TaqMan 探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的： 在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法：选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288 bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果：支原体PCR产物大小约为288 bp,质粒质量浓度为13.9 mg/L,A260/Ａ280 (Ratio)为1
.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝/ μL。10 μmol/L的引物浓度和10 μmol/L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101 拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式：Ct= －2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论：支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。     

不同双歧杆菌标准品制备法的比较研究

目的 比较不同的双歧杆菌标准品制备法,筛选适用于实时荧光定量PCR检测的双歧杆菌标准品。方法 以双歧杆菌标准菌株作为实验菌株,分别采用菌株DNA法、PCR产物扩增纯化法、质粒DNA法制备梯度浓度标准品,运用紫外分光光度计和实时荧光定量PCR 技术进行检测,并对数据进行统计学处理。结果 实时荧光定量PCR检测发现,3种不同的双歧杆菌标准品制备法的标准曲线均 r 2 ＞0.990;不同制备法的双歧杆菌标准品DNA浓度和纯度检测比较,质粒DNA制备法所制的双歧杆菌标准品浓度和纯度较另外两种方法高,差异有统计学意义（ P<0.01）。结论 双歧杆菌质粒DNA制备法制备的标准品质量较高,适用于实时荧光定量PCR检测,可以为双歧杆菌分子生物学检测提供参考依据。     

实时荧光PCR定量检测粪便中Akkermansia muciniphila方法研究

目的 建立实时荧光PCR定量检测粪便中Akkermansia muciniphila （A. muciniphila）的方法,为A. muciniphila的定量检测及深入研究提供技术支持。 方法 建立SYBR Green Ⅰ 荧光PCR 定量检测A. muciniphila的方法,利用A. muciniphila标准品制备标准曲线,评价该方法的灵敏度、特异性、抗干扰性及重复性,并对30例人粪便样本进行检测。 结果 标准曲线线性关系良好（R2=0.999）;方法灵敏度可达到1.0×102CFU/mL;该方法可特异性扩增A. muciniphila,不受其他肠道细菌的影响;组内和组间重复性较好,Ct值的变异系数均小于2%;30例人粪便样品中A. muciniphila阳性率为73%,Ct值为17.40～31.77。 结论 本研究建立的实时荧光PCR定量检测粪便中A. muciniphila的方法简便、快速、经济,且具有良好的灵敏度、特异性、抗干扰性和重复性,适用于实际粪便样品的检测。     

一步法实时荧光定量PCR检测白血病WT1基因mRNA

目的 构建RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因mRNA表达的方法,准确定量检测白血病患者微小残留病,指导临床判断预后和早期预测复发.方法 从K562细胞提取的RNA用特异性引物扩增WT1基因,pMD18-T载体克隆法构建荧光定量PCR标准模板,建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测wTl基因方法,并对该方法的灵敏度、重复性和稳定性进行检测.结果 构建的RT-PCR一步法实时荧光定量PCR方法的灵敏度达10-4水平:以拷贝数为1.0x106～1.0×102 cps/ml的标准品,分别进行RT-PCR一步法实时荧光定量PCR扩增后,标准品的Ct值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系,r值达0.998:管间和批间的变异系数均小于8%.结论 所建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因方法的灵敏度、重复性和特异性好;RT和PCR反应过程一步完成,更简便快捷,减少加样和污染机会,更适合临床检测.     

α变形菌纲磁螺菌属TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立一种快速有效检测环境中α变形菌纲磁螺菌属细菌的方法。方法本研究以α变形菌纲磁螺菌属保守且特异的16SrRNA片段为靶序列,化学合成基因序列,制备重组质粒作为磁螺菌属检测的标准品;用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术,针对目的片段基因设计特异性引物和TaqMan荧光探针,进行实时荧光定量PCR检测,运用统计学方法评价该方法的特异性、敏感性及重复性。结果本实验成功构建了质粒PUC19-QC,引物、探针特异性良好,标准曲线在5.10×101~5.10×107拷贝数之间具有较好的线性关系,相关系数R2=0.999。该法最低可检测到5.10×10个DNA拷贝数,灵敏度明显高于普通PCR;重复性试验表明,荧光定量PCR检测结果 Ct值波动范围较小,Ct值的标准差均小于0.23,表明该法重复性好,可靠性高。析因方差分析表明不同稀释度之间的Ct值差异有统计学意义(F=3 125.305,P0.001),三个批次的再现性良好,差异无统计学意义(F=0.057,P=0.945),而浓度分组与时间之间也无交叉效应(F=0.533,P=0.873)。结论本实验所建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术,能够快速有效地检测α变形菌纲磁螺菌属细菌,且检测结果稳定,受外界条件如时间、气温等影响小。     

小鼠脑脊髓炎病毒非编码蛋白片段实时荧光定量PCR标准品的构建

目的 构建小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)非编码蛋白(UTR)片段标准品,用于实时荧光定量 PCR检测小鼠脑脊髓炎病毒.方法 RT-PCR 扩增TMEV UTR片段上80~1094 nt之间长度为1 014 bp的片段,将目的 片段连接至pMD18-T载体,转化至DH5a感受态细胞.分别经 PCR鉴定和序列测定验证重组质粒.分光光度计测量重组质粒的吸光值,换算成拷贝数浓度后作10倍梯度稀释制得质粒标准品.然后进行实时荧光定量PCR分析,绘制标准曲线.结果 TMEV UTR片段成功克隆至pMD18-T载体中,测序结果 表明重组质粒中插入的UTR序列正确,实时荧光定量PCR分析10倍梯度系列稀释的质粒标准品所得到的标准曲线良好,统计学分析显示Ct值与标准品浓度的对数存在良好线性关系,回归系数在0.99以上.结论 成功构建了TMEV UTR 片段实时荧光定量PCR标准品,为今后TMEV实时荧光定量PCR检测打下了基础.     

2型糖尿病患者与健康个体间肠道双歧杆菌的差异

目的研究2型糖尿病患者与健康个体之间肠道双歧杆菌是否存在差异。方法收集50例2型糖尿病患者和30例健康志愿者的粪便样品,提取样品中细菌总DNA,根据细菌的16SrRNA序列设计双歧杆菌总菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌的属种特异性引物,并应用实时荧光定量PCR技术对两组人群粪便样品中的以上细菌进行定量检测和分析。结果 2型糖尿病患者组肠道双歧杆菌总菌和青春双歧杆菌的数量较健康对照组均显著减少(P<0.05)。结论 2型糖尿病患者肠道双歧杆菌数量减少。     

用于CMV启动子序列检测的绝对定量PCR方法的建立及验证

目的建立和验证用于CMV启动子序列检测的绝对定量PCR方法。方法针对CMV启动子序列设计探针和引物,用SYBR Green I熔解曲线分析引物扩增的特异性。对反应体系进行系统优化。用含CMV启动子的基因治疗产品和质粒标准品验证建立的PCR方法。结果上游引物为5’-AGACTTGGAAATCCCCGTGAGT-3’,下游引物为5’-CGTATTAGTCATCGC-TATTACCATGGT-3’,探针为5’-AACCGCTATCCACGCCCATTGATG-3’。扩增的特异性较强,反应体系优化后能达到较高的灵敏度。Ct值的变异系数都小于2%。标准曲线的定量范围为1.5×102～1.5×107拷贝,灵敏度为30拷贝。质粒标准品和基因治疗产品的扩增效率相近。结论建立了检测CMV启动子序列的绝对定量PCR方法。     

SYBR荧光实时定量PCR检测非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平

目的:建立荧光实时定量PCR技术,检测非小细胞肺癌组织与外周血RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平.方法:分别构建RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin质粒标准品,以SYBR荧光实时定量PCR分析,制备标准曲线,对非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin的mRNA进行检测.结果:标准曲线呈良好的线性关系.标准品的熔解曲线均呈单峰,特异性良好,说明基本无非特异性扩增.结论:所建SYBR荧光实时定量PCR方法操作简便,费用低,特异性好,准确度、灵敏度高,为后续研究构建了理想的平台.     

实时荧光定量RT-PCR方法在登革热小鼠模型中的评估及应用

目的评估登革病毒实时荧光定量RT-PCR方法,应用于登革热小鼠模型关键指标的检测。方法首先,选择合适的特异引物和探针,分子生物方法制备质粒标准品,优化PCR体系和反应条件;其次,评估该实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏性、特异性及稳定性;最后,验证该方法对登革病毒感染小鼠血清和组织样本的适用性。结果成功确定一步法实时荧光定量RT-PCR方法;该方法较为灵敏,最低检测线为49. 6 Copies/μL;方法特异性好,未见非特异性扩增;方法稳定性好,样本Ct值标准差均小于0. 5,且CV﹤5%;登革病毒感染小鼠模型样品的检测结果符合实验预期。结论该qRT-PCR方法可作为关键指标检测方法,用于登革热小鼠模型病毒的定量检测及评估。     

实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌的方法与应用

目的：建立检测阴道加德纳菌的实时荧光定量PCR方法,用于细菌性阴道病的诊断。方法：按照Amsel诊断标准诊断细菌性阴道病;定性PCR检测患者阴道分泌物中的阴道加德纳菌;实时荧光定量PCR测定患者阴道分泌物中的阴道加德纳菌的DNA含量,同时测定标本中总的细菌16SrRNA的DNA含量进行校正,即用阴道加德纳菌的DNA含量／16Sr RNA的DNA含量比值来表示阴道加德纳菌的相对含量。用受试者工作曲线（ROC）评价对细菌性阴道病的诊断价值。结果：定性PCR的特异度为31．9％,敏感度为93．2％。实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌含量的线性范围1×10～1×10^5拷贝数／ml。阴道加德纳菌在细菌性阴道病中的相对含量为0．5613400,明显高于霉菌性阴道炎（P〈0．01）、其他阴道炎（P〈0．01）及健康体检者（P〈0．01）。但与滴虫性阴道炎无明显差异（P〉0．05）。ROC曲线分析结果显示,曲线下面积（AUC．ROC）为0．909,当阴道加德纳菌的DNA含量／16Sr RNA的DNA含量的截断值为0．1026035时,其诊断细菌性阴道病的总体敏感度和特异度分别为92．9％和80．3％。结论：实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌的方法敏感度和特异度较高,准确性和重复性良好。对细菌性阴道病的诊断有一定的临床应用价值。     

实时荧光定量TaqMan-PCR检测小鼠多瘤病毒方法的建立

目的 建立一种快速、特异、敏感的小鼠多瘤病毒 (murine polyomavirus, MPyV)荧光定量 TaqMan PCR检测方法, 用于MPyV核酸的检测。 方法 根据GenBank中小鼠多瘤病毒基因组序列设计了一对特异性引物及TaqMan探针, 扩增长度为69 bp的片段, 通过优化反应体系和反应条件, 对构建的重组质粒标准品进行检测, 并绘制标准曲线, 进行特异性、敏感性和重复性试验。最后用建立的方法对人工感染MPyV的肺脏、脾脏和粪便, 及86 份小鼠临床样本进行检测, 验证在临床应用中的效果。 结果 所建立的检测方法特异性强, 只能在小鼠多瘤病毒DNA中检出荧光信号, 检测灵敏度达到100拷贝, 批内和批间重复性好, 检测结果变异系数(CV)均小于1.13%, 人工感染MPyV小鼠的肺脏、脾脏和粪便均为阳性, 对86份临床样本进行检测, 有3份样本呈阳性(阳性率为3.5%)。 结论 建立的MPyV荧光定量TaqMan-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好, 适合用于MPyV临床诊断、日常监测和流行病学调查。     

荧光定量聚合酶链反应检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染120例

目的　评价泌尿生殖道沙眼衣原体 (CT)感染治疗前后拷贝数变化的意义。方法　应用荧光定量聚合酶链反应 (FQ -PCR)检测尿中CT及CT -DNA拷贝计数 (拷贝数·ml-1)。结果　 12 6例CT阳性患者CT -DNA拷贝计数 4.5× 10 5～ 6 .7× 10 9,平均 5 .2× 10 7。治疗后 86例CT检测转阴 ,临床症状消失 ;40例CT -DNA拷贝数 1.5× 10 5～ 3.5× 10 7,平均1.8× 10 5,症状明显减轻 (P <0 .0 1)。结论　FQ -PCR是检测CT感染的可行方法 ,对临床用药、疗效判断有一定临床意义。     

检测痕量单纯疱疹病毒Ⅱ型荧光定量PCR方法的建立

目的 建立一种高敏感度的检测痕量单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)DNA的实时荧光定量PCR方法,为针对HSV-2潜伏感染的治疗性疫苗和抗病毒药物疗效提供一个评价方法。方法 依据HSV-2糖蛋白D(gD)基因序列,使用序列比对软件,选取其保守区序列设计引物及TaqMan探针并进行筛选;以gD基因重组质粒pcDNA3-HSV-2 gD作为标准模板,对该检测方法的反应条件进行优化,提高其检测特异性、敏感度和重现性。结果 该检测方法特异性好,检测的最低拷贝数可达到2个拷贝,线性范围为2×10⁰~2×10⁸拷贝/反应,是普通PCR敏感度的10³倍。该检测方法组间和组内变异系数均低于5%,说明该检测方法具有良好稳定性。结论 本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法用于检测痕量HSV-2 DNA具有特异、敏感、定量和重现性好的优点。     

鹅源星状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立一种可快速诊断鹅源星状病毒的荧光定量PCR方法。方法分析比对NCBI下载的鹅源星状病毒全基因组序列,在其ORF1a保守区设计一对特异性引物及Taq Man探针,优化反应条件,建立标准曲线,并验证其特异性,敏感性和稳定性。结果该方法最低检测线限为1.50×10²copies/μL,批内和批间检测变异系数分别小于0.5%和4%,且对其他常见水禽病毒无特异性扩增。临床应用结果显示检出率明显高于常规RT-PCR方法。结论建立了一种鹅源星状病毒的Taq Man荧光定量PCR方法,该方法特异性强,灵敏度高且重复性良好,适用于鹅源星状病毒的早期检测和定量分析。     

淋巴瘤Bcl-2/IgH融合基因实时定量PCR检测方法的研究

目的建立Bcl-2/IgH融合基因实时定量PCR检测方法。方法以淋巴瘤患者Bcl-2/IgH融合基因的纯化DNA作为标准品,淋巴瘤患者骨髓和外周血为样本,建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR,RQ-PCR）,并对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行测定。结果构建的RQ-PCR方法检测Bcl-2/IgH融合基因的敏感性达10^-7水平;标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.13,0.99;管间变异和批间变异分别为6.54%,6.73%,1.90%和3.59%,6.30%,5.49%。结论建立的SYBR GreenⅠ荧光染料RQ-PCR方法灵敏,标准曲线的相关性好,方法的稳定性和重复性较好。     

实时荧光定量PCR技术在食源性细菌检测中的应用效果评价

【目的】探讨应用实时荧光定量PCR技术在食源性细菌检测中应用效果。【方法】分别应用细菌培养法,PCR检测法,实时荧光定量PCR方法对987例群体食源性食物中毒腹泻患者和疑似患者的粪便或呕吐物2084份样品进行食源性病原体检测。【结果】检测2084个感染性腹泻标本,细菌培养法阳性检出率45.2%,普通PCR检测法阳性检出率63.4%;采用实时荧光PCR技术阳性检出率90.1%。实时荧光定量PCR检测法阳性检出率显著高于细菌培养检测法和普通PCR检测法,相比较均有显著性差异（P〈0.05）。【结论】实时定量荧光定量PCR技术准确、快速、简便、特异性强,在食源性细菌检测中,能为突发食源性食物中毒事件提供更早的控制措施并争取时间。     

不同检测方法在骨结核诊断中的应用效果比较

目的:比较利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF,简称"Xpert")、荧光PCR熔解曲线法及液体培养方法在骨结核诊断中的应用效果。方法:收集2017年1月至2018年12月期间166例疑似骨结核患者的脓液标本,分别进行分枝杆菌液体培养(MGIT960培养)、Xpert与荧光PCR熔解曲线法检测。以临床综合诊断为标准,对3种检测方法的敏感度和特异度进行比较分析;以液体药敏为金标准,评价Xpert和荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平耐药的敏感度和特异度。结果:Xpert检测的敏感度分别高于荧光PCR熔解曲线法和MGIT960培养法,荧光PCR熔解曲线法的敏感度高于MGIT960培养法,差异有统计学意义(P<0.05);以MGIT960培养为标准,Xpert的敏感度高于荧光PCR熔解曲线法,差异有统计学意义(P<0.05);Xpert与荧光PCR熔解曲线法的特异度比较,差异无统计学意义(P>0.05);以液体药敏为金标准,Xpert和荧光PCR熔解曲线法检测利福平的敏感度和特异度均为80.0%和100%,两种方法与金标准进行一致性检验Kappa值均为0.872。结论:Xpert和荧光PCR熔解曲线法在骨结核诊断中的敏感性和特异度均优于液体培养方法,两种方法各有千秋,可根据实际情况选择。