP可见少量新生骨，空白对照组内仍为纤维组织。A组钙含量显著高于另外两组。组织形态学观察可见A组术后8周原骨缺损区基本消失，有大量相对较成熟的骨小梁及板状骨并存。B组骨缺损区明显缩小，周边亦有少量骨小梁存在，新生毛细血管少见，缺损区有大量纤维组织填充。C组术后8周缺损区缩小，周边有少量新骨形成并逐渐形成骨壁，中心部仍为纤维组织，无骨组织充填。【结论】BMP在缺血坏死的股骨头内可诱导新骨形成，与FS复合后，BMP诱导新骨形成的质量和数量均明显提高，局部植入BMP／FS对ANFH具有良好的修复作用。     

BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR GENE TRANSFECTION TO ENHANCE THE REPAIR OF AVASCULAR NECROSIS OF THE FEMORAL HEAD

A VASCULAR necrosis of the femoral head usually leads to destruction of the hip joint, increasing musculoskeletal morbidity in young and middle aged patients. Total joint replacement is commonly used to treat disabling secondary osteoarthrosis. Although most recent improvements in total hip replacement may decrease the failure, patients are usually young and the current hip prothesis function would not fulfill purpose for the remaining life ex-pectancy for these patients. So it is necessary…