特发性脉络膜新生血管患者血清中血管内皮生长因子和色素上皮衍生因子的表达

脉络膜新生血管(CNV)的形成受多种细胞因子调控.血管内皮生长因子(VEGF)可促进血管内皮细胞分裂生长,导致血管增生和渗透性增加,是最重要的新生血管促进因子之一[1].色素上皮衍生因子(PEDF)是一种内生新生血管抑制因子,可以同时抑制血管内皮细胞的迁移和增生[2].已有研究表明,VEGF和PEDF表达水平失衡与CNV形成密切相关[3].但有关VEGF和PEDF在特发性CNV (ICNV)患者血清中的表达研究还较为少见.为此,我们对一组ICNV患者血清中VEGF和PEDF的表达水平进行了检测,以期探讨VEGF和PEDF与CNV形成的关系.现将结果报道如下.     

羊膜培养液体外抑制兔角膜上皮细胞血管内皮生长因子的表达

目的:探讨羊膜培养液对角膜上皮细胞中血管内皮细胞生长因子(vascula rendothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法:刮除并收集新鲜兔角膜上皮细胞,传代培养接种于35mm培养皿及自制的羊膜培养皿上。实验分为4组,Ⅰ组(对照组):无血清的DMEM培养液,Ⅱ组:去上皮的羊膜培养液,Ⅲ组:未去上皮的羊膜培养液,Ⅳ组:将细胞直接接种于无上皮羊膜。作用48h后用Trizol法提取各组样本的总RNA,进行RT-PCR一步法反应检测各组VEGF mRNA表达并与β-actin比较。结果:正常角膜上皮细胞中有VEGF基因表达,在Ⅲ,Ⅳ组中表达受到明显抑制(P<0.01,n=5)。结论:羊膜培养液明显抑制VEGF mRNA在角膜上皮细胞中的表达。     

色素上皮衍生因子抑制碱烧伤角膜新生血管的机制研究

目的:探讨外源性色素上皮衍生因子(pigment epitheliumderived factor,PEDF)抑制大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)形成的作用机制,检测外源性PEDF对CNV模型中内源性血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)及PEDF、细胞凋亡受体/配体(Fas/FasL)表达的影响,以及对CNV内皮细胞凋亡的影响(脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法——TUNEL法测定)。方法:大鼠随机分为3组:PEDF治疗组(A组)、生理盐水对照组(B组)、正常组(C组)。建立碱烧伤诱导的大鼠CNV模型,A组和B组分别给予PEDF+氯霉素滴眼液和生理盐水+氯霉素滴眼液点眼,采用裂隙灯观察CNV的生长情况,用免疫组化方法检测并半定量分析VEGF,PEDF,Fas及FasL在正常角膜组织和碱烧伤后4,7,10,14d角膜组织中的表达,用TUNEL法检测CNV内皮细胞的凋亡情况。结果:正常角膜组织中可以检测到高PEDF表达和低VEGF表达,也可以检测到一定的低Fas和FasL表达。各时间点角膜新生血管的面积,A组均低于B组(P<0.05)免疫组化显示,碱烧伤后4,7,10,14d A组VEGF的表达均低于B组(P<0.05),PEDF的表达均高于B组(P<0.05),A组Fas/FasL的表达明显高于B组(P<0.05),A组TUNEL法测到的角膜新生血管内皮细胞凋亡计数和凋亡指数AI明显高于对照组(P<0.05)。两组检测到的VEGF均在第7d达到峰值,随后下降;而PEDF和Fas及FasL在第10d达到峰值,随后下降。碱烧伤后第4～10dVEGF/PEDF>1,CNV逐渐生长并达到峰值;第10d后VEGF/PEDF<1,CNV开始逐渐退化。结论:PEDF抑制碱烧伤后CNV的作用机制可以归结为两点:(1)下调VEGF的表达,控制PEDF/VEGF的动态比值,抑制CNV生长;(2)上调Fas/FasL等凋亡受体的表达,诱导角膜新生血管内皮细胞的凋亡,促进CNV的退化。     

Tenomodulin蛋白对血管内皮细胞增生的抑制作用

目的研究tenomodulin（TeM）蛋白对血管内皮生长因子（VEGF）诱导的人视网膜血管内皮细胞（RECs）和人脐静脉内皮细胞（UVECs）增生及其对体外血管样结构形成的作用。方法将传代至3～6代的人RECs和人UVECs生长至融合时用含质量分数0.5%胎牛血清（FBS）的培养基孵箱中培养6h,加入不同质量浓度的VEGF或VEGF＋TeM混合物,继续培养12h,ELISA法检测TeM对VEGF诱导的血管内皮细胞增生的影响。将含10%FBS、1%FBSDMEM培养基的人RECs和人UVECs悬液分别接种于预先放置基质胶的24孔培养板表面,含1%FBS培养基的细胞培养板内分别加入VEGF（100μg/L）或VEGF＋TeM混合物37℃继续培养6h,共焦显微镜下观察,图像处理分析软件量化分析TeM蛋白对毛细血管样结构形成的作用。结果随着VEGF质量浓度的增加,血管内皮细胞DNA合成增加,其吸光度（A）值呈明显上升曲线,而添加TeM组的A值比VEGF组降低,差异有统计学意义（P〈0.01）。含10%FBS和1%FBS培养基的血管内皮细胞在基质胶表面形成毛细血管样结构,并连接成网状;在基质胶表面同时添加VEGF的血管内皮细胞,其毛细血管样结构明显增多,长度明显变长。添加TeM组的血管内皮细胞和其毛细血管样结构破坏,每个视野内血管内皮细胞毛细血管样结构显著破坏,管形细胞总长度明显变短。结论 TeM蛋白对血管内皮细胞的增生及体外血管样结构的形成有明显抑制作用。     

VEGF和PEDF在实验性大鼠角膜新生血管组织中的动态表达

目的探讨血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)和色素上皮衍生因子(pigmentepitheliumderivedfactor,PEDF)在实验性大鼠角膜新生血管(cornealneovascularization,CNV)形成过程中的动态表达及作用。方法诱导大鼠角膜碱烧伤模型,免疫组化法检测烧伤后1d、3d、5d、7d、10d、14d角膜VEGF及PEDF免疫反应;图像分析系统测定其蛋白表达。结果在CNV组织中,VEGF阳性表达于3~7d最明显,14d后表达微弱;PEDF在7~10d时表达最强烈,14d时明显下降。2种因子动态表达与CNV发展存在一定时间相关性。结论VEGF与PEDF在缺血缺氧诱导的大鼠CNV的形成过程中均有显著表达,且其动态过程与CNV的发展进程一致,二者表达失衡可能参与CNV形成及发展过程的调控。     

兔角膜及房水中VEGF的表达与角膜新生血管形成的相关性

目的:探讨兔角膜与房水中VEGF的表达与角膜新生血管(corneal neovasucularization,CNV)形成的相关性。方法:兔33只,随机分为正常对照组、实验组和实验对照组,角膜缝线制备CNV模型,实验对照组自术后当日起隔日结膜下注射一定剂量地塞米松治疗。术后每日观察CNV生长情况并计算其面积。分别于术后1,4,7,14,21d检测角膜组织及房水中VEGF的表达情况。结果:实验对照组CNV生长情况及角膜组织炎症细胞浸润程度较实验组明显受到抑制(P<0.05)。角膜组织中VEGF主要定位于上皮细胞、基质纤维细胞、内皮细胞、浸润的炎症细胞及新生血管内皮细胞胞质中。实验组角膜组织内VEGF表达的阳性率随时间推移逐渐增高,且表达强度与CNV面积具有显著的相关性。角膜缝线后14,21d实验组VEGF表达阳性率显著高于实验对照组(P<0.05)。实验组房水中VEGF的含量随着时间的推移逐渐增长,各检测点均高于实验对照组,并且房水及角膜组织中VEGF的表达与CNV面积显著正相关。结论:CNV的形成与炎症细胞浸润密切相关,角膜及房水中的VEGF可能在CNV形成过程中发挥着重要的调控作用。地塞米松可能通过抑制炎症反应、下调VEGF等细胞因子的表达,进而抑制CNV的生长。     

抗血管内皮生长因子小干扰RNA抑制大鼠角膜新生血管形成的研究

目的 探讨抗血管内皮生长因子小干扰RNA(VEGF-siRNA)对角膜碱烧伤急性期新生血管(CNV)形成的抑制作用.方法 实验研究.体外化学合成VEGF序列特异性双链小干扰RNA(VEGF-siRNA),脂质体介导转染体外培养的大鼠角膜上皮和基质细胞,实时PCR法检测转染后各时段VEGF mRNA表达水平,酶联免疫吸附实验测定转染后各时段VEGF蛋白表达水平.制作大鼠角膜碱烧伤动物模型,采用VEGF-siRNA转染的角膜上皮移植联合前房注射脂质体包裹的VEGF-siRNA治疗急性期CNV,免疫组化和ELISA分别检测角膜VEGF表达,观察术后CNV形成.细胞实验和动物实验中siRNA处理组和对照组VEGF蛋白含量比较,采用两样本均数比较的t检验.结果 siRNA对角膜上皮细胞VEGFmRNA的抑制效率达60%～84%,角膜基质细胞VEGFmRNA的抑制效率达59%～76%,角膜上皮和基质细胞VEGF蛋白表达也有相应的下降.采用VEGF-siRNA转染的角膜上皮移植联合前房注射VEGF-siRNA治疗,实验组CNV面积显著小于对照组;实验组VEGF表达水平显著低于对照组.结论 VEGF-siRNA能显著抑制大鼠角膜碱烧伤急性期CNV形成.     

人参皂苷Rg3抑制角膜新生血管生长的实验研究

目的观察人参皂苷Rg3对大鼠角膜碱烧伤后新生血管形成（CNV）有无抑制作用及其对正常角膜有无毒副作用。方法采用0．5％人参皂苷Rg3滴眼液滴眼21d,通过裂隙灯显微镜、光镜、电镜观察检测人参皂苷Rg3滴眼液的毒副作用。建立角膜碱烧伤后角膜新生血管模型,用0．1％、0．2％、0．5％3种不同浓度人参皂苷Rg3滴眼液及0．1％地塞米松磷酸钠滴眼液4次／d滴眼治疗28d,观察人参皂苷Rg3治疗效果。并用免疫组化方法观察血管内皮细胞生长因子（VEGF）及色素上皮细胞衍生因子（PEDF）表达。结果人参皂苷R船滴眼液滴眼21d后无明显不良反应。治疗组与地塞米松组较对照组CNV减少（P〈0．01）。治疗组与地塞米松组较对照组VEGF表达降低,PEDF表达增高（P〈0．01）。结论人参皂苷Rg3滴眼液局部滴眼无明显毒副作用,且对CNV有显著抑制作用。     

HIF在兔角膜碱烧伤后CNV生成中的作用研究

目的研究缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)以及诱导性一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在角膜碱烧伤后角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)形成中的作用及机制。方法 建立兔CNV动物模型,将其随机分为对照组和3个实验组,对照组结膜下注射生理盐水,实验组注射不同剂量的三氧化二砷。观察兔CNV的生长情况,并记录CNV的生长面积。用免疫组织化学方法检测兔角膜HIF、iNOS以及VEGF的表达。结果 对照组6 d、12 d、15 d、21 d、28 d CNV的面积分别为:(53.86±20.60)mm2、(87.21±25.80)mm2、(128.31±40.10)mm2、(114.42±29.40)mm2、(78.15±35.13)mm2。各实验组CNV面积均小于对照组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。免疫组织化学方法检测角膜HIF-1α、iNOS及VEGF蛋白的表达:VEGF表达集中在角膜上皮下基质,存在于血管内皮细胞、炎性细胞胞浆内,呈深黄色。在7 d有较高表达,14 d达到高峰,28 d时明显降低,且对照组明显高于实验组,各实验组的表达随三氧化二砷剂量的增加而减少。蛋白的表达与CNV面积呈正相关。结论 角膜碱烧伤后CNV的形成可能与HIF-1α有关。三氧化二砷通过抑制HIF-1α和iNOS、VEGF表达而抑制兔CNV的形成。     

大鼠角膜化学伤后PEDF和VEGF的不平衡表达

目的比较硝酸银化学伤后大鼠角膜和正常角膜色素上皮衍生因子（PEDF）和血管内皮生长因子（VEGF）表达水平，揭示两者与角膜新生血管的相关性。方法10只大鼠左眼角膜硝酸银化学伤后为实验组，右眼为正常对照组，伤后15d行免疫组织化学法定位及Western blot定量检测样本角膜PEDF、VEGF等的表达。结果免疫组织化学检查：实验组角膜VEGF、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）强表达，PEDF未见表达或弱表达。正常组角膜PEDF高表达，VEGF弱表达，bFGF几乎不表达。Western Blot分析：实验组角膜PEDF表达明显下降（t=8．0049，P〈0．01），VEGF表达显著升高（t=48．3637，P〈0．01）。结论角膜严重化学伤后新生血管抑制因子PEDF破坏，刺激因子VEGF产生增加，PEDF／VEGF比值降低，角膜血管新生。     

视网膜酸化诱导VEGF与PEDF表达及其与氧化应激的关系

背景 缺氧与高糖是引起视网膜新生血管生长的主要原因,可引起视网膜糖酵解作用增强,导致组织酸中毒. 目的 探讨视网膜酸中毒对视网膜血管内皮生长因子(VEGF)与色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响及氧化应激的作用.方法 从2周龄雄性SD大鼠中分离出视网膜.分别在NaHCO3调制的pH7.2、6.8、6.5酸性环境的DMEM培养液中培养24 h;另外,在上述酸性培养液中培养后用PBS洗涤视网膜2遍后置于pH值为7.2的新鲜培养液中继续培养24 h;同时,在上述酸性培养液中加入抗氧化剂对视网膜进行培养.制作视网膜标本,然后行苏木精-伊红染色,采用荧光定量聚合酶链反应( PCR)及免疫蛋白印迹技术检测各组大鼠视网膜中VEGF和PEDF蛋白及其mRNA的表达,以pH7.2作为对照. 结果 视网膜培养24 h后,pH7.2组、pH6.8组视网膜层次清晰,但pH6.5组视网膜出现空泡.正常视网膜VEGF mRNA的表达为(112±11)％,pH7.2组为(100±7)％,差异无统计学意义(P=0.55);pH 6.8组、pH 6.5组中的视网膜VEGF mRNA分别为(196±43)％、(251±29)％,均较pH7.2组明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).正常视网膜PEDF mRNA水平为(86±19)％,pH7.2组为(100±.33)％,差异无统计学意义(P=0.64);pH 6.5组视网膜PEDF mRNA水平为(230±66)％,较pH7.2组明显升高(P＜0.05).VEGF与PEDF蛋白与其mRNA表达趋势一致.视网膜酸化纠正后,pH 7.2、6.8、6.5组视网膜VEGF mRNA分别为(100±13)％、(111±9)％、(113±9)％,3个组之间比较差异无统计学意义(F=2.51,P=0.16).PEDF mRNA的表达分别为(100±13)％、(110±9)％、(108±11)％,3个组之间比较差异无统计学意义(F=0.98,P=0.43).加入抗氧化剂后,pH7.2组视网膜VEGF mRNA水平为(100±9)％,pH6.8组为(106±7)％,pH 6.5组为(148±22)％,pH6.5组VEGF mRNA表达水平均明显高于pH 7.2组和pH 6.8组(P＜0.05).pH 7.2、6.8、6.5组大鼠视网膜PEDF mRNA表达分别为(100±31)％、(282±45)％、(480±117)％,差异有统计学意义(F=20.73,P=0.00).结论 视网膜酸化诱导VEGF的表达受到氧化应激的调节,抗氧化剂可促进酸化视网膜PEDF的表达增加,表明氧化应激可抑制PEDF表达.     

翼状胬肉细胞之间的相互作用

目的探讨翼状胬肉中血管内皮细胞和成纤维细胞之间的相互作用。方法收集翼状胬肉标本,采用血管内皮细胞和成纤维细胞单独培养、条件培养和共同培养的方法构建培养体系,采用ELISA和RT—PCR法检测3种体系培养上清液和细胞中血管内皮细胞生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）蛋白及mRNA含量的变化。结果单独培养、条件培养和共同培养各组培养上清液中VEGF和bFGF的质量浓度增加,差异均有统计学意义（P〈0．05）;细胞单独培养、条件培养和共同培养三者相比,VEGF和bFGF的mRNA表达升高,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论内皮细胞和成纤维细胞有相互上调作用,2种细胞在翼状胬肉的发生发展过程中相互促进。     

ADP-核糖基化因子抑制剂在实验性碱烧伤诱导角膜新生血管中的作用及其机制

背景角膜新生血管（CNV）是导致角膜盲的主要原因之一,研究表明,ADP一核糖基化因子（ARF）对肿瘤细胞的增生有调节作用,抑制ARF能抑制血管的形成,但ARF抑制剂对CNV是否发挥作用尚不清楚。目的探讨ARF抑制剂在碱烧伤诱导的CNV形成过程中的作用及其机制。方法7～8周龄清洁级雄性BABL／c小鼠60只按照随机数字表法分为PBS对照组和ARF抑制剂干预组,每组各30只。所有小鼠采用角膜碱烧伤诱导法构建CNV模型,ARF抑制剂干预组小鼠于造模后1周腹腔内注射0．5g／LARF抑制剂溶液0．5ml,每周3次,共1周,PBS对照组小鼠以同样方式注射0．5mlPBS。各组分别取24只小鼠,于造模后0、4、7、14d采用实时定量PCR（real—timePCR）和Westernblot法检测小鼠角膜组织中ARFmRNA和蛋白的动态表达,并于造模后14d,采用Westernblot法检测各组小鼠角膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）的表达。各组另取6只小鼠,于造模后2、4、7、14d裂隙灯显微镜下观察CNV形成情况,并于造模后14d,采用全视网膜铺片免疫荧光组织化学法检测角膜组织中CD31在CNV中的表达。体外实验中应用ARF抑制剂干预人视网膜血管内皮细胞（RECs）,CCK8法和细胞划痕法检测ARF对人RECs增生和迁移的影响。实验动物的使用和喂养遵循视觉及眼科学研究协会有关规定及苏州大学《实验动物管理及使用指南》。结果造模后PBS对照组和ARF抑制剂干预组小鼠角膜组织中ARFmRNA在各个时间点均有表达,在造模后14d达高峰,各组小鼠角膜中ARFmRNA的表达随着时间的延长而增加,差异有统计学意义（F时间=65．17,P=0．00）,不同时间点的组间比较差异无统计学意义（F＊＊=1．98,P=0．18）;造模后14d,ARF抑制剂干预组实验后不同时间点ARF蛋白水平相对表达值比较差异有统计学意义（F=10．77,P=0．00）。裂隙灯显微镜下检查发现,ARF抑制剂干预组CNV相对面积为0．45±0．05,PBS对照组为0．72±0．11,2个组间差异有统计学意义（t=-3．87,P〈0．05）。全角膜铺片免疫荧光组织化学法检测表明,ARF抑制剂干预组小鼠角膜组织CD31表达面积明显小于PBS对照组。造模后14d,Westernblot法检测显示,ARF抑制剂干预组VEGF蛋白表达水平为1．20＋0．21,明显低于PBS对照组的2．47±0．33,差异有统计学意义（t=-5．62,P〈0．05）。CCK8法检测结果显示,随着ARF抑制剂质量浓度的增加,ARF抑制剂对人RECs的抑制率增加,差异有统计学意义（F=8．47,P=0．02）。细胞划痕实验后24h,100μg／L和1000μg／LARF抑制剂干预组人RECs迁移距离分别为（5．46±1．32）μm和（5．04±1．68）μm,与PBS对照组的（8．49±1．18）μm相比明显减小,差异均有统计学意义（t=-2．94、-2．91,P〈0．05）。结论ARF抑制剂能抑制碱烧伤诱导的CNV发生,可能与其下调VEGF的表达以及抑制血管内皮细胞的增生和迁移有关。     

抗血管生成作用的VEGFxxxb在缺氧视网膜色素上皮细胞中的表达

背景 缺氧可诱导视网膜色素上皮（RPE）细胞分泌血管内皮生长因子A（VEGF-A）,从而促进脉络膜新生血管（CNV）形成.VEGF-A依选择性剪接方式的不同,可形成具有促血管生成作用的VEGFxxx和具有抗血管生成作用的VEGFxxxb,但后者在常氧和缺氧状态下在人RPE细胞中的表达变化及其作用尚不清楚.目的 从mRNA水平和蛋白水平检测模拟缺氧状态培养的RPE细胞中VEGFmb的表达,研究VEGFxxxb在常氧和缺氧培养的RPE细胞中的表达变化.方法 以人RPE细胞系ARPE-19为研究对象,将150 μmol/L化学诱导剂CoC12加入细胞培养液制备缺氧细胞模型,分别于0h（常氧培养）及缺氧培养3、6、12和24 h收获细胞或细胞上清液,采用逆转录PCR（RT-PCR）法检测细胞内VEGFxxxmRNA和VEGFxxxb mRNA的表达;采用Western blot法检测细胞内总VEGF-A蛋白和VEGFxxxb蛋白的表达;采用ELISA法检测细胞上清中总VEGF-A蛋白和VEGFxxxb蛋白的含量.结果 在常氧及诱导缺氧后,ARPE-19细胞中均可检测到VEGFxxxmRNA和VEGFxxxb mRNA的表达,检测出的VEGFxxxmRNA中同时出现VEGF121、VEGF165和极微弱的VEGF189条带;检出的VEGFxxxb mRNA中可见VEGF165b条带.缺氧培养的细胞中随着缺氧时间的延长,VEGFxxxmRNA显示出表达逐渐增加的趋势,而VEGFxxxb mRNA则显示出表达逐渐减少的趋势.Western blot法可检测到细胞中VEGFxxxb蛋白的表达,尤以VEGF165b表达最强,随缺氧培养时间的延长,VEGF165b蛋白表达逐渐减少.培养的细胞上清中VEGFxxxb蛋白质量浓度由常氧培养时的（166.82±2.55） pg/ml下降至缺氧培养24 h的（125.35±2.10）pg/ml,而总VEGF-A蛋白则由（294.27±11.97） pg/ml上升至（582.26±12.98） pg/ml.细胞中VEGFxxxbb蛋白占总VEGF-A蛋白的比例随缺氧培养时间的延长,由常氧培养条件下的（56.71±1.02）％逐渐下降至缺氧培养24 h的（21.53±0.08）％.结论 ARPE-19细胞在常氧和缺氧培养条件下均可检测到VEGFxxxbb mRNA和蛋白的?     

高糖对人脐静脉内皮细胞促红细胞生成素受体表达的影响

目的探讨高糖条件下促红细胞生成素（EPO）受体mRNA及蛋自在人脐静脉内皮细胞（UVECs）的表达差异。方法体外常规培养人UVECs细胞株,实验组分别给予22mmol／L葡萄糖作用12、24、48、72h,5．5mmol／L葡萄糖组（生理糖浓度）设为正常对照组,5．5mmol／L葡萄糖＋16．5mmol／L甘露醇组为渗透压对照组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、免疫细胞化学法对高糖条件下人UVECsEPO受体mRNA和蛋白的表达进行检测。结果正常对照组和渗透压对照组相比,人UVECsEPO受体mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义（P〉0．05）。人UVECs在22mmol／L高糖作用12、24、48、72h后,EPO受体mRNA和蛋白表达均显著高于正常对照组（P〈0．05）,且随着时间的延长,EPO受体mRNA和蛋白的表达均逐渐增加。结论高糖条件下人UVECsEPO受体mRNA和蛋白表达均增强,且呈时间依赖性。人UVECs在22mmol／L高糖条件下EPO受体mRNA及蛋白表达的增加与渗透压无关。     

PEDF和VEGF mRNA在实验性脉络膜新生血管组织中的表达

目的 研究血管内皮生长因子(vessel endothelial growth factor，VEGF)和色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)在实验性小鼠脉络膜新生血管(choroidal neowascularization,CNV)组织中的表达情况。探讨二者在CNV形成过程中所起的作用。方法 用半导体激光诱导小鼠CNV模型。分别于激光后1、3、7d、2和3周时取出眼球，采用原位杂交方法检测CNV组织中VEGF和PEDF mRNA的表达情况。结果 VEGF和PEDF mRNA在激光诱导的小鼠CNV组织形成过程中均有显著表达。激光光凝早期二者的表达均增高，但VEGF mRNA的表达升高更显著。激光照射后3和7d时．VEGF mRNA的表达即达到高峰，阳性率分别为26．05％和27．92％，而PEDF mRNA的阳性表达率分别为21．13％和23．55％．2周时，VEGF mRNA表达开始下降，约为23．95％，而PEDF mRNA的表达则达到高峰,为29．19％,光凝后3周时，二者的表达均下降，但PEDF mRNA的表达仍高于VEGF mRNA的表达，分别为24．87％和21．93％．结论 VEGF和PEDF mRNA明显表达于实验性小鼠CNV组织中。2者表达失衡可能在CNV的形成过程中起到调控作用。     

FK506对高糖培养视网膜Müller细胞血管内皮生长因子表达的抑制作用

背景 视网膜M＆#252;ller细胞可通过表达血管内皮生长因子（VEGF）参与糖尿病视网膜病变（DR）的病理过程.FK506可抑制实体肿瘤及实验性角膜新生血管中VEGF的表达,但其对视网膜M＆#252;ller细胞中VEGF的表达是否有抑制作用鲜见文献报道.目的 观察FK506对高糖培养的大鼠视网膜M＆#252;ller细胞表达血管内皮生长因子（VEGF）的影响.方法 将大鼠永生化视网膜Müller细胞系进行常规培养并将对数生长期的Müller细胞分别接种到96孔培养板中,分别在培养液中加入800.00、400.00、200.00、100.00、75.00、50.00、25.00、12.50和6.25 pg/ml FK506 100 μl/孔（细胞密度为1×10^4个/ml）,MTT比色法确定Müller细胞半数抑制浓度（IC50）的最适FK506质量浓度.将大鼠视网膜Müller细胞系分为正常对照组、FK506组、高糖组和高糖＋ FK506组,分别用高糖DMEM培养液（含50 mmol/L D-葡萄糖）和正常DMEM培养基（含5.5 mmol/L D-葡萄糖）进行培养,并分别在培养基中加入FK506,至质量浓度为75 pg/ml.ELISA法检测培养细胞上清液中VEGF的质量浓度;分别采用逆转录PCR（RT-PCR）和Western blot法检测各组大鼠视网膜Müller细胞中VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量,分别以目的基因与内参β-actin吸光度（A）比值和灰度比值表示.结果 光学显微镜下正常对照组、FK506组、高糖组及高糖＋Fk506组培养12、24、48 h的大鼠视网膜Müller细胞均呈多角形,大小一致.致大鼠视网膜Müller细胞IC50的FK506质量浓度为75 pg/ml.正常对照组、FK506组、高糖组和高糖＋FK506组细胞上清中VEGF蛋白的质量浓度分别为（966.46±13.59） pg/ml、（1 059.42±67.43） pg/ml、（16 243.11±3 926.38）pg/ml和（9 467.25±1 525.56） pg/ml,总体差异有统计学意义（F=20.51,P=O.00）,其中高糖组细胞上清中VEGF的质量浓度明显高于正常对照组,差异有统计学意义（P=0.00）;高糖＋FK506组较高糖组细胞上清中VEGF的质     

缺氧对培养的人视网膜色素上皮细胞中血管生成素-2表达的影响

背景脉络膜新生血管（CNV）是导致一些眼底疾病视力丧失的主要原因,而血管生成素2（Ang-2）与血管生成的关系较为密切。目前在缺氧条件下人视网膜色素上皮（RPE）细胞上Ang-2的表达情况与CNV发病的关系研究较少。目的观察缺氧对体外培养的人RPE细胞中Ang．2表达的影响,探讨Ang-2在CNV形成中的可能作用。方法人RPE细胞经培养和传代,取第4～7代细胞以5×10^7个／L密度接种于培养皿,常氧对照组不加CoCl2,缺氧组换以含终浓度为200μmol／LCoCl2的培养基5ml建立RPE细胞化学缺氧模型,分别于加药导致缺氧后0．5、1、2、4、6、12和24h终止缺氧。采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测缺氧不同时间对体外培养的人RPE细胞Ang-2mRNA表达的影响;采用酶联免疫吸附反应（ELISA）法检测缺氧不同时间对体外培养的人RPE细胞上清液中Ang-2蛋白质量浓度的影响。结果人RPE细胞复苏后存活率达90％,第4代传代细胞中色素很少,细胞形态多为梭形。不同培养条件组人RPE细胞中Ang-2mRNA／β-actin mRNA值的总体比较差异有统计学意义（F=1086．30,P=0．00）;缺氧条件下培养0．5h后人RPE细胞中Ang-2mRNA／β-actin mRNA值开始明显增加,至缺氧培养后4～6h达高峰,与常氧对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）;缺氧培养24h后Ang-2mRNA／β-actin mRNA值接近常氧对照组。ELISA分析结果表明,不同培养条件下人RPE细胞培养基上清液中Ang-2蛋白的总体比较差异有统计学意义（F=1034．00,P=0．00）,缺氧条件下培养0．5h后人RPE细胞中Ang-2蛋白的质量浓度开始明显升高,6h达到高峰,与常氧对照组相比,差异均有统计学意义（P〈0．05）;缺氧培养24h后Ang-2蛋白的质量浓度接近常氧对照组。结论缺氧可显著上调体外培养的人RPE细胞中Ang-2的表达,Ang-2于缺氧早期呈高表达,提示Ang-2参与了CNV的形成,可能在CNV形成过程的早期阶段发挥作用。     

原子力显微镜观察角膜内皮细胞诱导后诱导多能干细胞的形态学变化

背景 诱导多能干细胞(iPSCs)具有类似胚胎干细胞的分化能力,可以分化为全身各种类型的体细胞,同时不会引起伦理学问题和免疫排斥反应,因此iPSCs有可能作为组织工程角膜内皮重建的种子细胞. 目的 利用原子力显微镜(AFM)观察人iPSCs与兔角膜内皮细胞(CECs)混合共培养后分化iPSCs的形态学变化,并找出其细胞膜超微结构变化的规律.方法 分别培养兔CECs和人MMC-iPSCs细胞系,用免疫组织化学法测定iPSCs细胞的标志物以鉴定iPSCs细胞.将传代后7d的iPSCs与60％融合的CECs在内皮细胞培养基中共培养建立混合共培养模型,利用AFM结合倒置显微镜观察CECs及共培养前后iPSCs的形貌和超微结构变化.结果 CECs的长度和宽度分别为(66.93±10.48) μm和(44.85±8.14) μm,共培养前未分化的iPSCs的长度和宽度分别为(12.51±1.40)μm和(10.93±1.69) μm,共培养后分化的iPSCs长度和宽度分别为(36.12±10.29) μm和(31.53±9.65) μm.分化的iPSCs长度和宽度均大于共培养前的iPSCs,差异均有统计学意义(P＜0.05).分化的iPSCs宽度与CECs比较差异无统计学意义(P＞0.05).CECs细胞膜表面突起的最大宽度和高度分别为(2.11±1.03)μm和(115.68±92.08) nm,膜表面凹陷为窗孔样凹陷,最大宽度为(1.49±0.65) μm,膜表面结构几何参数均方根粗糙度(Rq)为(39.20±7.82) nm,平均粗糙度(Ra)为(30.37±5.32)nm;未分化的iPSCs细胞膜表面突起为颗粒状,突起的最大宽度和高度分别为(0.39±0.22) μm和(13.11±9.18)nm,膜表面凹陷为虫蚀样,凹陷的最大宽度为(0.34±0.18) μn,Rq和Ra分别为(26.60±4.93)nm和(9.97±3.78) nm;分化的iPSCs细胞膜表面突起为指状,突起的最大宽度和高度分别为(1.91±0.76) μm和(106.55±77.27)nm,膜表面凹陷为窗孔样,凹陷的最大宽度为(1.61± 1.25) μm,Rq为(57.33±12.80) nm,Ra为(43.63±11.17)nm.分化的iPSCs细胞膜表面突起最大宽度和高度、凹陷最大宽度、Rq、Ra均大于共培养前未分化的iPSCs,差异均有统计学意义(P＜0.05),与CECs比较差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论 AFM能够敏感地观察到iPSCs与CECs接触共培养7d后iPSCs向CECs方向转化的形态学变化,为进一步研究iPSCs向CECs的分化提供了研究基础.     

shRNA抑制人RPE细胞中HIF-1α表达下调后IGF-1对VEGF表达的影响

背景 增生性玻璃体视网膜疾病(PVD)是一组眼底视网膜血管性疾病,主要由视网膜色素上皮( RPE)细胞增生所致,胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)与RPE细胞的异常增生和病理性新生血管生成有关,但其信号机制及功能尚不完全明了. 目的 探讨利用小发卡环核糖核酸( shRNA)使人RPE细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)基因沉默后,IGF-1对VEGF表达的影响. 方法 收集健康男性供体眼球4只,分离、收集、培养RPE细胞,用SABC法行抗人角蛋白免疫细胞化学染色进行鉴定.用体外转录法合成针对HIF-1α mRNA序列靶点的shRNA,对3～5代RPE细胞的HIF-1α进行干扰后再经50 μg/L IGF-1处理24 h,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测人RPE细胞中HIF-1α及VEGF mRNA的表达,采用Western blot法检测人RPE细胞中HIF-1α及VEGF蛋白的水平.结果 分离培养的细胞呈扁平不规则多角形,97％的细胞对人角蛋白呈阳性反应.50 μg/L IGF-1作用后,人RPE细胞HIF-1α mRNA表达量(1.49±0.18)与0 μg/L IGF-1组(1.46±0.17)比较差异无统计学意义(t=0.335,P=0.743),而HIF-1α蛋白表达量(1049.86±172.54 vs 0.00±0.00)、VEGF mRNA(0.95±0.15 vs 0.35±0.07)及VEGF蛋白(391.98±56.77 vs 214.36±37.15)表达量均明显增高,差异均有统计学意义(t=16.098、9.935、6.928,P＜0.05).shRNA干扰HIF-1α mRNA表达后,RNAi转染组HIF-1α、VEGF mRNA及其蛋白水平较RNAi空白对照组及RNAi-C转染组明显下降,3个组间各指标的总体比较差异均有统计学意义(F=68.679、89.904、21.770、6.205,P＜0.05). 结论 IGF-1可通过促进人RPE细胞中HIF-1α蛋白的累积诱导VEGF的表达,是导致PVD重要的细胞因子之一.