CDK2基因沉默联合达卡巴嗪对B16-F1黑素瘤的生长抑制作用

目的 探讨CDK2基因沉默后对达卡巴嗪(DTIC)治疗B16-F1黑素瘤抑瘤效应的影响.方法 实验设对照组、CDK2-shRNA组、DTIC组、CDK2-shRNA+ DTIC组,MTT法检测各组细胞生长抑制情况,计算药物相互作用指数(CDI值),AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况.建立C57 BL/6小鼠B16-F1细胞移植瘤模型,分组实验,持续观察18d,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤生长抑制率,TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡情况.结果 与对照组相比,CDK2-shRNA组、DTIC组、CDK2-shRNA+ DTIC组在72h的细胞相对存活率分别为(40.6±2.8)％、(45.2±3.7)％、(28.7±2.1)％,细胞凋亡率分别为(25.1±3.3)％、(15.6±2.2)％和(45.6±3.5)％,细胞相对存活率显著降低(F=458.04,P＜ 0.05)而细胞凋亡率显著升高(F=115.46,P＜0.05),其中CDK2-shRNA+ DTIC组比DTIC组的细胞相对存活率显著降低(P＜0.01),而细胞凋亡率显著升高(P＜0.01);两药相互作用指数(CDI值)＜0.7.治疗第6天,对照组、CDK2-shRNA组、DTIC组及CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤体积分别为(185.44±68.97) mm3、(83.91±14.33)mm3、(123.70±20.85) mm3、(34.54±10.72) mm3.从治疗的第6天开始,与对照组相比,CDK2-shRNA组、DTIC组及CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤生长速度明显降低(F=11.819,P＜0.05),而CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤生长速度明显低于DTIC组(P=0.04);与对照组相比,CDK2-shRNA组、DTIC组、CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤生长抑制率分别为52.2％、41.2％、86.4％,组织细胞凋亡指数分别为(32.93±3.72)％、(21.62±3.54)％、(63.29±4.74)％,组织细胞凋亡指数显著升高(F=222.25,P＜0.05),其中CDK2-shRNA+ DTIC组的组织细胞凋亡指数显著高于DTIC组(P＜0.01).结论 沉默CDK2基因的表达可以增加DTIC对黑素瘤的生长抑制作用,二者体外有协同效应,通过增加肿瘤细胞的凋亡是其机制之一.     

携带MIA基因单核细胞增生性李斯特菌抑制恶性黑素瘤的研究

目的 探讨携带黑素瘤抑制性活性蛋白(MIA)基因的单核细胞增生性李斯特菌(LM)对黑素瘤的抑制作用.方法 构建载体pERL3-hlv-MIA,电转化单核细胞增生性李斯特菌建立携带MIA基因 的单核细胞增生性李斯特菌(LM-hly-MIA),Western鉴定.实验小鼠随机分成生理盐水组(A组)、LM组(B组)、LM-hly-MIA组(C组),免疫后次日给予小鼠背部皮下接种1×107/ml.B16细胞0.1 mL.记录注射部位肿瘤的大小与小鼠的一般情况.结果 经酶切及Western Blot鉴定表明成功构建LM-hly-MIA,体内试验显示生理盐水组、LM组、LM-hly-MIA组小鼠肿瘤平均重量分别为4.33±0.91 g、3.36±0.41 g、1.89±0.52 g,其中LM的肿瘤抑制率为22.4%,LM-hly-MIA的肿瘤抑制率为61.5%(P＜0.05).结论 携带MIA基因减毒单核细胞增生性李斯特菌明显抑制黑索瘤B16的生长.     

miR-21、miR-494对黑素瘤A375细胞凋亡和细胞周期的影响

目的 探讨miR-21抑制物和miR-494模拟物转染A375细胞的最佳有效转染浓度及其对黑素瘤A375细胞增殖的影响.方法 取6个浓度梯度的miR-21抑制物和miR-494模拟物转染A375细胞,实时荧光定量PCR法检测相应的miRNA.继而用Cy5标记的miRNA模拟物阴性对照转染A375细胞,荧光显微镜下观察转染效率.用流式细胞仪检测转染后细胞增殖的变化.结果 从A375细胞中成功提出miRNA.定量PCR结果显示,当转染物miR-21抑制物浓度为120 nmol/L时,转染细胞内有miR-21模拟物最大程度的下调表达,2-△△Ct值为0.80(0.65 ～ 0.92),低于对照组;当miR-494模拟物浓度为250 nmol/L时,转染细胞内有miR-494模拟物最大程度的上调,2-△△Ct值为126.82(111.52～144.22),明显高于对照组;miR-21抑制物转染组与miR-494模拟物转染组G1期细胞比率分别为(61.61±3.25)％、(61.05±3.17)％,高于对照组(P＜0.05);增殖指数分别为(38.39±3.25)％、(38.95±3.17)％,低于对照组(P＜0.05);细胞凋亡率分别为(27.74±1.39)％、(34.30±2.35)％,高于对照组(P＜0.01),细胞转染效率达90％以上.结论 miR-21抑制物和miR-494模拟物促使肿瘤细胞的G1期阻滞和促进凋亡作用,miR-21可增强A375细胞增殖,有原癌基因样功能;miR-494可抑制A375细胞增殖,有抑癌基因样作用.     

干扰素γ对小鼠巨噬细胞株RAW264.7吞噬、杀伤阿萨希毛孢子菌的影响

目的 研究干扰素γ对小鼠巨噬细胞株RAW264.7吞噬、杀伤阿萨希毛孢子菌(T.asahii的作用,探讨干扰素γ临床治疗T.asahii感染的可能性.方法 不同浓度(10、100、1000 U/ml)干扰素γ与RAW264.7细胞共孵育18h后,分别与T.asahii临床株共培养45 min、4h,以不加干扰素γ组为对照组.45 min后在显微镜下观察RAW264.7细胞吞噬T.asahii的情况,计数吞噬个数及计算吞噬率.4h后检测RAW264.7细胞的杀伤活性,即检测T.asahii的菌落形成单位(cfu/ml),计算生长抑制率.采用SPSS 16.0软件进行统计学分析,作方差齐性检验后,用单因素方差分析(ANOVA)中的Bonferroni法进行各组均数间的两两比较.结果 10、100、1000 U/ml干扰素γ组小鼠巨噬细胞株RAW264.7吞噬T.asahii的个数分别为25.12±1.81、35.88±3.56、52.12±3.23,吞噬率依次为25.12％、35.88％、52.12％,与对照组吞噬T.asahii的个数(13.62±2.39)比较,差异均有统计学意义(P＜ 0.01);RAW264.7细胞对T.asahii的杀伤活性分别为(58.62±4.89)×500、(45.50±3.02)×500、(34.62±4.24)×500 cfu/ml,生长抑制率依次为25.21％、41.95％、55.83％,RAW264.7细胞的杀伤活性与对照组(68.12±3.39)× 500 cfu/ml比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 干扰素γ呈剂量依赖性增强小鼠巨噬细胞株RAW264.7吞噬、杀伤T.asahii的作用.     

丹参酮ⅡA诱导人黑素瘤细胞A375自噬的小鼠模型研究

目的探讨丹参酮ⅡA是否通过诱导自噬的作用机制抑制人黑素瘤细胞A375的增殖。方法将人黑素瘤细胞A375制备的模型小鼠24只随机分为对照组、紫杉醇组(尾静脉注射,8mg/kg,隔天1次,持续28天)和丹参酮ⅡA低、高剂量组(25mg、50mg 1次/d,持续28天),每组6只。实验结束后,随即处死小鼠,手术剥取瘤块称重。采用RT-PCR测定小鼠瘤组织中自噬相关基因Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)-ⅡmRNA水平;Western印迹法检测Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表达水平。结果丹参酮ⅡA可显著降低人黑素瘤细胞A375制备的模型小鼠肿瘤质量系数,抑瘤率达56.70%;可显著上调瘤组织中自噬相关基因Beclin-1、LC3-ⅡmRNA及其蛋白的表达,较模型组差异均有统计学意义(P0.05)。结论丹参酮ⅡA通过诱导人黑素瘤细胞A375的自噬机制,从而抑制其增殖,延缓肿瘤生长。     

梅花针叩刺增强咪喹莫特治疗SKH-1小鼠皮肤鳞状细胞癌的疗效

目的 评估咪喹莫特联合梅花针治疗SKH-1小鼠皮肤鳞状细胞癌(鳞癌)的疗效,探讨其免疫学机制.方法 将紫外线诱导成瘤的40只SKH-l皮肤鳞癌小鼠随机分4组,每组10只:对照组无处理;梅花针组:每天梅花针叩刺所有瘤体1次;咪喹莫特组:每天外涂5％咪喹莫特乳膏1次,剂量为1.2 g/kg;联合组:先梅花针叩刺所有瘤体,止血后再外涂5％咪喹莫特乳膏1次,剂量同前.各组小鼠连续治疗30 d.每日观察并拍照记录各组小鼠肿瘤形态学变化,每3d测量1次瘤体大小,比较4组瘤体体积变化及小鼠生存率变化.治疗结束后取各组小鼠瘤体,比较4组瘤体组织病理学变化.实时荧光定量PCR检测各组小鼠瘤体内干扰素(IFN)-α、IFN-β、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及IL-12 mRNA表达.结果 联合组小鼠背部瘤体生长缓慢,部分小的瘤体有消退现象;对照组、梅花针组和咪喹莫特组瘤体一直在增长,但梅花针组、咪喹莫特组生长速度较对照组慢.治疗前,4组小鼠瘤体体积差异无统计学意义(F=0.90,P＞0.05).治疗24d后,4组小鼠瘤体体积差异有统计学意义(F=5.16,P＜0.05),LSD-t检验示,联合组瘤体体积显著低于对照组(P＜ 0.01),余各组间差异均无统计学意义(P＞ 0.05).经Log-rank检验,4组小鼠生存率曲线分布不同(x2=8.32,P＜0.05),联合组生存情况优于对照组(x2=4.62,P=0.03),而梅花针组、咪喹莫特组与对照组、联合组比较,小鼠生存率差异均无统计学意义(P＞0.05).组织病理学检查显示,对照组、梅花针组细胞异形性明显,排列密集,可见大量的肿瘤细胞,部分可见角化珠,咪喹莫特组肿瘤细胞少许死亡;联合组肿瘤细胞大量死亡,核异形不明显,角化增多.实时荧光定量PCR显示,联合组IFN-α、IFN-β、IL-12、IL-1β及TNF-α mRNA相对表达量均显著高于对照组、梅花针组和咪喹莫特组(均P＜0.05),咪喹莫特组IL-1β mRNA相对表达量显著高于对照组(P＜ 0.01),余各组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 梅花针叩刺能有效增强咪喹莫特抗SKH-1小鼠皮肤鳞癌活性及免疫学效应.     

二甲双胍和顺铂联用对B16F10黑素瘤细胞的协同抑制效应

目的探讨二甲双胍和顺铂联合用药对B16F10黑素瘤细胞的影响。方法体外培养黑素瘤细胞株B16F10,并用一定浓度的二甲双胍和顺铂处理肿瘤细胞。采用MTT法检测肿瘤细胞活性,并用流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况。结果 MTT结果表明,二甲双胍顺铂联用组细胞活性显著低于药物单用组(P0.05),二甲双胍顺铂存在对肿瘤的协同抑制作用(CDI1);流式细胞术结果表明,二甲双胍顺铂联用组的凋亡细胞比率(23.21±4.11)%明显高于空白对照组(1.21±0.12)%、二甲双胍组(2.32±0.16)%及顺铂组(14.12±1.78)%(P0.05)。结论二甲双胍与顺铂具有协同抑制黑素瘤生长的作用,并且和凋亡诱导效应的增强相关。     

KPNA2基因在皮肤黑素瘤中的表达及功能

目的研究KPNA2基因在皮肤黑素瘤中的生物学功能。方法基因芯片分析KPNA2在皮肤黑素瘤中的表达,Real time PCR检测KPNA2基因在皮肤黑素瘤组织及细胞中的表达水平。小干扰RNA转染A375细胞株,平板克隆、MTT法检测KPNA2基因敲低组、对照组皮肤黑素瘤细胞的增殖活性。Transwell实验计算皮肤黑素瘤细胞过膜数量,研究KPNA2与皮肤黑素瘤细胞迁移作用的关系。结果 KPNA2在皮肤黑素瘤组织中的表达显著高于癌旁皮肤组织,表达随着病理分级的恶性程度的升级而增高。高表达KPNA2组患者预后明显比KPNA2组患者差。平板克隆及MTT实验结果显示si-KPNA2组的细胞活性及增殖明显受抑制(P均<0.01),Transwell实验显示si-KPNA2组的细胞过膜数量(87.33±6.20)/视野,明显低于对照组(271.70±8.70)/视野,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 KPNA2在皮肤黑素瘤组织表达升高,促进黑素瘤细胞的增殖和迁移,其可作为黑素瘤的潜在临床诊治靶点及预后标志物。     

Ki67启动子调控增殖腺病毒对人黑素瘤裸鼠移植瘤的生长抑制作用

目的:评价携带Ki67启动子的条件增殖型腺病毒Ki67 - ZD55对人A375细胞恶性黑素瘤裸鼠移植瘤模型的疗效.方法:将裸鼠黑素瘤移植瘤模型鼠随机分为3组,每组10只,分别给予PBS、ZD55- EGFP、Ki67- ZD55治疗后,测量肿瘤生长体积,免疫印迹法检测肿瘤组织E1A蛋白的表达,TUNEL法检测肿瘤组织凋亡,免疫组化法检测EIA、Bcl -2、BAX蛋白的表达.结果:Ki67- ZD55组的肿瘤生长速度明显慢于PBS组和ZD55- EGFP组,肿瘤生长曲线显示Ki67 - ZD55具有抑制肿瘤生长的效果(P＜0.05);TUNEL检测显示Ki67- ZD55治疗组的凋亡指数明显高于PBS组(P＜0.05)和ZD55-EGFP组(P＜0.05);免疫组化显示Ki67 - ZD55组可以上调BAX、下调Bcl -2的表达.结论:Ki67 -ZD55可以明显抑制人A375黑素瘤细胞裸鼠移植瘤的生长.     

3-甲基腺嘌呤增强ALA-PDT对皮肤鳞状细胞癌A431细胞的杀伤作用

目的探讨5-氨基酮戊酸光动力疗法(ALA-PDT)联合3-甲基腺嘌呤(3-MA)对皮肤鳞状细胞癌A431细胞的杀伤作用及其机制研究。方法体外培养人皮肤鳞状细胞癌A431细胞,设置不同的ALA浓度(0、0.20、0.40、0.80、1.60 mmol/L)及不同的培养时间(12、24、48 h),对A431细胞进行ALA-PDT处理,采用MTT法检测细胞增殖活性并计算半抑制浓度(IC_(50))值。根据实验需要将A431细胞分为空白对照组、ALA-PDT组、3-MA组和ALA-PDT+3-MA组。分组处理后,MTT法检测细胞增殖;流式细胞术分别检测细胞凋亡(Annexin V-FITC/PI双染法)以及细胞线粒体膜电位变化(JC-1染色法);单丹磺酰尸胺(MDC)染色法观察细胞自噬情况;Western blot检测凋亡和自噬相关蛋白的表达水平。结果 ALA-PDT对A431细胞的增殖活性有明显的抑制作用,且呈剂量和时间依赖性。与对照组比较,ALA-PDT组细胞增殖活性、线粒体膜电位均显著降低(P0.05),而细胞凋亡与自噬水平显著提高(P0.05),Cleaved-caspase-3、Bax、胞质Cyt C、LC-3Ⅱ、Beclin1等蛋白表达显著上调(P0.05),Bcl-2表达显著下调(P0.05)。与ALA-PDT组比较,ALA-PDT+3-MA组细胞增殖活性、线粒体膜电位以及细胞自噬水平显著降低(P0.05),细胞凋亡水平显著提高(P0.05),Cleaved-caspase-3、Bax、胞质Cyt C等蛋白表达显著上调(P0.05),而Bcl-2、LC-3Ⅱ、Beclin1等蛋白表达显著下调(P0.05)。结论 3-MA可通过抑制细胞自噬增强ALA-PDT对A431细胞产生的杀伤作用。     

女性闭经后萎缩性尿道炎患者血清FSH、LH、PRL检验的临床意义分析

目的:分析并探讨女性闭经后萎缩性尿道炎患者血清卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、泌乳素(PRL)检验指标的意义。方法:选取2012年1月至2016年1月我院收治的女性闭经后萎缩性尿道炎患者80例为观察组,选取同期体检健康女性80例为对照组,检测两组FSH、LH、PRL水平。结果:观察组FSH水平为(11.73±6.31)mU/mL,LH水平为(12.31±7.34)mU/mL,PRL水平为(38.13±12.14)ng/mL。对照组FSH水平为(6.57±2.45)mU/mL,LH水平为(4.49±3.12)mU/mL,PRL水平为(15.24±5.35)ng/mL。观察组FSH、LH以及PRL水平明显高于对照组(P0.05)。观察组雌二醇(E_2)水平为(41.24±16.53)pg/mL,孕酮(P)水平为(0.51±0.34)pg/mL,睾酮(T)水平为(0.33±0.14)ng/mL。对照组E_2水平为(51.42±9.43)pg/mL,P水平为(0.52±0.32)pg/mL,T水平为(0.34±0.15)ng/mL。观察组E_2水平明显低于对照组(P0.05),两组P、T检测无显著差异(P0.05)。结论:女性闭经后萎缩性尿道炎患者血清FSH、LH、PRL明显升高,临床上可作为闭经后萎缩性尿道炎诊断进行参考,提前做好防治措施。     

米非司酮对子宫内膜异位症型痛经患者前列腺素及孕激素的影响

目的:探讨米非司酮对子宫内膜异位症型痛经患者前列腺素及孕激素的影响。方法:选择2013年1月至2016年1月我院接诊的100例子宫内膜异位症痛经患者,通过随机数表法分为观察组和对照组,各50例。对照组给予达那唑治疗,观察组在对照组基础上加用米非司酮片,比较两组患者治疗效果。结果:治疗后,观察组前列腺素F_(1α)(PGF_(1α))、血栓素B_2(TXB_2)均低于对照组[(37.98±3.12)pg/mL vs.(48.76±4.02)pg/mL,(134.23±27.54)pg/mL vs.(156.78±26.41)pg/mL](P0.05);卵泡生成素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E_2)优于对照组[(4.07±1.32)U/L vs.(7.45±1.74)U/L,(9.34±1.11)U/L vs.(13.87±1.25)U/L,(784.31±40.91)pmol/L vs.(573.56±35.42)pmol/L](P0.05);痛经VAS评分明显低于对照组[(2.51±0.35)分vs.(4.78±0.33)分](P0.05);观察组总有效率明显比对照组高[98.00%(48/50)vs.78.00%(39/50)](P0.05)。结论:在子宫内膜异位症痛经患者使用米非司酮效果显著,可有效改善前列腺素及孕激素水平,缓解痛经症状,值得应用推广。     

申克孢子丝菌酵母相对人THP-1巨噬细胞样细胞p38MAPK激活及白细胞介素6表达的影响

目的 探讨申克孢子丝菌酵母相对人急性单核细胞白血病细胞(THP-1)巨噬细胞样细胞p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)活化及白细胞介素6(IL-6)表达的影响.方法 实时荧光定量反转录PCR分析申克孢子丝菌酵母相刺激THP-1巨噬细胞样细胞3、6h后IL-6 mRNA表达水平变化,酶联免疫吸附法检测刺激24 h后IL-6分泌量;Western印迹法分析2×106 CFU/ml申克孢子丝菌酵母相体外作用于THP-1巨噬细胞样细胞30 min和60 min后p38MAPK磷酸化水平的变化,同时检测100 nmol/L地塞米松(p38MAPK抑制剂)预处理THP-1巨噬细胞样细胞30 min后p38MAPK磷酸化水平及IL-6 mRNA表达水平的变化.采用SPSS19.0统计软件,进行多因素方差分析、单因素方差分析,组间多重比较采用LSD检验.结果 刺激THP-1巨噬细胞样细胞3h后,酵母相组、凝胶多糖组、空白对照组IL-6 mRNA表达水平分别为56.81±7.36、26.69±1.22、0.97±0.05,刺激6h后分别为378.03±16.67、276.24±39.13、1.02±0.04,组间差异有统计学意义(F=5 552.22,P＜0.001).申克孢子丝菌酵母相刺激6h后IL-6 mRNA表达高于刺激3h后(q=16.74,P＜0.001),申克孢子丝菌酵母相与THP-1巨噬细胞样细胞共孵育24 h后,酵母相组、凝胶多糖组及空白组细胞上清液中IL-6浓度分别为(59.96±18.16)、(91.01±17.27)、(5.50±2.30) pg/L,组间差异有统计学意义(F=26.62,P＜0.01);酵母相组高于空白对照组(P＜ 0.01).地塞米松处理后,酵母相组IL-6 mRNA表达水平(4.46±1.03)低于未用地塞米松处理组(493.52±113.87,P＜0.001).申克孢子丝菌酵母相作用THP-1巨噬细胞样细胞30、60 min后,磷酸化p38MAPK蛋白相对表达量均高于空白对照组(P＜0.01).地塞米松预处理THP-1巨噬细胞样细胞后,磷酸化p38MAPK水平低于未用地塞米松处理组,差异有统计学意义(q=10.81,P＜ 0.01).结论 人THP-1巨噬细胞样细胞体外与申克孢子丝菌酵母相作用后,通过激活p38MAPK信号通路促进IL-6表达.     

系统性硬皮病患者外周血Th17/Treg细胞与病情活动的相关性

目的 探讨系统性硬皮病（SSc）患者外周血Th17/Treg细胞与病情活动的相关性。方法 45例SSc患者中活动组21例,非活动组24例,正常人对照组24例。用流式细胞仪检测外周血Th17、Treg细胞各占CD4+细胞的百分比。荧光定量PCR法检测外周血单一核细胞（PMBC）中白介素17A（IL-17A）、维A酸类核孤儿受体γ（RoRγt）、叉头状螺旋转录因子3（FoxP3）mRNA水平。酶联免疫吸附试验检测血清IL-17水平。结果 ①SSc活动组、非活动组和正常人对照组外周血Th17细胞占CD4+细胞的百分比分别为2.34 ± 1.19、0.68 ± 0.39和0.57 ± 0.49,活动组显著高于非活动组、正常人对照组（P < 0.05）。3组外周血Treg细胞比例差异无统计学意义（P > 0.05）;②SSc活动组、非活动组和正常人对照组外周血IL-17水平分别为53.60 ± 9.90、15.18 ± 3.24、15.53 ± 4.12 pg/ml,对照组和非活动组均显著低于活动组（P < 0.05）;③SSc活动组、非活动组和对照组3组外周血细胞IL-17A mRNA表达水平分别为11.73 ± 0.80、9.77 ± 1.30、10.79 ± 0.74,活动组显著高于对照组、非活动组（P < 0.05）;3组外周血细胞中RoRγt mRNA表达水平分别为18.48 ± 1.09、15.89 ± 1.48、17.77 ± 1.64,活动组显著高于对照组和非活动组（P < 0.05）,3组外周血细胞FoxP3mRNA表达水平差异无统计学意义（P > 0.05）;④外周血Th17细胞比例、血清IL-17水平与活动组SSc患者的病情活动度呈正相关,分别为r = 0.675（P < 0.05）、r = 0.644（P < 0.05）。结论 Th17细胞亚群在活动期SSc患者体内扩增,其扩增与SSc活动密切相关。     

HINT1对人黑素瘤A375细胞裸鼠皮下异种移植瘤模型肿瘤生长及凋亡的影响

目的 探讨组氨酸三聚体核苷结合蛋白1（HINT1）对人黑素瘤A375细胞裸鼠皮下异种移植瘤模型肿瘤生长及凋亡的影响。方法 三组裸鼠随机皮下接种HINT1-A375、neo-A375及未转染的A375细胞,观察各组移植瘤的生长情况,计算成瘤率。组织病理切片观察移植瘤组织形态学改变,并应用TUNEL法检测移植瘤组织中细胞凋亡情况。结果 三组裸鼠皮下异种移植瘤成瘤率均为100%。HINT1组移植瘤生长速度慢,接种后18 d移植瘤生长速度显著低于neo组及A375细胞组（P < 0.01）。HINT1组、neo组及A375细胞组肿瘤重量分别为（0.04 ± 0.00） g、（0.23 ± 0.00） g、（0.29 ± 0.03） g;肿瘤体积分别为（0.06 ± 0.04） cm3、（0.34 ± 0.15） cm3、（0.43 ± 0.19） cm3。HINT1组肿瘤重量及体积均显著低于neo组及A375细胞组（P值均 < 0.01）。组织病理结果显示,与neo组及A375细胞组相比,HINT1组肿瘤团块较小,细胞异形小,病理性核分裂象少见,瘤团内未见大片坏死灶。HINT1组中平均凋亡细胞百分比为12.87% ± 1.18%,显著高于neo组（3.22% ± 0.49%）及A375细胞组（3.00% ± 0.53%）（P值均 < 0.01）。结论 高表达HINT1可显著抑制A375细胞裸鼠皮下异种移植瘤模型肿瘤的生长,促进其凋亡,提示HINT1基因可能是人黑素瘤的抑癌基因之一。     

携带IL-18基因的溶瘤腺病毒对裸鼠恶性黑素瘤移植瘤的抗肿瘤作用

目的 探讨携带IL-18基因的溶瘤腺病毒（ZD55-IL-18）对裸鼠恶性黑素瘤移植瘤的抗肿瘤效果。方法 取A375细胞2 × 106个接种于BALB/c裸鼠腋下组织内,建立裸鼠黑素瘤模型,当移植瘤体积达100 ~ 150 mm3时将其随机分为3组,每组8只,分别于瘤体内注射ZD55-IL-18、Ad-IL-18和磷酸盐缓冲液（PBS）。通过定期测量肿瘤体积观察肿瘤生长抑制情况,并切取肿瘤进行HE染色,观察肿瘤细胞生长形态;激光共聚焦显微镜下观察移植瘤组织IL-18表达水平、E1A蛋白的表达情况。免疫组化检测荷瘤裸鼠肿瘤组织CD34染色标记测定的肿瘤组织微血管密度;TUNEL法检测移植瘤组织细胞凋亡情况。结果 肿瘤生长曲线表明,ZD55-IL-18处理组肿瘤生长速度较PBS组明显减慢,接种44 d后ZD55-IL-18组肿瘤平均体积为（1039.378 ± 29.67） mm3,Ad-IL-18组为（2900.46 ± 62.65） mm3,PBS组为（3980.24 ± 63.78） mm3,各组间差异有统计学意义（P < 0.01）。HE染色发现,ZD55-IL-18处理组细胞核深染,很少见核仁,显示肿瘤组织生长抑制。激光共聚焦结果表明,ZD55-IL-18处理组IL-18的表达阳性率比Ad-IL-18处理组明显增强（P < 0.01）,并可以在肿瘤组织中表达E1A蛋白;免疫组化检测显示,ZD55-IL-18治疗组肿瘤微血管密度明显低于PBS组（P < 0.05）。不同处理组移植瘤细胞凋亡阳性率ZD55-IL-18处理组（86.28% ± 3.25%） ＞ Ad-IL-18处理组（43.67% ± 3.46%） ＞ PBS处理组（10.73% ± 2.48%）,各组之间差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。结论 携带IL-18基因的溶瘤腺病毒ZD55-IL-18对裸鼠恶性黑素瘤移植瘤的生长及转移有抑制作用,并探讨了其可能的作用环节。     

T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3对黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴细胞的影响

目的 探讨体外T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（TIM-3）对与小鼠黑素瘤B16F10细胞共培养的酪氨酸相关蛋白-2（TRP-2180-188）抗原肽刺激小鼠淋巴细胞的影响。 方法 构建TIM-3重组质粒pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2,分别转染重组质粒及空质粒pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2至人上皮293T细胞,继续培养48 h,制备含TIM-3、免疫球蛋白（Ig-tail）的上清液。TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL/6小鼠,分离小鼠脾淋巴细胞,用TRP-2180-188抗原肽和白细胞介素（IL）-2刺激培养5 d,以未刺激细胞作为对照组。构建B16F10细胞与上述TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系,分为空白对照组（加293T细胞培养48 h上清液）、TIM-3组（加含TIM-3上清液）、阴性对照组（加含Ig-tail上清液）。CCK-8法检测细胞增殖情况,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测共培养体系中干扰素（IFN）-γ和肿瘤坏死因子（TNF）-α浓度,流式细胞仪检测共培养体系中CD8+T淋巴细胞。 结果 酶切和测序鉴定证实目的基因正确插入真核表达载体中,检测到转染重组质粒pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2的293T细胞上清液中有TIM-3表达,转染空质粒pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2的293T细胞上清液中有Ig-tail的表达。CCK-8法检测显示24 h时空白对照组、阴性对照组、TIM-3组淋巴细胞增殖活力分别为（100.00 ± 10.42）%、（108.70 ± 9.90）%、（78.06 ± 6.37）%,48 h时分别为（100.00 ± 6.24）%、（168.00 ± 2.98）%、（42.93 ± 5.93）%;24 h、48 h时TIM-3组淋巴细胞活力低于空白对照组和阴性对照组（均P ＜ 0.05）。TIM-3组48 h相比24 h淋巴细胞增殖倍数低于空白对照组和阴性对照组（均P ＜ 0.05）。24 h时,空白对照组、阴性对照组、TIM-3组IFN-γ浓度分别为（216.44 ± 7.85）、（223.67 ± 7.79）、（192.96 ± 5.05） ng/L,48 h时分别为（230.06 ± 4.23）、（167.24 ± 3.33）、（54.95 ± 0.57） ng/L。24 h、48 h时,TIM-3组IFN-γ浓度低于空白对照组和阴性对照组（均P ＜ 0.05）。24 h、48 h时,TIM-3组TNF-α浓度低于空白对照组和阴性对照组（均P ＜ 0.05）。24 h时空白对照组、阴性对照组、TIM-3组CD8+T淋巴细胞中位数分别为0.421%、2.22%、3.30%,48 h时分别为0.577%、0.691%、4.06%。24 h、48 h时TIM-3组CD8+T淋巴细胞中位数高于空白对照组和阴性对对照组。 结论 TIM-3在体外能够抑制B16F10细胞与TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系中淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ、TNF-α,提高CD8+T淋巴细胞。     

Notch1基因对裸鼠皮肤鳞状细胞癌移植瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨Notch1基因在人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞裸鼠移植瘤中的作用。方法 于裸鼠腋下接种0.2 ml 1 × 108/ml的SCL-1细胞悬液,建立人皮肤鳞状细胞癌裸鼠移植瘤模型,将其分为三组：未处理组（接种PBS悬浮的未转染细胞）,空载体转染组（接种空载体转染的细胞）和Notch1转染组（接种Notch1转染的细胞）。连续2周观察转染荷瘤裸鼠的生长情况,采用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）研究肿瘤组织中的细胞凋亡,利用RT-PCR和Western印迹研究肿瘤组织中Notch1、bcl-2和bax mRNA和蛋白的表达。结果 Notch1转染组中肿瘤的生长明显受到抑制,其肿瘤的重量为（0.574 ± 0.219） g,显著低于未处理组（2.642 ± 0.404） g和空载体转染组（2.606 ± 0.512） g（F = 26.642,P 值均 < 0.01）。TUNEL结果表明,Notch1转染组每500个细胞中凋亡的细胞数为87 ± 9,明显高于未处理组（8 ± 2）和空载体转染组（10 ± 3）中细胞凋亡的数目（P < 0.05）;此外,RT-PCR和Western印迹结果表明Notch1转染组中裸鼠肿瘤组织Notch1和bax mRNA和蛋白表达均显著上升,而bcl-2的表达显著下调,三组间比较差异具有统计学意义（P值均 ＜ 0.05）。结论 Notch1基因能抑制人皮肤鳞状细胞癌细胞SCL-1裸鼠皮下移植瘤的生长,诱导SCL-1细胞凋亡,后者可能与bax表达的上升和bcl-2表达的下调相关。     

两性霉素B对人THP-1细胞产生肿瘤坏死因子α、白细胞介素8及p38MAPK活化的影响

目的 探讨两性霉素B对人急性单核细胞白血病细胞系THP-1细胞系分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素8(IL-8)以及p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活化的影响.方法 将THP-1细胞分为空白对照组、两性霉素B组(分别加入2、4、8mg/L两性霉素B处理);阳性对照组(用100 μg/L β葡聚糖或者100 mg/L脂多糖处理).实时荧光定量PCR分析不同刺激物和THP-1细胞作用一定时间后TNF-α、IL-8 mRNA表达水平.酶联免疫吸附试验检测8 mg/L两性霉素B刺激THP-1细胞24 h后上清液中TNF-α分泌量.Western印迹检测8 mg/L两性霉素B作用THP-1细胞后p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平.结果 2、4、8 mg/L两性霉素B刺激6h,TNF-α mRNA水平分别为7.55±1.17、19.47±2.91、57.22±0.65,与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P＜ 0.01、0.001、0.001).IL-8mRNA水平分别为2.98±0.04、5.22±1.35、11.82±1.66,与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P＜ 0.01、0.001、0.001).8 mg/L两性霉素B刺激THP-1细胞1、3、6h后TNF-αmRNA水平分别为8.61±0.30、10.75±0.08、56.98±2.43,与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P＜ 0.05、0.01、0.001).IL-8 mRNA水平分别为2.63±0.28、5.35±0.98、11.73±1.18,与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P＜ 0.05、0.01、0.001).8mg/L两性霉素B刺激THP-1细胞24 h上清液中TNF-α蛋白水平为(4039.06±223.87) ng/L,与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜ 0.001).结论 两性霉素B体外可促进人THP-1细胞p38MAPK蛋白磷酸化及TNF-α和IL-8分泌,具有免疫调节作用.