RNA干扰技术沉默STAT3对人前列腺癌细胞生长的抑制作用

目的: 探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因表达对人前列腺癌细胞PC3及LNCaP的生长抑制作用。　方法: 针对STAT3mRNA序列设计合成 3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3重组质粒,转染PC3及LNCaP细胞;采用Western印迹、Northern印迹等技术观察重组质粒对STAT3基因表达的影响;用MTT法观察重组质粒对PC3及LNCaP细胞体外生长抑制作用;用流式细胞术(FCM)及吖啶橙染色检测重组质粒诱导细胞凋亡。　结果: 成功构建pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3重组质粒,并成功转染PC3及LNCaP细胞;Western印迹,Northern印迹结果证实重组质粒在mRNA及蛋白水平分别显著抑制STAT3基因表达,抑制率为60% ~75%;MTT及FCM结果证明上述重组质粒可显著抑制PC3及LNCaP细胞的体外生长并诱导PC3细胞凋亡。结论: pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3可抑制STAT3在人前列腺癌细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞的生长,促进其凋亡。     

RNAi沉默STAT3基因对人前列腺癌PC3细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的 探讨pSilencer1．0-U6-siRNA-STAT3重组质粒对人前列腺癌细胞PC3裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法 采用裸鼠前列腺癌模型模拟siRNA—STAT3基因治疗实验，观察siRNA—STAT3重组质粒的抗瘤疗效，Western blot法检测重组质粒对STAT3基因表达的影响，HE及Tunel染色方法观察肿瘤组织形态及细胞凋亡情况。结果 肿瘤接种后第49天重组质粒组肿瘤体积为（391±56）mm^3，盐水对照组为（1111±182）mm^3，空质粒对照组为（981±169）mm^3，与对照组相比，差异有统计学意义（P〈0．01）；重组质粒抑制瘤体内STAT3及pTyr-STAT3基因表达率分别为77％及68％，与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。HE染色证实重组质粒组出现大片细胞核固缩、破碎等凋亡征象，Tunel染色显示癌组织出现大量细胞凋亡。结论 pSilencer1．0-U6-siRNA-STAT3重组质粒能明显抑制人前列腺癌细胞PC3裸鼠移植瘤的生长，具有良好的应用前景。     

STAT3基因短发卡RNA表达质粒的构建及其对胃癌细胞生长和侵袭的抑制作用

目的 构建信号传导及转录活化因子3(STAT 3)基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒,探讨STAT 3抑制后对胃癌MKN-45细胞增殖、凋亡和侵袭的影响.方法 根据STAT 3 Mrna 编码序列,设计RNA干扰靶点,构建STAT 3基因的特异性小RNA干扰质粒(psiRNA-H1/STAT 3),使用脂质体转染MKN-45细胞,实验分为对照组、psiRNA-H1转染组和psiRNA-H1/STAT 3转染组.通过RT-PCR和Western blot检测STAT 3特异性小RNA干扰基因对胃癌细胞STAT 3 Mrna和蛋白表达的影响; MTT比色法检测细胞的生长抑制率; 采用流式细胞术检测转染后对MKN-45细胞凋亡的影响; 采用Boyden小室侵袭实验检测转染后MKN-45细胞侵袭力的变化.结果 成功转染重组体的MKN-45细胞中STAT 3 Mrna和蛋白表达明显下降(P＜0.05).psiRNA-H1/STAT 3转染组各时相均明显抑制MKN-45细胞生长,且MKN-45细胞凋亡率为34.26%,相比对照组(3.75%)和psiRNA-H1转染组(4.43%)明显升高(P＜0.01).另外,psiRNA-H1/STAT 3转染组MKN-45细胞侵袭力较另外2组明显减弱(P＜0.01).结论 成功构建了针对STAT 3基因的shRNA表达载体,通过转染MKN-45细胞,在体外能有效抑制人胃癌细胞STAT 3 Mrna和蛋白表达,细胞增殖、侵袭能力减弱并且促进细胞凋亡,为STAT 3基因靶向治疗提供一定的实验依据.     

RNAi技术沉默Bcl-2基因对人膀胱癌细胞株T24增殖影响的研究

目的探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默Bcl-2基因表达对人膀胱癌细胞株T24增殖的影响。方法针对Bcl-2 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pGenesil-1-Bcl-2 siRNA重组质粒,转染T24细胞。采用Western blot检测重组质粒对Bcl-2蛋白表达的影响,MTT法观察重组质粒对T24细胞体外生长的抑制作用,Annexin-V-PI双染法流式细胞术(FCM)检测转染重组质粒后细胞的凋亡状况。结果成功构建了pGenesil-1-Bcl-2 siRNA重组质粒,并成功转染T24细胞。重组质粒抑制Bcl-2基因的表达接近70%;转染重组质粒后,T24细胞的活力降低为(66.9±5.6)%;重组质粒组的T24细胞凋亡率为34.55%～45.39%。结论pGenesil-1-Bcl-2 siRNA重组质粒明显下调Bcl-2在膀胱癌细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞生长,促进其凋亡。     

转染肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对膀胱癌细胞的抑制作用

目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）对膀胱癌细胞的抑制作用。方法构建TRAIL融合增强绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达载体，脂质体法转染膀胱癌细胞株玎细胞。荧光显微镜下计算转染率。分别采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot检测TRAIL的表达。采用流式细胞仪检测细胞凋亡，噻唑蓝（MTT）法、细胞倍增时间和集落形成率观察TRAIL的抑制作用。结果48h观察重组载体转染率为38．4％，空载体转染率为35．3％（P〉0．05）．RT-PCR和Western blot证实转染后EJ细胞中TRAIL的表达明显增加；凋亡率明显高于转染空白载体和未转染组（P〈0．01）；EJ细胞增殖受到明显抑制（P〈0．01）。结论TRAIL具有诱导膀胱癌细胞凋亡、抑制增殖的作用，有望成为治疗膀胱癌的新方法。     

RNA干扰抑制Cyr61表达对人脑胶质瘤细胞生物学行为的影响

目的 观察RNA干扰技术沉默Cyr61基因表达对人脑胶质瘤U251细胞生物学行为的影响.方法 针对Cyr61 mRNA的序列设计合成小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pRNAT-Cyr61重组质粒,转染人脑胶质瘤U251细胞;RT-PCR和Western blot检测其对U251细胞内源性Cyr61表达的影响;用噻唑蓝(MTT)比色法观察U251细胞体外增殖活性的变化;用Transwell 小室法检测U251细胞体外侵袭能力的改变;流式细胞仪检测U251细胞凋亡并用透射电镜观察凋亡后的细胞形态学变化.结果 pRNAT-Cyr61重组质粒在mRNA及蛋白水平分别显著抑制Cyi61基因表达,抑制率分别最高达到74.87%和78.23%;U251细胞的体外生长抑制率最高达68.15%,侵袭细胞数下降至(46.00±2.82)个;U251细胞凋亡率最高达53.16%.结论 pRNAT-Cyt61可抑制Cyr61在人脑胶质瘤U251细胞中的表达,并抑制细胞的增殖活性和侵袭能力,促进细胞凋亡.     

RNAi沉默pyk2基因对鼠脑胶质瘤细胞增殖、侵袭能力的影响

目的 探讨pyk2小干扰RNA表达载体对小鼠脑胶质瘤G422细胞增殖、侵袭能力的影响.方法 用以pGenesil-1质粒为载体,以pyk2为靶基因,构建短发夹状小干扰RNA表达载体.用pyk2短发夹状小干扰RNA表达载体转染体外培养的人脑胶质瘤G422细胞,反转录聚合酶链反应和Western blot法检测pyk2基因和蛋白表达的改变,噻唑蓝(MTT)比色法检测转染后细胞的增殖情况,Transwell小室法测定转染细胞体外侵袭能力.结果 构建了pGenesil-1-pyk2重组质粒,并成功转染G422细胞.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)显示pyk2 siRNA转染G422细胞后显著降低pyk2mRNA的表达,以48 h为著,下降近70%;Western blot证实转染后pyk2蛋白的表达下降近65%;G422细胞的活力降低为(67.1±5.2)%;Transwell小室测定转染细胞体外侵袭能力明显下降.结论 pGenesil-1-pyk2 siRNA重组质粒明显下调pyk2在胶质瘤细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞增殖,抑制其侵袭能力.     

短发卡RNA对人胃癌细胞STAT3基因的沉默作用

目的:探讨STAT3基因小发夹RNA（shRNA）表达质粒对胃癌MKN-45细胞STAT3基因的干扰作用。方法:根据STAT3 mRNA 编码序列，设计RNA干扰靶点，构建STAT3基因的特异性小RNA干扰质粒（psiRNA-H1/STAT3），使用脂质体转染人胃癌细胞系（MKN-45细胞）。实验分为对照（A）组，psiRNA-H1转染（B）组和psiRNA-H1/STAT3转染（C）组。通过RT-PCR和Western Blot检测STAT3特异性小RNA干扰基因对胃癌细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达的影响。结果:psiRNA-H1/STAT3经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确，并经测序证实。将其成功转染MKN-45细胞后，该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.05)。 结论:将成功构建的针对STAT3基因的shRNA表达载体转染MKN-45细胞，能有效抑制该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达，为STAT3基因靶向治疗提供一定的实验依据。     

乙肝病毒X 蛋白对正常肝细胞生物钟基因表达的影响

目的：探讨乙肝病毒X蛋白（HBx）对人正常肝细胞中生物钟基因表达的影响。 方法：分别将HBx表达质粒（pcDNA3.1-HBx）与空载体质粒（pcDNA3.1）转染入人正常肝细胞系L02后,用RT-PCR与Western blot法检测细胞HBx mRNA与蛋白的表达;real-time PCR检测细胞中生物钟基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、CKIε的表达。 结果：RT-PCR与Western blot结果显示,L02细胞转染HBx表达质粒后有明显的HBx mRNA与蛋白表达,而转染空载体质粒的L02细胞无HBx mRNA与蛋白表达。与转染空载体质粒的L02细胞比较,转染HBx表达质粒的L02细胞CLOCK与Cry1的mRNA表达明显升高,而BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry2、CKIε的mRNA表达明显降低,差异均有统计学意义（均P<0.05）。 结论：HBx能使正常肝细胞中的生物钟基因表达发生改变,破坏肝细胞正常的生物节律,这可能为其导致肝癌形成的机制之一。     

siRNA沉默Livin基因表达对肝癌细胞HepG2生物学行为的影响

目的：研究应用siRNA沉默Livin基因表达后肝癌细胞HepG2的生物学功能变化。方法：用脂质体lipofectamineTM2000将携带Livin基因的siRNA载体转染至HepG2细胞内,RT—PCR、Westernblot检测转染前后Livin基因mRNA和蛋白质的表达改变;流式细胞技术（FCM）和TUNEL检测转染前后肝癌细胞凋亡变化。结果：RT—PCR及Westernblot检测发现转染siRNA后Livin基因的mRNA和蛋白质表达均明显下降（P〈0．05）;FCM检测发现实验组、阴性对照组和空白组肝癌细胞HepG2在G1期所占比例分别是（58．994-1173）％、（41．85±2．82）％、（41．25±1．24）％,实验组与其他两组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）;TUNEL技术检测表明实验组肝癌细胞HepG2凋亡数目明显增加,细胞凋亡率为（67．56±2．56）％,凋亡率明显高于阴性对照组（27．21±12．58）％和空白组（14．09±5．16）％（P〈0．05）。结论：在肝癌细胞HepG2中,Livin基因沉默具有诱导肝癌细胞凋亡、抑制肝癌细胞生长的作用。【关键词】癌,肝细胞·肝癌细胞,HepG2·siRNA·基因,Livin     

siRNA沉默VEGF基因对肾癌细胞增殖与凋亡的影响

目的：探讨siRNA干扰血管内皮生长因子（VEGF）基因对人肾细胞癌细胞株（ACHN）细胞增殖与凋亡的影响.方法：化学合成针对VEGF的小干扰RNA,通过脂质体转染至ACHN中,利用Western印迹法检测细胞内VEGF的表达,采用台盼蓝拒染法测定细胞生长曲线,用MTT比色分析法检测细胞增殖抑制率（IR）,用TUNEL方法检测细胞凋亡率（AR）.结果：生长曲线提示,与空白对照组及阴性对照组相比,siRNA1组、siRNA2组ACHN细胞的生长明显减慢 在24 h、48 h、72 h,siRNA1的增殖抑制率为10.6%、18.0%、27.1%,siRNA2增殖抑制率为18.9%、32.7%、40.3%,均高于空白对照组及阴性对照组（P〈0.05） siRNA1组的细胞凋亡率为10.7%、15.2%、20.3%,siRNA2组的细胞凋亡率为17.3%、26.2%、37.4%,均高于空白对照组及阴性对照组（P〈0.05） siRNA1组、siRNA2组VEGF蛋白表达水平明显低于空白对照组及阴性对照组,其中siRNA2对ACHN细胞的IR、AR和VEGF蛋白表达的抑制作用均显著高于siRNA1组（P〈0.05）.结论：VEGF在肾癌的发生发展中起着重要作用,化学合成的VEGF-siRNA能特异性抑制肾细胞癌ACHN细胞株中VEGF的表达,抑制细胞生长增殖,促进细胞凋亡.对于VEGF基因高表达的肾细胞癌患者,针对VEGF的RNAi技术有望成为肾细胞癌新的基因治疗手段.     

DNMT1、DNMT3bsiRNA重组质粒转染对人膀胱癌细胞DNMTs表达的影响及其生物学效应

目的：探讨DNMT1、DNMT3b基因在膀胱癌发生发展中的作用。方法：①将DNMT1、DNMT3bsiRNA重组质粒分别单独和共同转入人膀胱癌细胞系Nu87;②半定量RT—PCR和WesternBlot分别检测DNMT1和DNMT3b基因mRNA和蛋白水平的变化;③用MTT法观察各组细胞生长曲线,流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化。结果：单独和共同转染DNMT1（或DNMT3b）mRNA、蛋白表达量明显下降,能影响BIU一87的生长曲线,使细胞增殖减慢,并使细胞周期阻滞于G1期,明显提高细胞调亡率;转染空质粒和单独转染DNMT3bsiRNA重组质粒对BIU-87细胞的生长和增殖无明显影响。结论：联合转染DNMT1、DNMT3bsiRNA重组质粒,可同时下调DNMT1和DNMT3b在BIU87细胞中的表达,并能在体外抑制BIU-87细胞生长,促进细胞凋亡发生,其效果优于单独转染的重组质粒。单独转染DNMT3bsiRNA重组质粒对BIU-87细胞的生长和增殖无明显影响。     

RNA干扰沉默酸性鞘磷脂酶1基因对人成纤维细胞凋亡的影响

目的为研发保护女性生殖细胞的小分子干扰RNA（siRNA）类药物,以人包皮成纤维细胞（HFF）为模型,检测靶向凋亡关键基因酸性鞘磷脂酶1（SMPD1）基因的siRNA对HFF凋亡的抑制作用。方法设计合成三对靶向SMPDI基因的siRNA并体外转染HFF细胞,转染后48h用丝裂霉素（MMC）诱导细胞凋亡。荧光定量逆转录-聚合酶链反应（O-RT-PCR）法及免疫印迹（Western blot）检测siRNA转染后SMPD1在mRNA水平和蛋白水平的变化,Annexin V—PI双染检测细胞凋亡率。用脂质体（lipofectamine 2000）和无干扰siRNA（NT siRNA）作为对照。结果siRNA1、2、3对SMPD1基因mRNA的抑制效率分别为（67．0±9．0）％、0％、（45．0±2．1）％,以siRNA1最高,蛋白水平的抑制也呈现相同变化。siR-NA1组细胞凋亡率为15．2％,明显低于MMC组（26．3％）。结论靶向SMPD1的siRNA可以抑制人包皮成纤维细胞凋亡。     

应用RNA干扰技术阻断PC-3细胞中survivin基因的表达

目的:用真核转录载体pS ilencerTM3.1-H1 neo构建针对survivin基因的重组真核转录载体,并转染前列腺癌细胞系PC-3,通过RNA干扰(RNA i)阻断PC-3细胞中survivin基因的表达,并研究survivin基因沉默后对PC-3细胞凋亡产生的影响。方法:将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pS ilencerTM3.1-H1 neo线性质粒用T4DNA连接酶连接,重组质粒经酶切及DNA测序鉴定后,用脂质体法转染PC-3细胞,通过RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验检测survivin的表达变化,并用流式细胞术检测转染后PC-3细胞的凋亡变化,MTT法检测细胞生长速度的变化。结果:酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体。RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验表明,pS ilencer3.1-SVV2和pS ilencer3.1-SVV3重组载体有效地阻断了PC-3细胞中survivin基因的表达,survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%~15%,细胞生长速度明显变慢。结论:成功构建了针对survivin基因的真核转录载体pS ilencer3.1-SVV1、pS ilencer3.1-SVV2和pS ilencer3.1-SVV3,后两者可有效地阻断前列腺癌细胞系PC-3细胞中survivin基因的表达,并使转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%~15%,细胞生长速度明显变慢。     

RNA干扰和洛拉曲克对结直肠癌LOVO细胞胸苷酸合成酶表达及细胞增殖的影响

目的探讨下调胸苷酸合成酶（Ts）基因以及化疗药洛拉曲克对人结直肠癌LOVO细胞胸苷酸合成酶表达水平以及对细胞生长、凋亡的影响。方法构建针对人Ts基因的小分子干扰RNA（siRNA）和阴性对照,转染至LOVO细胞,利用RT—PCR和Westernblot技术观察沉默TS基因后其基因和蛋白表达水平的变化,MTF法检测细胞增殖情况;另联合洛拉曲克作用于LOVO细胞,观察两者对LOVO细胞的TS蛋白表达和细胞生长的影响。结果转染TSsiRNA后,LOVO细胞TSmRNA及蛋白的表达水平明显低于阴性对照组,细胞增殖速度亦低于对照组（均P〈0．05）。TSsiRNA联合洛拉曲克组细胞IC50值为（1．46±0．25）μm01／L,而阴性对照组和单用洛拉曲克组的IC50值分别为（6．81±0．31）μmol／L和（6．47±0．43）μmol／L。TSsiRNA联合洛拉曲克作用于细胞36h后。细胞凋亡指数为（62．12±0．89）％,高于单用TSsiRNA和洛拉曲克[（21．56±0．67）％和（40．51±0．83）％．均P〈0．05]。结论TSsiRNA可以下调人LOVO细胞中TS基因和蛋白的表达,使细胞生长速度减慢,凋亡增加,并可以增强洛拉曲克的药物敏感性。     

siRNA沉默Ppif基因表达对大鼠肾细胞增殖和凋亡的影响

目的：应用小干扰RNA（smallinterferingRNA,siRNA）抑制大鼠基因Ppif的表达,探讨其对大鼠肾细胞（NRK）增殖和凋亡的影响。方法：体外化学合成针对Ppif基因的siRNA序列,在脂质体介导下转染NRK细胞,RT—PCR检测PpifmRNA表达水平,Westernblot检测Ppif蛋白表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡状况,MTT法检测细胞增殖活性。结果：PpifsiRNA转染NRK细胞24h后,所设计的3对针对不同靶点的siRNA与对照组相比,起始于405、556位点的sIRNA在基因水平对Ppif无明显抑制效应（P〉0．05）;起始于198位点的siRNA在基因和蛋白水平均有明显的抑制效应,基因水平下降75．25％（P〈0．05）;蛋白水平下降72．13％（P〈0．05）。MTT结果显示NRK细胞增殖能力显著增加,转染24h后,siRNA1～siRNA4细胞抑制率分别为（68．6±3．6）％、（5．3±4．3）％、（7．6±6．3）％和（4．1±4．5）％,凋亡率明显下降。结论：体外化学合成的PpifsiRNA（起始于198位点）可以有效地抑制NRK细胞Ppif的表达,从而抑制细胞凋亡,促进细胞增殖。     

miR-124通过靶向调控PKM2基因的表达抑制前列腺癌PC3细胞的增殖

目的:探讨miR-124抑制前列腺癌PC3细胞增殖活性的机制。方法:利用荧光素酶报告基因验证miR-124能否靶向作用于丙酮酸激酶M2型(PKM2)3'端非编码区(UTR)。将miR-124 mimic转染至PC3细胞后,采用实时荧光定量PCR和Western印迹检测前列腺癌PC3细胞PKM2 mRNA和蛋白的表达水平,MTT法检测miR-124 mimic与PKM2 siRNA对PC3细胞生长活性的影响。结果:与人前列腺上皮细胞RWPE-1比较,PC3细胞中PKM2 mRNA和蛋白水平表达分别上调(5.12±0.35)倍和(4.05±0.20)倍(P0.05)。荧光素酶报告基因结果证实,PKM2是miR-124调控的靶基因,miR-124可特异性地结合于PKM2 mRNA的3'-UTR。转染miR-124 mimic 24 h后,PKM2蛋白水平下调至阴性对照组(0.16±0.04)倍(P0.05),但对PKM2 mRNA表达无显著影响(P0.05)。MTT结果显示,转染miR-124 mimic和PKM2 siRNA都能显著抑制PC3细胞的增殖,但miR-124 mimic对PC3细胞生长活性的抑制能力较PKM2 siRNA强。转染miR-124 mimic和PKM2 siRNA 24 h和48 h后,PC3细胞的增殖率分别为(66.20±5.10)%和(82.10±6.35)%(P0.05)、(49.34±2.37)%和(70.10±5.80)%(P0.05)。结论:miR-124可通过靶向调控PKM2基因的表达而抑制前列腺癌PC3细胞的增殖。