可溶性HLA-G-肽复合物的体外制备与纯化

目的 探讨可溶性HLA-G-肽复合物的体外制备与纯化.方法 原核高效表达的HLA-G重链及轻链(β2m)在抗原肽(人工合成九肽NH2-KGPPAALTL-COOH)的存在下,通过稀释复性折叠成HLA-G-肽复合物,采用凝胶过滤层析对折叠复合物进行纯化.利用特异性抗体(mAb W6/32和兔抗人β2m抗体)进行ELISA和Western blot对纯化产物进行鉴定.结果 折叠复合物中,主要含有HLA-G重链聚合体、HLA-G-肽复合物及β2m 3种成分,纯化后主要为HLA-G-肽复合物.结论 成功地获得纯度较高的可溶性HLA-G-肽复合物单体,为进一步研究HLA-G的生物学功能奠定了基础.     

可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化

目的 研究可溶性HLA—A＊2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化。方法 将原核高效表达的可溶性HLA—A＊2402-BSP融合蛋白及β2微球蛋白（β2m）与HLA—A＊2402限制性抗原肽Epstein—Barr病毒（EBV）即刻早期BRLF1蛋白中的九肽NH2-DYNFVKQLF-COOH进行稀释复性折叠，形成HLA—A＊2402-pBRLF1复合物单体，并在BirA酶的作用下进行生物素化，使生物素结合到HLA—A＊2402-pBRLF1复合物中H链c端的BSP序列上形成生物素化的可溶性HLA—A＊2402-pBRLF1复合物单体。利用特异单抗（W6／32和兔抗人β2m抗体）及链霉亲合素进行ELISA和Western blot，检测稀释复性和生物素化的折叠产物。然后用此生物素化的单体分子进一步构建成HLA—A＊2402-pBRLF1四聚体来检测人工抗原提呈细胞（aAPCs）诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）。结果折叠复合物中，主要含有HLA-A＊2402-pBRLF1复合物单体及β2m两种成分，其中HLA—A＊2402-pBRLF1复合物单体可生物素化和四聚体化。应用HLA—A＊2402-pBRLF1四聚体对特异性CTL检测结果说明体外成功地构建了HLA—A＊2402-pBRLF1四聚体。结论HLA—A＊2402-pBRLF1四聚体构建成功。为特异性CTL的检测提供了有力的工具。     

人可溶性单链β2m-HLA-A2-BSP融合蛋白表达载体的构建及其表达

目的 构建并表达了人可溶性单链β2m-HLA-A2-BSP（scHLAA-A2）融合蛋白表达载体．为进一步制备HLA-A2四聚体及其功能研究奠定了基础。方法 应用重叠延伸PCR（overlap-PCR）对编码HI，A-A2的cDNA序列进行一个碱基的同义突变．并将β2m和HLA-A2胞外段亚单位两段编码序列的cDNA通过一疏水性多肽接头（Gly．Ser）。的DNA序列进行前后拼接．并利用引物所带的BSP编码序列．构建单链β2m-HLA-A2-BSP融合基因．将测序正确的β2m-HLA-A2-BSP融合基因插入原核表达载体pET-22b中．转化BL21（DE3）细菌．SDS-PAGE检测其表达．融合蛋白于体外抗原肽存在条件下稀释复性后由Western blot鉴定其空间构象。结果 经DNA序列分析表明：同义突变与预期结果一致．β2m和HLA-A2-BSP、linker的连接顺序、方向及序列完全正确．表达载体转化BL21（DE3）细菌后可表达β2m-HLA-A2-BSP融合蛋白．SDS-PAGE显示该融合蛋白分子量为45kD．与理论值一致．将融合蛋白与特异性抗原肽在体外进行稀释复性后经Western blot鉴定表明该复合物能与HLA-1类分子特异性结合的单克隆抗体W6／32结合。结论 人可溶性单链β2m-HLA-A2-BSP融合蛋白的构建及其表达获得成功．经体外复性可获得HLA-1类分子天然构象。     

HLA-G突变分子对NK细胞抑制作用的研究

目的探索可溶性HLAG1分子结构对功能的影响,为其临床应用打下基础。方法通过分子克隆技术,去掉HLAG1重链分子α1功能区氨基端24肽,然后与轻链蛋白在体外与九肽共折叠复性形成复合物,并检测复合物对NK细胞杀伤活性的影响。结果成功构建突变的HLAG1重链分子的原核表达载体,表达的重链蛋白与轻链蛋白形成复合物,经Westernblot鉴定可与HLAⅠ类分子的单抗W6/32结合,并且可明显抑制NK细胞对K562细胞的细胞毒作用。结论α1功能区氨基端缺失24肽的HLAG1分子,可抑制NK细胞的细胞毒作用。     

利用CEA694-702-β2m融合蛋白制备HLA-CEA694-702复合体

目的：获得大量CEA694-702-β2-微球蛋白（β2m）融合蛋白,并制备HLA-CEA694-702复合体。方法：通过引物设计在β2m基因的5′端引入CEA694-702序列和L inker序列,并将目的基因克隆到质粒pET28 a中,在BL21（DE3）中表达。CEA694-702-β2m和HLA重链蛋白用金属螯合亲和层析法进行纯化,并经稀释复性法复性。制备的HLA-CEA694-702复合体用PEG20000浓缩,应用ELISA鉴定其构象,并用尺寸排阻色谱纯化和鉴定。结果：HLA重链蛋白和CEA694-702-β2m蛋白经金属螯合亲和层析法纯化后纯度提高。ELISA鉴定结果表明稀释复性后HLA-CEA694-702复合体形成了正确的构象。利用尺寸排阻色谱对HLA-CEA694-702复合体成功地进行了纯化。结论：利用CEA694-702-β2m融合蛋白成功制备出HLA-CEA694-702复合体,为HLA-CEA694-702四聚体的制备奠定了基础。     

人β2m基因的克隆及表达

目的 克隆和表达HLA Ⅰ类分子轻链(β2m)基因，为人工制备HLA Ⅰ类分子提供基础。方法 利用逆转录PCR技术从Jeg-3细胞株中克隆β2m基因，与质粒pET22b( )重组，构建原核表达载体pET22b( )-β2m，转化宿主菌E．coli BL2l(DE3)，诱导β2m基因高效表达，并采用双抗体夹心ELISA法对表达产物进行抗原性和功能鉴定。结果 酶切和测序证实β2m基因克隆和载体构建成功，目的蛋白在宿主菌中高效表达于包涵体中；通过包涵体的分离和纯化获得初步纯化的β2m，所制备的β2m能够与特异性抗体结合，并能与HLA 0281类分子重链形成具有天然构象的HLA 0281类分子。结论 人β2m基因能够在原核宿主中高效表达，表达产物具有形成HLA Ⅰ类分子的功能。     

去唾液酸糖蛋白受体H1亚基的原核表达及多克隆抗体的制备

目的在原核系统中表达并纯化去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）H1亚基，制备兔抗人ASGPR1多克隆抗体。方法以质粒pEA1为模板，设计引物，将聚合酶链反应（PCR）扩增产物H1基因克隆到原核表达载体pET-32c中。接种含H1/pET-32c的菌株BL21单菌落至LB肉汤中，1∶100稀释转种后用1 mmol/L终浓度的异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，表达产物用Ni^2＋螯合柱亲和纯化，用纯化的ASGPR1免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果H1/pET-32c在原核系统中成功表达和纯化出约50.3 kD大小的融合蛋白，用纯化的H1成功制备了兔抗人H1多克隆抗体，并用6His-H1和GST-H1重组蛋白进行免疫印迹技术（Western blot）分析，证实了抗体的正确性。结论应用多克隆抗体可以检测体内外ASGPR H1亚基基因的表达，为临床上测定血清可溶性ASGPR奠定基础。     

病毒肽/HLA-A2复合物与抗转铁蛋白受体单链抗体融合蛋白的构建、表达及鉴定

目的 制备抗转铁蛋白受体单链抗体与病毒肽/HLA-A2的融合蛋白.方法 利用重组DNA技术将HLA-A2基因和转铁蛋白受体单链抗体(TfRscFv)基因,用柔性的linker(Gly-4-Ser)3连接并克隆到原核表达载体pET28a(+)上,转化大肠埃希菌BL21(λDE3)菌株,获取重组子,经IPTG诱导表达目的 蛋白.将纯化的目的 蛋白和β 2微球蛋白(β 2m)与HLA-A2限制性的乙肝病毒(HBV)核心抗原肽HBcAg 18-27在体外进行稀释复性,形成HBcAg 18-27/HLA-A2/TfRscFv融合蛋白.利用ELISA和微球结合试验检测融合蛋白的空间构象.结果 构建的融合蛋白基因具有正确的序列,经IPTG诱导后以包涵体形式表达的蛋白分子量正确,体外稀释复性后的融合蛋白具有正确的HLA-A2空间构象.结论 成功构建了HBcAg 18-27/HLA-A2/TfRscFv融合蛋白,为进一步将该融合蛋白通过其单链抗体加载到肿瘤细胞表面从而诱导乙肝病毒肽特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞奠定了物质基础.     

人睾丸特异表达基因PIAS-NY 原核表达 和多克隆抗体的制备

目的 构建PIAS-NY-pET30a 原核表达载体,并诱导其成功表达,经纯化后获得高浓度的可溶性融 合蛋白His-PIAS-NY,免疫小鼠获得鼠源性PIAS-NY 多克隆抗体。方法 以人精原cDNA 文库为模板,通过 聚合酶链反应（PCR）扩增PIAS-NY 开放阅读框,克隆到pET30a 表达载体中,酶切、PCR 鉴定构建重组质粒。 测序完全正确后将质粒PIAS-NY-pET30a 转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行大量扩增,异丙基-β-D- 硫 代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。超声、离心、His-Ni 柱亲和层析纯化包涵体蛋白,依次经过不同浓度尿素进 行蛋白质复性,获得高浓度的可溶性His-PIAS-NY 融合蛋白。分6 次BalB/C 小鼠腹腔注射乳化纯化蛋白。 2 个月后小鼠眼球取血,收集血清。结果 成功构建原核表达质粒PIAS-NY-pET30a ;利用终浓度1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h,大肠杆菌BL21 大量表达融合蛋白His-PIAS-NY,并以包涵体形式存在于菌体中;尿素 变性后His-Ni 柱纯化融合蛋白,复性后获得高浓度的可溶性蛋白His-PIAS-NY ;6 次免疫后收获存活小鼠 抗血清;酶联免疫吸附测定（ELISA）抗血清滴度达到1 ∶ 100 000 ;免疫印迹和免疫共沉淀证实PIAS-NY 抗血清能特异性识别293T 细胞和GC2 细胞中PIAS-NY 蛋白。结论 成功获得PIAS-NY 多克隆抗体,而且 具有高反应性和高特异性,PIAS-NY 在GC2 细胞和293T 细胞中表达,并且能够与RUVBL2 蛋白发生相互作用。     

重组人骨形态发生蛋白-2原核表达及单克隆抗体制备

目的 利用原核表达系统(E.coli)表达纯化重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2m),并制备rh-BMP-2m的单克隆抗体.方法 将工程菌株进行常规发酵,自诱导表达,裂菌离心分离包涵体,包涵体变性后经阳离子交换色谱分离纯化.纯化后的变性rhBMP-2m经稀释复性,获得具有生物学活性的rhBMP-2m.并以此作为抗原,免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体.结果 获得还原SDS-PAGE下95％以上纯度的rhBMP-2m.细胞活性结果分析显示,所获得的rhBMP-2m具有较强的生物学活性.免疫小鼠最终获得两株稳定分泌抗rhBMP-2m抗体的杂交瘤细胞株.结论 成功制备了具有生物学活性的rhBMP-2m及其单克隆抗体,为rhBMP-2未来的研究和制备奠定良好的基础.