丝素蛋白膜与小鼠胚胎成纤维细胞的体外生物相容性研究

目的探讨不同结构的丝素蛋白支架材料对小鼠胚胎成纤维细胞（NIH-3T3）生长繁殖性能的影响。方法将NIH-3T3接种在丝素蛋白纳米纤维膜和浇铸膜上进行体外培养,并设空白对照组。通过MTT法、HE染色、扫描电镜来分析不同结构丝素蛋白膜的生物相容性。结果增殖培养4天时实验组的OD值与对照组相比,有显著性差异（P〈0．05）;增殖培养7天时实验组与空白组相比无显著性差异（P〉0．05）,而对照组与空白组相比有显著性差异（P〈0．05）。HE染色、扫描电镜显示NIH-3T3细胞在纳米纤维膜上比在浇铸膜上有更好的生长和连接状态。结论与丝素蛋白浇铸膜相比,NIH-3T3细胞在纳米纤维膜上表现出更好的增殖能力,无明显细胞毒性表现;丝素蛋白纳米纤维膜具有良好的生物相容性,是皮肤组织工程的良好载体。     

再生柞蚕丝素蛋白对小鼠间充质干细胞体外生长的支持作用

目的探讨再生柞蚕丝素蛋白对小鼠间充质干细胞体外生长和分化的支持作用。方法采用再生家蚕丝素蛋白、再生柞蚕丝素蛋白、I型胶原、普通细胞培养板为研究对象,观察小鼠间充质干细胞（C3H10T1/2）在这4种生物材料上的黏附、生长及表面抗原的变化。利用光学显微镜观察细胞生长形态,MTT法检测细胞的增殖,流式细胞仪测定细胞表型。结果再生柞蚕丝素蛋白对细胞生长形态、细胞表面抗原表达均无影响。培养第6天C3H10T1/2细胞在再生柞蚕丝素膜上增殖明显,与其他3种生物材料的差异有统计学意义（P〈0.05）。结论再生柞蚕丝素蛋白在体外支持C3H10T1/2细胞的黏附、生长,具有很好的组织相容性。     

丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石骨组织工程支架材料的体外细胞毒性评价

目的 探讨丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物支架与兔骨髓间充质干细胞的体外细胞毒性.方法 采用丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石构建的生物支架与兔骨髓间充质干细胞体外共培养,用材料的细胞毒性、细胞黏附率、细胞增殖活力指标以MTT法、倒置显微镜及电镜观察来评价.结果 细胞在支架材料上黏附、生长良好,分裂增殖活跃,细胞毒性检测CTG均为0级,实验组与时照组细胞黏附率比较无统计学差异（P＞0.05）,实验组与对照组细胞增殖活力随着时间增加,细胞在支架增殖速度增快.第1、3、5、7天实验组与对照组比较有统计学差异（P＜0.05）.扫描电镜观察发现细胞培养7天后生长良好,分裂正常,与支架材料黏附紧密.结论 支架材料对细胞无毒性,具有很好的细胞相容性.     

丝素蛋白在医学领域的研究进展

蚕丝是由内层的丝素蛋白（Silkfibroin,SF）和外层的丝胶蛋白组成。SF在蚕丝中的含量约为70％～80％,它具有两性荷电的特殊性能,没有毒性,具有良好生物相容性、降解性,而且与人体的亲和性也很好,同时还可以根据需要被加工成各种形状,譬如多孔、膜状以及管状等,对开发中的医用材料来说,是一种比较理想的素材。本文将主要介绍由SF制成的多种医用材料以及SF在医学领域的研究进展和前景展望。     

丝素/明胶组织工程支架的生物相容性初探

目的 初步研究丝素/明胶（silk fibroin/gelatin,SFG）支架的生物相容性。方法 利用冷冻干燥法制备SF/G支架,将1×10⁵/ml的第3代人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）接种于SF/G支架上,设置对照组（人牙周膜干细胞悬液）,通过MTT试验测试两组人牙周膜干细胞第1、3、5、7天的吸光度值,利用细胞扫描电镜观察第5天和第7天两组细胞的生长增殖状况。结果 MTT显示接种于SF/G支架上的hPDLSCs的吸光度值在第1、3、5、7天分别为0.053、0.113、0.197、0.399,对照组分别为0.069、0.105、0.176、0.283。细胞扫描电镜显示第5、7天的hPDLSCs在SF/G支架上相互融合,分泌大量细胞外基质,细胞触须几乎铺满整个支架表面,并且有朝向支架空隙内部生长的趋势。结论 冷冻干燥法制备的SF/G支架能够促使细胞在其上增殖生长,具有一定的生物相容性,在牙周组织工程领域具有一定的应用潜力。     

聚乳酸/丝素蛋白复合组织工程支架的制备及生物学性能的评价

目的：研究聚乳酸（PLA）/丝素蛋白复合组织工程支架(简称PLA/丝素蛋白复合支架)的制备 方法,评价其生物学性能。方法：将PLA多孔支架材料放在丝素蛋白的水溶液中浸泡,经干燥后制备成PLA/丝素蛋白复合支架。实验分为PLA支架组(单纯聚乳酸支架组)与PLA/丝素蛋白复合支架。按ISO—10993标准,两组分别做溶血实验、动态凝血时间实验、细胞毒性实验、 刺激实验和热原实验,对其结果逐项进行比较。结果：刺激实验显示两种支架材料均未引起动物皮肤明显刺激,符合标准;热原实验显示两种支架材料引起动物体温升高均<0.2℃,并且体温升高总度数<1.0℃,两组比较差异均无显著性;溶血实验显示两种支架材料样品的溶血率均<5%（P=0.000）,且PLA/丝素蛋白复合支架抗溶血性优于PLA支架;动态凝血时间实验显示,PLA/丝素蛋白复合支架(37 min)长于PLA支架的动态凝血时间(26 min),即PLA/丝素蛋白复合支架的抗凝血性能明显优于PLA支架;细胞毒性实验中,PLA/丝素蛋白复合支架组的细胞生长情况明显优于PLA支架组,即PLA/丝素蛋白复合支架的细胞毒性明显小于PLA支架。结论：PLA/丝素蛋白复合支架材料具有比单纯PLA支架材料更优良的生物相容性, 可以作为支架材料植入体内。     

丝素蛋白无纺网支架体外构建组织工程化软骨

目的:探讨丝素蛋白无纺网作为耳廓软骨细胞外支架构建组织工程化软骨的可行性。方法:取成年新西兰兔耳廓软骨,酶消化法获取软骨细胞,体外培养扩增后取原代细胞接种到制备好的丝素蛋白无纺网支架上,体外复合培养。每天倒置显微镜下观察细胞黏附、生长、增殖情况,于复合培养第3、7、10天时取材进行扫描电镜观察;于复合培养第1、2、4、6周取材进行组织学评价,同时取材通过RT-PCR方法检测复合物上软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达情况。结果:48 h后软骨细胞已黏附于丝素蛋白纤维上,72 h后细胞开始分泌少量细胞外基质;电镜下观察显示软骨细胞及分泌的薄层细胞外基质主要分布于支架材料表面。组织学观察显示2周时支架浅层已有一定厚度软骨组织,可见少量类软骨陷窝,4周和6周时支架浅层软骨组织增厚,软骨陷窝增多,但支架内部软骨细胞数目少,细胞呈星形或梭形,细胞分泌的基质也很少。RT-PCR检测显示在各检测时间点均有Ⅱ型胶原mRNA的表达。结论:兔耳廓软骨细胞在丝素蛋白无纺网支架上已初步形成软骨样组织,但培养条件应进一步优化。     

蚕丝蛋白材料对鼠胚表皮细胞毒性的实验研究

目的研究不同蚕丝蛋白材料对鼠胚表皮细袍的毒性及其影响细胞增殖的因素。方法采用组织块培养法体外原代培养鼠胚表皮细胞，用直接接触法和浸提液法体外培养鼠胚表皮细胞，MTT比色法检测其在不同蚕丝蛋白材料上的增殖活力和细胞相对增殖率，进行毒性分析；并用活细胞计数法观察不同蚕丝蛋白材料对鼠胚表皮细胞生长的影响。结果鼠胚表皮细胞在1、2、4、5、7、8、10号各型蚕丝蛋白材料上生长，其增殖活力与细胞对照组相当（P〉0.05）；在3、6、9号化学交联或HY-823交联型蚕丝蛋白材料上生长，其增殖活力均低于细胞对照组（P〈0．05）；而在11号蚕丝蛋白材料其增殖活力显著低于细胞对照组（P〈0．01）。1、7号丝胶材料细胞毒性分级为0级（无毒），2、3、4、5、6、8、9、10号各型蚕丝蛋白材料细胞毒性分级为1级（轻微毒），而11号蚕丝蛋白材料细胞毒性分级为2级（中度毒）。活细胞计数结果与MTT检测结果基本相一致。结论除11号蚕丝蛋白材料外，1～10号各型蚕丝蛋白材料无明显细胞毒性，能支持鼠胚表皮细胞正常生长，具有良好的细胞相容性。     

兔膀胱移行上皮细胞与丝素蛋白膜相容性研究

目的 探讨用于膀胱组织工程研究的移行上皮种子细胞的培养方法,检测丝素蛋白膜与膀胱移行上皮细胞的细胞相容性,探讨构建泌尿系腔道组织工程器官的可能性.方法 (1)取兔膀胱移行上皮细胞体外培养,观察细胞形态变化及生长、增殖过程,并进行免疫荧光鉴定;(2)分别设立空白组(无细胞)、阴性对照组(培养基)和实验组(丝素蛋白膜浸提液).取对数生长期的膀胱移行上皮细胞,lx104/ml接种于96孔板中,每组各5孔,于接种后24、72和120h,通过MTT法显色.并于酶标仪490nm波长下检测吸光度值,计算相对增殖率,对丝素蛋白膜与膀胱移行上皮细胞的相容性进行评估.结果 细胞在第9～10天融合形成单层,细胞形态呈多角形的铺路石子状,经免疫荧光鉴定证实为移行上皮细胞;24、72和120 h实验组吸光度值分别为0.424±0.020、0.996±0.118和1.285±0.048.阴性对照吸光度值分别为0.419±0.030、1.105±0.098和1.228±0.052,两组比较无明显差异(P＞0.05).结论 丝素蛋白膜与膀胱移行上皮细胞相容性良好,具有作为泌尿系腔道组织工程支架的潜在运用价值.     

丝素蛋白作为生物材料的基础研究

研究丝素蛋白作为动物细胞生长基质和生物材料对于细胞生长的促进作用,探索丝素薄膜性能的进一步优化。通过细胞计数和噻唑蓝(MTT)法实验表明,丝素薄膜上猪髋动脉内皮细胞生长的密度是普通细胞培养基质上的242.01%,细胞在薄膜上的贴壁率为在普通基质上的238%。经由酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)处理后,薄膜上的细胞生长密度是未经处理薄膜上的115.98%,细胞的贴壁率为在普通细胞培养基质上的269%。因此,丝素蛋白薄膜可作为动物细胞生长基质,经aFGF处理的薄膜显示更优越的细胞亲和性。     

大鼠骨髓间充质干细胞在静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维上的培养及成神经诱导

目的通过将骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养在静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维上,研究BMSCs的生长及成神经分化情况。方法用家蚕丝素、柞蚕丝素分别与聚乳酸共混制成静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维,将第5代大鼠BMSCs培养其上,于24h后通过活细胞工作站观察细胞的黏附情况,并进行表型鉴定及存活检测。接种后待细胞长至60%左右,用bFGF/BHA诱导细胞成神经分化,并设多聚赖氨酸组进行对照。在诱导5h和维持48h时,观察细胞的形态学改变,通过免疫荧光法鉴定神经细胞特异性标志物Nestin,β-Ⅲ-Tubulin和NCAM的表达并进行定量统计分析。结果BMSCs在静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维上的黏附情况良好,细胞生长于纳米纤维上。存活检测中几乎未发现死细胞,多数细胞在材料上可存活。神经分化的形态学改变与多聚赖氨酸组一致,并且培养在纳米纤维上的细胞分化时出现的突起可缠绕在纺丝纤维上。神经特异标志的表达情况与多聚赖氨酸对照组的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维具有良好的生物相容性,可支持BMSCs的黏附及成神经分化,且对细胞生存无毒性。     

再生多孔丝素膜在创面的降解及对免疫细胞的影响

目的研究再生多孔丝素膜在创伤局部应用后的降解吸收及对免疫细胞的影响。方法取SD大鼠,切除背部皮肤建立创面,面积为2cm×2cm。将125I标记的再生多孔丝素膜覆盖在创伤面,再将切除皮肤的表皮层盖在再生多孔丝素膜上进行缝合。在术后3h和3、6、13、20、27、34、41、48、55d,采用单光子发射计算机断层成像术（SPECT）进行显像,示踪至同位素信号消失。处死大鼠,取创面皮肤经HE染色后对其中的炎症细胞进行分析。脾脏细胞经双色免疫荧光及流式细胞术检测CD3＋CD25＋/CD3＋T细胞的比率。结果大鼠种植再生多孔丝素膜55d,SPECT显像的同位素信号基本消失。创面皮肤下HE染色观察到少量的炎症细胞,未观察到残留丝素成分。实验组脾脏中CD3＋CD25＋/CD3＋T细胞的百分率为（7.34±1.85）%,对照组为（7.18±0.37）%,两者无明显差异（P〉0.05）。结论再生多孔丝素膜创面局部应用可在2个月内完全降解吸收,对免疫细胞的激发作用较小,是一种较为理想的创面修复组织工程材料。     

铜绿假单胞菌制剂对大鼠C6胶质瘤细胞作用的实验研究

目的研究铜绿假单胞菌注射液（PA-MSHA）对体外培养的大鼠C6胶质瘤细胞的增殖抑制机制.方法体外培养大鼠C6胶质瘤细胞,测定细胞活力、细胞贴壁率,绘制生长曲线,计算细胞倍增时间,确定最佳细胞接种浓度及药物干预区间.倒置显微镜观察药物作用后细胞形态学变化,MTT比色法测定不同时间、不同浓度PA-MSHA对C6胶质瘤细胞的增殖抑制率,计算细胞存活率及半数抑制浓度（IC50）.结果 C6细胞在常规培养条件下呈贴壁生长,生长状态良好,每次传代前活力测定,存活率均〉95%.于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h测定贴壁率分别为20%、68%、82%、85%、92%、98%,符合本实验要求.细胞生长曲线提示5×10^3/孔的浓度为96孔板内最佳接种浓度.细胞接种后24～72 h为细胞倍增时间.倒置显微镜下观察药物作用后细胞形态学变化明显.MTT比色法结果提示,细胞生长抑制率与药物作用时间和剂量正相关.计算24 h和48 h IC50值分别为（5.80±1.79）×10^8 cfu/mL和（3.90±2.14）×10^8 cfu/mL.结论铜绿假单胞菌（PA-MSHA）制剂对体外培养的C6胶质瘤细胞具有增殖抑制作用,且呈时间剂量依赖性.     

神经元在丝素蛋白材料上的生长发育

目的研究神经元在丝素蛋白材料上的生长发育,为神经干细胞结合丝素蛋白材料用于临床移植修复神经系统损伤提供实验依据。方法从新生大鼠脑室下区（SVZ）分离细胞,培养在柞蚕、家蚕两种丝素蛋白溶液制成的薄膜材料上,分别选取各时间段的细胞进行β-Ⅲ-tubulin特异性免疫荧光染色,并统计不同时间段神经元在丝素材料上的成活率及复杂度。结果神经元在柞蚕丝素薄膜上的成活率和复杂度明显比家蚕丝素薄膜高,差异均有统计学意义（均P〈0.05）。结论柞蚕、家蚕丝素薄膜支持神经元的生长,具有良好的生物相容性;柞蚕丝素薄膜比家蚕丝素薄膜更适合神经元的生长。     

氯化镧水杨酸8-羟基喹啉配合物抑制BGC -803细胞增殖及核分裂的研究

目的：观察氯化镧水杨酸8－羟基喹啉配合物（La（C7 H5 O3）2·（C9 H6 NO）·2H2 O）对体外培养的BGC －803细胞的生长抑制作用,并进一步探讨其作用机制。方法以BGC－803细胞为研究对象,应用MTT法检测细胞增殖活性、HE染色法检测细胞分裂、Annexin V－FITC染色法检测细胞凋亡率,以确定不同浓度配合物对细胞增殖和核分裂的影响。结果不同浓度La（C7H5O3）2·（C9H6NO）·2H2O处理BGC－803细胞24～72 h后,细胞增殖显著受到抑制,并呈浓度及时间依赖性;1．0、5．0、10．0μg/ml La（C7 H5 O3）2·（C9 H6 NO）·2H2 O处理24 h后,BGC－803细胞G0/G1期细胞数量显著增加,S期细胞数量显著降低（P＜0．01）;各浓度组细胞凋亡率均显著增加（P＜0．01）。结论 La（C7H5O3）2·（C9 H6 NO ）·2H2 O对BGC－803细胞具有生长抑制作用,其机制与阻滞细胞周期导致诱导凋亡有关。     

丝素蛋白膜修复海绵体神经缺损的实验研究

目的 探讨丝素蛋白膜（SF）修复海绵体神经缺损的效果.方法 选取健康雄性纯系SD大鼠33只,随机将其分成3组,假手术组（A组,n=11）、实验组（B组,n=11）及海绵体神经切断组（C组,n=11）.A组大鼠单纯游离双侧海绵体神经;B组大鼠首先建立海绵体缺损模型,后用SF桥接修复;C组大鼠切断双侧海绵体神经.术后3个月对各组大鼠进行阿朴吗啡试验,观察阴茎勃起情况并记录勃起次数.然后取阴茎中后部海绵体组织应用免疫组化方法检测神经型一氧化氮合酶（nNOS）的表达.对于所得数据使用SPSS17.0统计软件进行统计学分析.结果 A组与B组大鼠阴茎勃起次数、勃起率及nN0S神经纤维数目明显高于C组,统计学分析证实前两组与C组的差另别有统计学意义,前两组间的差别亦有统计学意义.结论 SF具有促进大鼠海绵体神经损伤修复的能力;本研究为丝素蛋白膜修复海绵体神经缺损的临床应用提供了实验依据.     

重组人白介素-10对TNF-α诱导的血管外膜成纤维细胞syndecan-4蛋白表达的影响

目的观察重组人白介素-10（IL-10）对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激的血管外膜成纤维细胞（NIH／3T3细胞）增殖和syndecan-4蛋白表达的影响。方法采用体外培养的NIH／3T3细胞,分别应用终质量浓度为20ng／mL TNF-α、100ng／mL IL-10、200ng／mL IL-10、100ng／mL IL-10联用20ng／mL TNF-α、200ng／mL IL-10联用20ng／mL TNF-α作用24h,并设对照组进行比较,采用MTS／PMS法确定NIH／3T3细胞的增殖状态,利用Western blot蛋白免疫印迹法测定NIH／3T3细胞中syndecan-4蛋白的表达。结果（1）MTS／PMS法测定各组细胞增殖率统计分析显示：与对照组比较,TNF-α组能显著刺激NIH／3T3细胞的增殖（P〈0．001）,而IL-10不同剂量组单独应用对NIH／3T3细胞的增殖均无明显作用（P〉0．05）。IL-10联合TNF-α共同作用组与TNF—α组比较,NIH／3T3细胞增殖均显著减少（P〈0．01）。（2）Western blot蛋白免疫印迹法测定显示：与对照组比较,TNF—α组能显著刺激NIH／3T3细胞中的syndecan-4蛋白表达（P〈0．05）,而IL-10不同剂量组单独应用对NIH／3T3细胞的syndecan-4蛋白表达均无明显影响（P〉0．05）。IL-10联合TNF-α共同作用组与TNF-α组比较,NIH／3T3细胞的syndecan-4蛋白表达显著降低（P〈0．001）。结论IL—10可明显抑制TNF-α诱导的NIH／3T3细胞增殖及细胞syndecan-4蛋白的表达。     

MMTV-PyMT转基因小鼠自发成瘤乳腺癌细胞的分离培养及鉴定

目的：分离培养小鼠乳腺肿瘤病毒介导多瘤病毒中间T抗原（MMTV-PyMT）转基因小鼠自发成瘤的乳腺癌细胞,初步研究其生长特性、分子表型、体内成瘤和转移能力。方法：取MMTV-PyMT小鼠自发成瘤的乳腺癌组织（n=3）,采用酶解贴壁培养法进行原代细胞分离并传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态特征;采用CCK-8检测细胞的增殖能力;通过Western印迹检测细胞的雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2(HER2)表达以鉴定细胞分子亚型。将分离培养的细胞接种于C57BL/6雌性小鼠（n=4）乳腺脂肪垫,观察细胞成瘤能力和生长特性;取肿瘤组织和内脏器官,制备组织切片后采用苏木精-伊红（HE）染色,观察组织形态学特点;采用免疫组织化学（IHC）染色检测ER、PR、HER2及Ki-67蛋白表达,分析分子分型。结果：成功分离得到MMTV-PyMT转基因小鼠自发成瘤的乳腺癌细胞（MMTV-PyMT细胞）并可稳定生长和传代,细胞倍增时间为56.0 h;MMTV-PyMT细胞可在C57BL/6雌性小鼠乳腺脂肪垫成瘤并生长,但未见远处内脏转移。该细胞在细胞学和组织学中的分子分型皆为HER...     

去甲肾上腺素和酚妥拉明对肝星状细胞增殖和细胞外基质的影响

目的探讨肾上腺素激动剂（NA）和拮抗剂（PTL）对细胞因子刺激大鼠肝星状细胞（HSC-T6）的影响。方法HSC-T6的复苏和传代;MTT法检测HSC-T6的增殖;放射免疫法（RIA）检测HSC-T6分泌透明质酸（HA）和前胶原的水平（PC）;糖原染色（PAS）用来检测HSC-T6内糖原水平。结果在体外实验中,NA（10^-5、10^-7、10^-9mol／L）能促进PDGF-BB诱导的HSC-T6的增殖、TGF-诱导的HA及PCIII的分泌并且能增强细胞内糖原的表达;PTL（10^-5、10^-7、10^-9mol／L）能抑制PDGF-BB诱导的HSC—T6的增殖、TGF-诱导的HA及PCIII的分泌并且能减弱细胞内糖原的表达。结论NA能促进HSC—T6增殖及基质的分泌,PTL则抑制HSC-T6的增殖及基质的分泌。