贵州彝族 瑶族及汉族人群乙型肝炎病毒感染与趋化因子受体5基因多态性的相关性研究

目的研究CCR5 59029等位基因在贵州世居少数民族(彝、瑶族)以及汉族人群的分布,并分析CCR5位点突变与乙型肝炎病毒(HBV)的关系。方法 2009年2月至5月,采用PCR-RFLP技术分析贵州92份黔西彝族、101份威宁彝族、138份荔波瑶族以及165份毕节汉族CCR5启动子区59029位点多态性,抽取样本进行DNA测序验证。结果贵州省黔西彝族、威宁彝族、荔波瑶族及毕节汉族的CCR559029位点基因型频率分别为:纯合突变型(AA)为20.65%、17.82%、8.7%、22.42%;杂合子(AG)为43.48%、44.55%、34.78%、44.85%;野生型(GG)为35.87%、37.62%、56.52%、32.37%。等位基因频率:A为26.09%～44.85%,G为55.15%～73.91%。基因型频率在荔波瑶族和民族总体人群感染组与非感染组之间分布有统计学意义(P0.05),等位基因频率在威宁彝族、荔波瑶族人群感染组与非感染组之间分布差异有统计学意义(P0.05)。结论 CCR5 59029位点可能对贵州省汉、瑶、彝族人群HBV感染具有保护性,CCR5基因可能是HBV感染的拮抗基因之一。     

CCR5基因编码区894C缺失突变在中国人群中的发现

目的 调查中国汉族人HIV协同受体CCR5编码区基因突变和SNP特点。方法PCR扩增CCR5编码区,PCR产物直接进行基因测定。结果 在50例标本中,发现一例CCR5X编码区894ΔC杂合子;采用反向经物进行验证,确定测序结果准确无误。该人缺失引起移码突变,使CCR5C端减少了44个氨基酸。结论 中国汉族人群中存在CCR5 894ΔC,该突变能导致CCR5受体结构和功能改变。     

中国艾滋病人群中HIV—1抗性基因多态性及其与病程发展关系分析

目的：分析了解中国艾滋病病人中CCR－5,CCR－2b和SDF－1基因型组成和等位基因突变频率及其与病程发展的关系。方法：应用聚合酶链反应（PCR）方法对68份艾滋病病人外周血单核细胞样本进行扩增,获得人基因组中CCR－5,CCR－2b和SDF－1基因片段,通过限制性片段长度多态性和／或DNA测序分析CCR5－Δ32,CCR4－m303,CCR2b-64I和SDF1－3’A的等位基因突变频率。结果：68例艾滋病病人中未发现有CCR5－Δ32和CCE5m303基因突变,CCR2b-64I和SDF1－3’A等位基因突变频率分别为21．32％和27．94％,95％CI 11．6％－31．0％和17．2％－38．6％CCR2b-64I和SDF1－3’A等位突变的群体分布符合Hardy-Weinberg规律。SDF1－3’A／CCR2b-64I,SDF1-3’A,CCR2b-64I等位基因突变型和野生型个体发展为AIDS的潜伏期分别为7年,5．8年,5．2年和4．6年。结论：目前发现的HIV感染者均为无CCR5－Δ32和CCR5－m303的易感人群,本研究首次阐明了中国HIV感染者人群中CCR5－Δ32,CCR5－m303,CCR2b-64I和SDF1－3’A等位基因突变频率和多态性特点,发现CCR2b-64I和SDF1－3’A等位基因突变可延缓艾滋病病程的发展,为深入研究HIV－1抗性基因对中国人群HIV－1感染的遗传易感性及其在艾滋病病程发展中的作用具有指导性意义。     

新疆哈萨克族人群CCR5基因多态性的调查及分析

目的研究新疆哈萨克族人群中,艾滋病病毒(HIV)辅助趋化因子受体CCR5△32、CCR5-894C等位基因突变的频率和多态性的特点。方法以143例哈萨克族健康人群为研究对象,应用聚合酶链反应(Polymerasechain reaction,PCR)及脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)直接测序等方法,检测CCR5和CCR5△32、CCR5-894C突变体。结果 143例个体中,CCR5△32扩增分析和CCR5-894C缺失扩增分析结果,均未发现有等位基因突变,均为野生型CCR5。结论由于例数过少,有必要进一步增加样本量,以确定哈萨克族人群是否对HIV有较高的遗传易感性,为有关部门制定相关政策提供准确的依据。     

中国汉族乳腺癌人群趋化因子受体5基因m303位点突变观察

目的观察乳腺癌患者趋化因子受体5（CCR5）基因m303位点突变情况。方法利用PCR法扩增100例中国汉族乳腺癌患者（观察组）、100例正常人（对照组）的CCR5基因片段,利用PCR-RFLP法检测两组CCR5基因m303位点的突变情况。结果均未发现CCR5基因m303位点突变。结论中国汉族乳腺癌人群中未检测出CCR5基因m303位点突变。     

用pfcrt点突变基因检测技术检测恶性疟原虫氯喹抗药性的初步研究

目的　建立一种恶性疟原虫氯喹抗药性基因pfcrt点突变的检测方法,以判断是否存在氯喹抗药性。方法　根据恶性疟原虫pfcrt基因序列设计巢式PCR引物,以恶性疟原虫DNA为模板扩增出一条包含第76位密码子的DNA片段;扩增产物经限制性内切酶Apo I消化,用琼脂糖凝胶电泳观察恶性疟原虫pfcrt等位基因是否为突变型。结果　31份样本经巢式PCR扩增均出现14 0 bp左右的特异性片段。酶切消化后,9份滤纸血样本中有4例出现1条14 0 bp左右的片段,为突变型pfcrt等位基因,其余5份出现97bp与4 8bp两种酶切片段,为野生型pfcrt等位基因;2 2份血涂片样本中有10份突变型,突变率为4 5 .16 %。14例突变样本中,有1例体内实验氯喹治疗有效。结论　巢式PCR- RFL P法可以快速、高效的检测恶性疟原虫pfcrt基因76位密码子的点突变,并且能够初步应用于恶性疟原虫氯喹抗药性的鉴别。     

广西艾滋病疫情严重地区壮族和汉族普通人群CCR5 CCR2 SDF1等位基因检测及其意义

目的调查艾滋病病毒Ⅰ型（HIV—1）感染相关的CCR5、CCR2及SDF1等位基因,在广西壮族和汉族普通人群中的多态性及其流行病学意义。方法在广西天等县和南宁市,选取150名壮族和90名汉族健康人作为研究对象,采集外周血,提取基因组DNA,用聚合酶链反应（PCR）扩增CCR5、CCR2及SDF1基因的特定片段。直接根据PCR扩增结果分析CCR5基因多态性,运用限制性片段长度多态性（RFLP）技术分析CCR2及SDF1的多态性。结果全部研究对象的CCR5基因均为野生型,未发现CCR5△32突变;CCR2—64Ⅰ等位基因频率在壮、汉族普通人群中分别为25．7％、26．1％;SDF1—3’A等位基因频率分别为27．7％和27．2％。结论广西壮、汉族普通人群缺乏艾滋病抗性的CCR5△32等位基因,而CCR2-641和SDF1—3’A等位基因频率较高。该研究为深入研究广西壮、汉族普通人群对于HIV—1感染的遗传易感性,以及对艾滋病疫情和病程的影响提供了比较全面、可靠的数据。     

PCR杂交梳技术在乙型肝炎诊断中的应用

目的:为临床诊断乙型肝炎提供灵敏、准确、可靠的实验依据。方法:采用PCR杂交梳(反相膜杂交法),对71例乙型肝炎患者血清进行DNA验证性检测,并与一般聚合酶链反应(PCR琼脂糖凝胶电泳法)同步对比分析。结果:71例乙型肝炎患者血清中杂交梳方法检出HBV DNA阳性58例,阳性率81.7％;琼脂糖凝胶电泳质检出HBV DNA阳性50例,阳性率70％。结论:PCR杂交梳法较PCR法具有更高特异性和敏感性。     

肝癌及肝硬化患者血清HBV X基因检测及序列分析

目的:了解肝癌及肝硬化患者血清HBV X基因的表达及其核苷酸序列的变异情况。方法:采用酚-氯仿抽提法抽提患者血清DNA,聚合酶链反应扩增血清HBV X基因,琼脂糖电泳观察结果,并对PCR产物行序列分析。结果:HBV X基因在肝癌患者血清的检出率为32％(16/50),在肝硬化患者血清的检出率为46％(23/50)。经琼脂糖电泳及序列分析证实为HBV X基因。16例肝癌及15例肝硬化患者X基因序列分析显示患者的X基因均存在不同程度的点突变(1～13bp),未发现固定的突变部位与序列。结论:肝癌及肝硬化患者血清HBV X基因存在不同程度点突变,但无特异性突变序列。     

慢性乙型肝炎患者血清HBV增强子I区分子特征分析

目的分析乙型肝炎病毒基因组中增强子I区的特征,进一步探讨乙肝慢性化的机制。方法收集16份慢性乙型肝炎患者的血清标本HBV—DNA,扩增HBVEnhI基因,PCR产物测序后对HBV进行分型,并分析HBVEnhI突变情况。结果10例（62．5％）标本HBVEnhI基因PCR扩增阳性,测序标本经在线Genotyping比对后,均属于B型,与参考序列AFl00309同源性最高,10份标本的HBVEnhI区共发现12个突变位点。结论HBVEnhI基因存在多位点突变,此可能为促进病毒复制导致乙肝慢性化的机制。     

中国艾滋病人群中HIV-1抗性基因多态性及其与病程发展关系分析

目的分析了解中国艾滋病病人中CCR-5、CCR-2b和SDF-1基因型组成和等位基因突变频率及其与病程发展的关系.方法应用聚合酶链反应(PCR)方法对68份艾滋病病人外周血单核细胞样本进行扩增,获得人基因组中CCR-5、CCR-2b和SDF-1基因片段,通过限制性片段长度多态性和/或DNA测序分析CCR5-△32、CCR5-m303、CCR2b-64I和SDF1-3'A的等位基因突变频率.结果68例艾滋病病人中未发现有CCR5-△32和CCR5m303基因突变,CCR2b-64I和SDF1-3'A等位基因突变频率分别为21.32%和27.94 %,95%CI分别为11.6%～31.0%和17.2%～38.6%.CCR2b-64I和SDF1-3'A等位基因突变频率的群体分布符合Hardy-Weinberg规律.SDF1-3'A/CCR2b-64I、SDF1-3'A、CCR2b-64I等位基因突变型和野生型个体发展为AIDS的潜伏期分别为7年、5.8年、5.2年和4.6年.结论目前发现的HIV感染者均为无CCR5-△32和CCR5-m303的易感人群.本研究首次阐明了中国HIV感染者人群中CCR5-△32、CCR5-m303、CCR2b-64I和SDF1-3'A等位基因突变频率和多态性特点发现CCR2b-64I和SDF1-3'A等位基因突变可延缓艾滋病病程的发展,为深入研究HIV-1抗性基因对中国人群HIV-1感染的遗传易感性及其在艾滋病病程发展中的作用具有指导性意义.     

免疫接种后HBV感染者PreS2基因变异的情况

目的:本课题应用PCR和基因测序等技术,观察免疫接种后慢性乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,H B V)感染者的PreS2基因变异情况,进而初步探讨乙型肝炎疫苗免疫失败与P r e S2基因变异之间的相互关系;为进一步探索新的HBV抗病毒基因治疗靶点提供理论基础.方法:收集昆明市延安医院和昆明市第三人民医院免疫接种后慢性HBV感染者的血液标本共47例,从血清标本中提取HBV DNA;用PCR法扩增Pre S2基因片段;扩增后的基因片段进行DNA序列分析.扩增出PCR产物的有35例,上海生工测序最终完成测序的有32例,其中男18例,女14例,年龄19-56岁,平均年龄32.75岁±10.22岁.32份样本的HBV Pre S2基因片段测序后,以Gen Bank数据库中登录号为NC_003977.1的HBV DNA全基因序列为参照,用Chromas软件分析测序图及BLASTN对测序结果进行比对分析后,采用SPSS11.5统计软件进行统计分析.结果:32例标本中Pre S2基因全部出现点突变(100%),其中2例出现缺失突变(6.3%),提示可能存在Ile、Tyr、Phe、Gly、Arg等氨基酸的缺失,32例标本均未发现Pre S2起始密码子ATG的变异,点突变共发生517次,Pre S2基因碱基突变有11种类型:G-A、A-G、T-C、A-T、G-T、C-T、G-C、A-C、C-G、C-A、T-A.11种不同类型的点突变在突变例数率及突变次数率方面均不全相同,其中A-T的突变例数较多,G-A的突变次数较多,差异有统计学意义(P0.05).Pre S2基因不同部位点突变比较结果显示Pre S2基因前端、中段、末端点突变率不全相同,其中中段(nt45-99),即Pre S2基因的56-110位点突变率较高,前端突变率较低,差异有统计学意义(P0.05).结论:Pre S2基因变异与免疫失败可能存在相关关系,这将为今后深入研究乙型肝炎疫苗免疫失败的发生机制并用于指导临床实践提供理论基础.同时,进一步确定Pre S2基因变异位点,并针对这些靶点设计相应的基因治疗方法,也可能成为今后乙型肝炎疫苗免疫研究的新方向.     

CCR5基因Δ32、59029 A/G位点多态性与膝关节骨关节炎易感性的关系

目的 探讨CC趋化因子受体5(CCR5)基因Δ32、59029 A/G位点多态性与膝关节骨关节炎(OA)易感性的关系.方法 选择膝关节OA患者380例(观察组)、体检健康的志愿者380例(对照组),采集外周静脉血,提取基因组DNA,采用高保真PCR扩增Δ32、59029 A/G位点基因序列,通过Sanger法对扩增序列...     

单项抗-HBe阳性患者中的隐匿性乙型肝炎病毒感染

目的 研究抗-HBe单项阳性患者中隐匿性HBV的感染情况及发生的可能原因.方法 收集HBV血清学标志物检测结果中抗HBe单项强阳性[吸光度(A)值≤0.1]的新鲜血清标本61份,采用实时定量PCR进行HBV DNA含量检测.对于HBV DNA定量阳性的标本,采用雅培试剂复测HBV血清学标志物,采用PCR扩增,并进行克隆测序.结果 61份标本中,2份HBVDNA定量阳性,HBsAg血清学漏检率为3.3％.其中l份标本经雅培试剂复测为抗-HBc单项阳性,其前S区缺失突变和前S2区起始密码子突变,并存在不同突变株混合感染;另1份标本经雅培试剂复测发现,除抗HBe强阳性外,HBsAg和抗- HBc为极弱阳性,未发现前S/S区突变.结论 抗HBe单项阳性患者中存在隐匿性HBV感染和HBsAg血清学漏检情况,后者不仅与前S/S区突变有关,而且与外周血中HBsAg低水平也有一定关系.     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA套式-实时荧光定量聚合酶链反应的建立

目的 建立检测HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的套式一实时荧光定量PCR法.方法 根据HBV cccDNA与松环DNA(rcDNA)结构上的差异,设计2对跨缺口的特异引物及1条位于负链缺口下游的特异TaqMan荧光探针.根据Plasmid-SafeTM ATP-Dependent Dnasc(PSAD)对rcDNA与cccDNA作用的不同,对模板DNA进行酶切纯化,降解reDNA,再进行套式PCR扩增,先用外引物和模板进行第一轮常规PCR,再用内引物、荧光探针和第一轮PCR产物进行实时荧光定量PCR,根据阳性参照标准品,得出待检标本定量值.结果 检测阳性参照标准品.得出该方法灵敏度可达2 lg拷贝/mL.用上述方法检测34份乙型肝炎患者血清HBV DNA阳性标本,25份血清HBVcccDNA阳性,28份外周血单个核细胞HBV cccDNA阳性.27份健康对照者血清HBV DNA阴性标本,6份HBV cccDNA阳性.对5份HBV cccDNA阳性标本扩增产物进行克隆测序,无碱基缺失、突变.与HBV不同基因型序列(A～G)比较,同源性为90.6%～99.1%,其中,与B、C基因型同源性为95.3%～99.1%,验证了方法的特异度.结论 套式-实时定量PCR法可检测乙型肝炎患者血清、PBMC中的HBV CCCDNA,且具有敏感、特异性.     

四川凉山静脉吸毒人群HIV感染者中HLA-B*5701阳性率的研究

目的了解四川凉山彝族自治州静脉吸毒人群(IDUs)艾滋病病毒(HIV)感染者中,人白细胞抗原I类基因B座位5701等位基因(HLA-B*5701)的阳性率,并与国内外其他民族的研究数据进行比较。方法采用序列特异性引物(SSP)对基因组DNA进行聚合酶链式(PCR)扩增,通过琼脂糖凝胶电泳读取结果,电泳条带呈HLA-B*5701阳性的再通过测序进行HLA-B分型验证。结果 1 043名HIV阳性感染者中,5人携带HLA-B*5701等位基因,阳性率为0.479%。其中汉族人口230人,3例携带HLA-B*5701等位基因(阳性率1.30%);彝族人口813人,2例携带HLA-B*5701等位基因(阳性率0.246%)。结论凉山IDUs人群HIV感染者中HLA-B*5701的阳性率较低,低于国外对黑种人及白种人的研究数据,汉族人群与彝族人群相比较差异无统计学意义。     

乙肝病毒核苷类似物耐药位点分析

目的:建立巢式PCR结合测序检测乙型肝炎病毒(HBV)耐药位点的方法,确定患者的HBV基因型和耐药突变情况。方法:采用特异性引物进行巢式PCR扩增HBV DNA,产物测序后,利用MEGA 3.1对测序结果进行分析判断有无耐药突变的产生。结果:100例乙肝病毒载量阳性患者共检出48例有耐药突变,其中概率最高的是rt204位点的YVDD 15例、YIDD 13例;拉米夫定组的耐药概率明显高于对照组;耐药组的ALT和HBV DNA水平明显高于非耐药组。结论:传统的核苷类似物如拉米夫定会产生耐药,耐药一旦发生肝功能和HBV DNA会明显升高,巢式PCR结合测序法可对患者体内的HBV耐药突变位点进行有效检测,有利于指导临床用药。     

蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因Pro387Leu突变与中国上海地区汉族肥胖人群的相关性

随机选取上海地区汉族人305例,用PCR/Bsl I酶切法检测蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因P387L突变,对琼脂糖电泳提示突变的样本全部进行DNA测序。单纯肥胖组中有5例发生该突变,正常对照组中未发现该突变。提示该基因P387L变异可能与中国人肥胖发生相关。     

A～D基因型乙型肝炎病毒全长逆转录酶区PCR方法的建立及应用

目的 建立适用于扩增我国常见的乙型肝炎病毒(HBV)A～D基因型全长逆转录酶(RT)区(包含全长HBsAg编码区)的聚合酶链反应(PCR)法,并确定其在分析临床标本中的应用价值.方法 建立我国HBV基因序列库,设计适用于扩增A～D基因型HBV全长RT区引物,以A～D基因型HBV重组质粒为模板建立半巢式PCR(snPCR)法,并确定该法灵敏度.用所建立的snPCR对44份HBV DNA定量阳性(>5.0×102 拷贝/ml)慢性乙型肝炎患者血清标本进行扩增及PCR产物直接测序.结果 琼脂糖凝胶电泳及测序证实,snPCR可扩增A～D基因型HBV全长RT区,对A、B、C和D基因型HBV质粒扩增的灵敏度分别为1.2×103、7.0×102、6.0×102和6.0×102 拷贝/ml.snPCR检测HBV DNA >5×102 拷贝/ml血清标本的阳性率为88.64% (39/44),扩增阴性血清标本HBV DNA滴度均处于103 拷贝/ml水平.扩增目的 产物经直接测序确证无误.生物信息学分析显示,样品中B和C基因型分别占35.90%(14/39)和64.10%(25/39);其中15.38%(6/39)发生RT区变异,包括4例为已知耐药变异;7例(17.95%)存在HBsAg编码区变异,其中2例为已知免疫逃逸变异;6例(15.38%)发生RT区和HBsAg编码区"镜像改变".结论 建立了一种新的扩增全长RT区(涵盖全长HBsAg编码区)的snPCR.该法结合直接测序法,可同时分析我国HBV A～D基因型已知和潜在的耐药变异位点.     

CCR5Δ32基因多态性在辽宁省老年系统性红斑狼疮诊断中的意义

目的探讨辽宁地区老年系统性红斑狼疮(SLE)患者和正常老年人群CCR5基因多态性差异,探索其基因多态性在SLE诊断中的意义。方法收集500例老年SLE患者及500例老年健康人作对照,对其SLE相关指标及CCR5基因多态性检测。结果500例样本以CCR5/CCR5纯合子基因型为主,无CCR5Δ32/CCR5Δ32基因型,CCR5基因频率显著高于CCR5Δ32(P<0.05);CCR5/CCR5Δ32组发病年龄低于CCR5/CCR5组,但无显著差异(P>0.05)。而抗dsDNA抗体阳性率明显高于CCR5/CCR5组(P<0.05)。结论辽宁老年人群中主要以CCR5野生基因型为主,CCR5Δ32突变频率较低。CCR5Δ32突变可以通过提高抗dsDNA抗体的阳性率来影响SLE。