神经前体细胞的分离培养及绿色荧光蛋白基因的转染

[目的]为替换中枢神经损伤后死亡的神经元提供方便追踪观察的神经前体细胞.[方法]应用含碱性成纤维生长因子(bFGF)的无血清培养技术,从新生大鼠海马组织分离培养神经前体细胞,并借助免疫组织化学技术检测这些细胞巢蛋白(nestin)的表达以及细胞分化后神经丝蛋白(NF)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.采用磷酸钙法将绿色荧光蛋白(GFP)基因转染目的细胞内.[结果]从海马组织分离的细胞具有分裂能力,能表达nestin.分化后一些细胞能表达NF,而另一些细胞则表达GFAP.GFP基因修饰的细胞能发出荧光.[结论]从海马组织分离的细胞能表达nestin,属于神经前体细胞,它们具有明显的增殖能力.有些神经前体细胞已经分化为神经元和神经胶质细胞.GFP基因已成功转染到神经前体细胞内,并表达了GFP.     

非病毒载体负载增强型绿色荧光蛋白转染永生化神经前体细胞

目的:寻找能高效转染永生化神经前体细胞(INPC)的非病毒载体,观察转染后增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达.方法:用阳离子脂质体Lipofectamine 2000,TRANSfection或阳离子聚合物Sofast分别负载质粒EGFP-C1转染INPC,利用荧光显微镜检测转染后24 h的转染效率.对转染效率最高的一种载体,观察其转染后12,24,48和72 h转染效率,确定EGFP表达最高峰.用台盼蓝排斥试验检测转染和未转染细胞的活力.质粒EGFP-C1转染INPC后,经G418筛选,挑选细胞克隆,命名为INPC/EGFP,观察其EGFP阳性率.应用巢蛋白抗体鉴定INPC/EGFP.50 mL/L胎牛血清诱导INPC/EGFP分化,观察分化后细胞的形态及EGFP表达.结果:Lipofectamine 2000,TRANSfection和Sofast转染INPC后24 h,转染效率分别为(25.5±2.9)%,(4.0±1.7)%,(7.9±1.4)%.Lipofectamine 2000的转染效率最高.其转染后12,24,48和72 h的转染效率分别为(17.1±0.7)%,(25.5±2.9)%,(19.4±0.9)%,(15.6±1.4)%,EGFP在转染后24 h表达最高.INPC/EGFP中,EGFP阳性率约为95%.INPC/EGFP巢蛋白表达阳性,其分化后呈神经元或星形胶质细胞样,且胞体及突起中仍可见绿色荧光.结论:Lipofectamine 2000可高效转染INPC.EGFP是INPC理想的示踪方法之一.     

神经前体细胞的分离培养及绿色荧光蛋白基因的转染

目的 为替代中枢神经损伤后死亡的神经元提供方便追踪观察的神经前体细胞。方法 应用含碱性成纤维生长因子(bFGF)的无血清培养技术,从新生大鼠海马组织分离培养神经前体细胞,并借助免疫组织化学技术检测这些细胞巢蛋白（nestin)的表达以及细胞分化后神经丝蛋白（NF）和胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。采用磷酸钙法将绿色荧光蛋白（GFP）基因转染目的细胞内。结果 从海马组织分离的细胞具有分裂能力,能表达nestin。分化后一些细胞能表达NF,而另一些细胞则表达GFAP。GFP基因修饰的细胞能发出荧光。结论 从海马组织分离的细胞能表达nestin,属于神经前体细胞,它们具有明显的增殖能力,有些神经前体细胞已经分化为神经元和神经胶质细胞。GFP基因已成功转染到神经前体细胞内,并表达了GFP。     

缺氧诱导因子-1α与绿色荧光蛋白在神经干细胞中的共表达

目的:以携带缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)及绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的腺病毒转染大鼠神经干细胞(Neural stem cells,NSCs),观察HIF-1α和GFP在NSCs中的表达以及对NSCs生物学特性的影响,为HIF-1α基因转染的NSCs移植治疗缺血性脑血管病提供物质基础.方法:利用携带HIF-1α和GFP基因的重组腺病毒转染NSCs,相差显微镜下观察NSCs的形态及在荧光显微镜下观察NSCs及其诱导分化后的GFP表达情况;观察HIF-1α基因在NSCs中的表达;并检测NSCs的细胞活性.应用免疫荧光技术检测神经干细胞及其诱导后分化细胞的特异性蛋白巢蛋白(Nestin)、神经微丝蛋白(Neurofilament protein)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP).结果:重组腺病毒转染NSCs后外源性基因及绿色荧光蛋白有持续稳定表达;转染后的NSCs的形态学、细胞活性和分化能力等与未转染的NSCs无明显差异(P＞0.05);检测神经元标志物神经微丝蛋白和胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白,证实转染后的NSCs仍然具有多向分化潜能.结论:NSCs转染携带HIF-1α和GFP基因的重组腺病毒后能够持续、稳定地表达HIF-1α和GFP,生物学特征正常.     

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34^＋细胞

目的研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34^ 细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞，免疫磁性分离仪纯化CD34^ 细胞，重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞，并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达，流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32．8％，CD34^ 细胞的基因转导效率最高为25％．在所观察的时间内，转染率呈先升高后降低趋势。结论重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34^ 细胞，绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因，为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。     

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34+细胞

目的 研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34⁺细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法 用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞,免疫磁性分离仪纯化CD34⁺细胞,重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞,并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果 荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32.8%,CD34⁺细胞的基因转导效率最高为25%,在所观察的时间内,转染率呈先升高后降低趋势。结论 重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34⁺细胞,绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因,为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。     

GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的重组杆状病毒载体.方法 将目的 基因(EGFP和GDNF)克隆人杆状病毒表达载体pFastBacDual中,构建重组质粒pFB-EGFP-GDNF并予酶切鉴定;将pFB-EGFP-GDNF转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,获得重组杆状病毒载体Bacmid-EGFP-GDNF,抽提质粒并行PCR鉴定;脂质体转染法将Bacmid-EGFP-GDNF转染Sf9细胞包装病毒;免疫荧光法检测Sf9细胞EGFP和GDNF蛋白表达.结果 目的 基因片段正确插入pFastBacDual载体中;重组Bacmid正确;Bacmid-EGFP-GDNF包装转染成功,获得较高病毒滴度;免疫荧光检测表明,Sf9细胞中GDNF和EGFP蛋白共表达.结论 成功构建重组杆状病毒Bacmid-EGFP-GDNF,转染SD细胞共表达GDNF和EGFP蛋白,为进一步研究GDNF蛋白对内耳的保护作用奠定了实验基础.     

表达绿色荧光蛋白的重组1型禽腺病毒的构建

目的 构建表达绿色荧光蛋白的重组禽腺病毒.方法 通过带有禽腺病毒基因组复制非必需区(nt40065～nt43684)侧翼序列和增强型绿色荧光蛋白基因的转移质粒与亲本禽腺病毒在鸡肝癌细胞内同源重组,缺失掉了两侧翼序列之间的复制非必需区而替换为增强型绿色荧光蛋白基因的完整表达盒.为提高同源重组率,对质粒转染细胞的条件进行了摸索,确定了最佳转染条件为细胞以3×105/ml密度接种到6孔板上,36h后用8μl lipofectamine 2000试剂和3μg pUC-LR-eGFP质粒转染,蚀斑方法筛选重组病毒.结果 获得了表达EGFP的重组病毒单一克隆株rFAV-Ⅰ-eGFP.结论 研究结果为开展禽类活载体疫苗研制及相关基础研究提供了有利参考.     

人BDNF和GFP基因共表达慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的 构建人脑源性神经营养因子(hBDNF)与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的慢病毒载体并转染神经干细胞(NSCs).方法 运用基因重组技术,将hBDNF基因连接到带GFP的慢病毒表达载体pWPXL-MOD(pWPXL-GFP-IRES-GFP)中,构建慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-GFP,Mlu Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切反应及测序分析加以鉴定.将慢病毒载体主体质粒pWPXL-hBDNF-IRES-GFP、包装质粒HELPER和包膜质粒VSVG共转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度.将构建的pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染NSCs,并对感染细胞进行鉴定及分化活性检测.结果 构建的慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-EGFP经Mlu Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切反应鉴定正确;测序分析证实与Genbank报道的hBDNF基因序列完全一致.三质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光.包装后慢病毒测定滴度为0.1×109～1×109TU/mL.pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染后的NSCs表达绿色荧光,可在体外扩增,NSCs细胞标志物巢蛋白表达阳性;细胞贴壁后可分化为神经元和胶质细胞.结论 成功构建hBDNF与GFP基因共表达的慢病毒载体并转染NSCs,转染后细胞仍能保持已知的原有生物学特性及良好的分化活性.     

多药耐药基因RNAi重组腺病毒构建

目的 构建抑制多药耐药基因(MDR1)表达的RNAi腺病毒载体,探讨基因治疗改善癫痫多重耐药现象的可行性.方法 根据大鼠MDR1基因序列,选择3个19nt的靶序列,设计并合成3对66nt含编码短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,构建pSIREN-shuttle-MDR1重组质粒,测序分析正确后转染通过马桑内酯诱导的已表达多重耐药蛋白的大鼠星形胶质细胞,通过RT-PCR法测定多药耐药蛋白(P-gp)表达量,判断所设计的3条DNA序列对于P-gp表达的抑制作用.选择抑制效率最高的1个重组质粒,将其中的MDR1 shRNA表达结构酶切后插入腺病毒载体pAdeno-X,构建的pAdeno-MDR1经Pac1酶切后与脂质体共转染HEK293细胞进行病毒包装扩增纯化,所得病毒液作酶切电泳及测序分析正确后再转染大鼠星形胶质细胞模型.RT-PCR及免疫组织化学法分别测转染前后星形胶质细胞模型的MDR1及P-gp表达量.结果 重组质粒及pAdeno-MDR1病毒经PCR、酶切、测序分析证实构建正确.病毒滴度为6×109 pfu/mL.重组腺病毒转染星形胶质细胞后MDR1及P-gp表达量减少,干扰效率接近100%.结论 成功构建针对大鼠MDR1基因的RNAi腺病毒载体,并通过体外实验证实其对大鼠MDR1基因的高效抑制作用.为进一步探索难治性癫痫的多药耐药机制和基因治疗奠定了基础.     

腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因体外转染兔结膜上皮细胞

目的:研究2型重组腺相关病毒( recombinant adeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP) 对体外培养兔结膜上皮细胞的转染和表达情况,为后续研究提供依据。方法:体外培养兔结膜上皮细胞,rAAV2-EGFP 按感染复数(multiplicity of infection ,MOI)为104、105、106 转染第2代兔结膜上皮细胞,转染后第1 、3 、5 、7日倒置荧光显微镜下观察细胞中EGFP表达情况,计算转染率。MTT方法检测rAAV2-EGFP转染对细胞增殖的影响。结果:随着MOI值增大及转染时间延长,EGFP 表达效率逐渐增高,转染后第7～8日达到高峰并维持。MTT检测各MOI组与对照组差别无统计学意义。结论:rAAV2载体可以介导EGFP 基因高效稳定转染兔结膜上皮细胞,并且对细胞增殖无影响。     

Immortalization of human precartilaginous stem cells by transfecting SV40Tag

Immortalized human precartilaginous stem cells （1PSCs） were established to provide stable cell resource for the study of the molecular mechanism of gene targeting on the differentiation of PSCs. Plasmid pCMVSV40T/PUR containing simian virus 40 large T antigen gene （SV40Tag） was transfected into human PSCs by using lipofectin transfection. Colonies were isolated by puromycin selection and expanded by multiple passages. Immunohistochemistry, RT-PCR and Southem blotting were used to identify the transfected cells and to detect the expression and integration of SV40Tag in expanded cell lines. The positive colonies were isolated and subcultured, designated immortalized precartilaginous stem cells （IPSCs）, which were confirmed as fibroblast growth factor receptor-3 （FGFR-3） positive cells by immunohistochemistry and RT-PCR. SV40Tag cDNA was found in cultured IPSCs of passage 8 by Southern blotting, and the expressions of SV40Tag mRNA and protein were confirmed by RT-PCR. These findings suggested that IPSCs strain with SV40Tag was constructed successfully.     

1型重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染人脐静脉内皮细胞的体外研究

目的 评价1型重组腺相关病毒(rAAV1)作为新生血管性角膜病变基因治疗载体的可行性.方法 rAAV1-EGFP按转染倍数(MOI)5×103,5×104,5×105转染ECV304细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察ECV304细胞中GFP阳性表达情况和细胞生长形态特点等,流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对EVE304细胞的转染效率.MTT法检测rAAV1-EGFP对EVC304细胞增殖的影响.结果 转染后2 d,MOI=5×105组细胞中的GFP开始表达;表达强度随MOI值的增高而增强,同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强,转染后第7天达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对ECV304细胞的转染率分别为45.90％(MOI=5×103),58.56％(MOI=5×104),68.31％(MOI=5×105).AAV1-EGFP转染ECV304细胞后.细胞生长及形态正常.MTT法显示转染后72、96 h各转染组与未转染组之间A值无显著性差异.结论 rAAV1-EGFP对ECV304细胞转染稳定、有效,重组腺相关病毒对细胞增殖无明显抑制,重组腺相关病毒可作为基因治疗角膜新生血管性病变的载体.     

重组腺相关病毒载体介导的绿色荧光蛋白在急性髓性白血病患者骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨重组腺相关病毒载体(rAAV-2-eGFP)是否可高效转导入骨髓间充质干细胞(BMSCs).方法从初发的急性髓性白血病(AML)患者骨髓中分离培养出BMSCs,在不同的感染复数(MOI=10^2,10^3,10^4,10^5,10^6,10^7)下用包含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的rAAV-2-eGFP感染BMSCs,寻找最佳的感染条件,并在转染后的不同时间点用倒置荧光显微镜以及流式细胞仪观察其表达情况.结果转染后10～14 d,eGFP在BMSCs中表达,转染效率为0.3%～2%,增加MOI亦不能明显增加转染效率.在MOI=105的条件下转染后观察了61 d,eGFP保持低水平长期稳定表达,在转染后的12～33 d,eGFP阳性的BMSCs从起始时的1.16%下降到(0.5～0.6)%,33～61 d一直维持在这一水平.结论rAAV-2-eGFP和BMSCs可用于体外基因治疗,但极低的转染效率可能是其进一步应用的障碍.     

两种重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白转染大鼠成骨细胞效率的体外研究

目的 比较2种不同重组腺相关病毒(rAAV)介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对大鼠成骨细胞的转染效率,评价其作为成骨细胞病变基因治疗载体的可行性.方法 采用Ⅰ型胶原酶阶段消化法分离培养大鼠成骨细胞并鉴定,rAAV-EGFP按转染复数(MOI) 1×10~3、1×10~4、1×10~5、5×10~5分为只加rAAV和rAAV与腺病毒(ADV)共同转染组转染成骨细胞,倒置荧光显微镜观察转染后荧光强度随转染时间的变化,流式细胞仪检测rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP对成骨细胞的转染效率及荧光强度,确定转染的较佳MOI值,以此值用MTT法描绘细胞生长曲线,观察rAAV对细胞的毒性.结果 分离培养的细胞具有体内成骨细胞的生物学行为,rAAV对成骨细胞的转染效率随MOI值的增加而提高,ADV(-)组荧光强度在第5 d达到高峰,当MOI为1×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率分别为90.2%、66.1%,MOI值增到5×10~5时转染效率无显著提高;ADV(+)组荧光强度在第3 d即达高峰,MOI值为5×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率为47.6%、30.5%.细胞生长正常,rAAV对细胞活性影响小.结论 两种病毒载体对成骨细胞转染效率均较高,其中rAAV2/6高于rAAV2/9,是一种理想的基因治疗载体.     

重组腺相关病毒载体介导的绿色荧光蛋白在急性髓性白血病患者骨髓间充质干细胞中的表达

目的 探讨重组腺相关病毒载体(rAAV-2-eGFP)是否可高效转导入骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法 从初发的急性髓性白血病(AML)患者骨髓中分离培养出BMSCs,在不同的感染复数(MOI =102, 103, 104, 105, 106,107)下用包含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的rAAV-2-eGFP感染BMSCs,寻找最佳的感染条件,并在转染后的不同时间点用倒置荧光显微镜以及流式细胞仪观察其表达情况。结果 转染后10~14 d, eGFP在BMSCs中表达,转染效率为0.3%~2%,增加MOI亦不能明显增加转染效率。在MOI=105的条件下转染后观察了61 d, eGFP保持低水平长期稳定表达,在转染后的12~ 33 d,eGFP阳性的BMSCs从起始时的1.16%下降到(0.5~0.6)%,33~61 d一直维持在这一水平。结论 rAAV-2-eGFP和BMSCs可用于体外基因治疗,但极低的转染效率可能是其进一步应用的障碍。     

不同病毒载体感染内耳组织的比较研究

目的 通过血清5型重组腺病毒和血清2型重组腺相关病毒感染大鼠内耳组织的比较研究,筛选出更适合内耳基因治疗的病毒载体.方法 一定体积的血清5型重组腺病毒液和血清2型重组腺相关病毒液经圆窗膜注入鼓阶外淋巴液,通过荧光共聚焦显微镜、免疫组化、Western免疫印迹及听性脑干反应等方法 对两种载体所携带报告基因的表达部位、表达时程以及两种病毒本身对内耳组织细胞生活状态的影响加以比较.结果 血清5型重组腺病毒和血清2型重组腺相关病毒所携带的增强型绿色荧光蛋白报告基因均可在前庭膜、血管纹、基底膜、盖膜、螺旋神经节区及转染对侧耳表达.rAAV2携带的EGFP蛋白第14天表达开始明显增多,第60天仍可检测到高表达.rAd5携带的EGFP蛋白在耳蜗组织内的表达高峰维持在第1～21天,在30天时表达明显减弱.结论 腺病毒的优势在于其基因表达的迅速和高效,而腺相关病毒载体以其长的表达时程,低组织细胞毒性在内耳基因转染中表现出独特的优势.     

重组腺病毒Ad-EGFP/HIF-1α转染大鼠内皮祖细胞

目的：研究含缺氧诱导因子（HIF-1α）及增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组腺病毒（Ad-EGFP/HIF-1α）感染大鼠内皮祖细胞（EPCs）的可行性.方法：采用percoll密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓单个核细胞,VEGF,bFGF,EGF诱导培养,观察其形态学变化,免疫细胞化学染色鉴定其表面抗原.Ad-EGFP/HIF-1α在HNK293细胞中进行扩增,之后转染体外培养的EPCs,分别于24,48,72,96h采用倒置荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）情况.MTT检测细胞生长活性;流式细胞术检测转染率并用RT-PCR法测定HIF-1α在EPCs中的表达.结果：倒置荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光,随着时间的延长,绿色荧光逐渐增多.MTT法检测细胞在24,48,72,96h的存活率分别为99.83%,99.70%,99.32%,99.57%;流式细胞仪计数随时间的延长,转染率逐渐升高,24,48,72,96h的转染率分别为23.05%,45.94%,78.91%,85.64%.RT-PCR可检测到被感染细胞HIF-1α的表达.结论：重组腺病毒Ad-EGFP/HIF-1α能够有效地感染EPCs,转染后在mRNA水平可检测到EPCs中有HIF-1α的表达,并对EPCs活性无明显影响,为进一步研究转基因的EPCs移植促血管新生奠定基础.     

重组腺相关病毒载体在大鼠海马内转导特征及其细胞亲嗜性

目的探讨3种不同血清型重组腺相关病毒(rAAV1、rAAV2和rAAV5)载体在大鼠海马内转导效率及细胞亲嗜性的差异,从而选择更加适于中枢神经系统(CNS)转基因治疗的载体。方法雄性健康成年SD大鼠18只,随机分为3组,每组6只,分别接受立体定向注射剂量和滴度相匹配的rAAV1、rAAV2、rAAV5载体,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,于注射后8周取脑行序列冰冻切片,以荧光显微镜观察EGFP在脑内的表达情况,并以Image-Pro Plus图像处理系统自动测量表达的面积和阳性细胞数量;为确定rAAV载体在CNS中的细胞亲嗜性,以神经元核性蛋白(NeuN)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光双重标记法观察EGFP在不同类型神经细胞的表达情况。结果各组EGFP表达呈现不同分布特征,rAAV1介导EGFP在海马CA1~CA3区绝大多数锥体细胞及齿状回的颗粒细胞中表达,rAAV2主要局限于齿状回门区的多形细胞层,rAAV5仅在CA1和CA2区锥体细胞层的少量细胞中表达。最大嘴尾侧转导距离、最大转导面积和EGFP阳性细胞计数rAAV1均显著大于rAAV2和rAAV5(P<0·01),rAAV2和rAAV5比较,差异均无显著性(P>0·05)。免疫荧光标记显示rAAV1既可以转导神经元,又可以转导胶质细胞;而rAAV2和rAAV5则仅可转导神经元。结论rAAV1不仅可以比rAAV2和rAAV5转导更大的范围和细胞数量,而且具有更广的组织亲嗜性,是一种高效的转基因载体。