自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的：探讨自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞株（HK-2）凋亡中的作用。方法：培养HK-2细胞,根据培养环境氧浓度不同分为对照组（21%O2）和低氧组（1%O2）;根据低氧培养时间不同,低氧处理细胞进一步分为：低氧6 h亚组、低氧12 h亚组、低氧18 h亚组和低氧24 h亚组。Western blot检测HK-2细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和凋亡相关蛋白活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cleaved-caspase3）表达水平,流式细胞仪检测HK-2细胞凋亡情况;采用低氧诱导稳定表达GFP-LC3的HK-2细胞18 h,在荧光显微镜下观察GFP-LC3自噬小体的变化;进一步采用低氧联合自噬诱导剂雷帕霉素（ra－pamycin,RP）或自噬抑制剂巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1,BAfA1）处理HK-2细胞,细胞分为常氧对照组、常氧+雷帕霉素/或巴弗洛霉素组、低氧对照组、低氧+雷帕霉素/或巴弗洛霉素组。Western blot检测Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和cleaved-caspase3表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：与对照组（0.161±0.043）相比较,低氧12 h[（0.315±0.060）,P=0.019]、18 h[（0.586±0.063）,P=0.000]、24 h[（0.698±0.085）,P=0.000]亚组HK-2细胞cleaved-caspase3蛋白表达明显增多;低氧12 h、18 h、24 h亚组HK-2细胞凋亡率分别为（23.633±5.346）%、（25.200±4.782）%、（38.567±8.046）%,较对照组（11.800±3.966）%明显增多（P=0.036,P=0.021,P=0.000）。同时,低氧18 h、24 h亚组HK-2细胞表达Beclin1蛋白[（0.557±0.071）,（0.897±0.074）[较对照组（0.249±0.040）明显上调（P=0.001,P=0.000）;低氧6 h、12 h、18 h、24 h亚组细胞表达LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白[（1.795±0.143）,（2.873±0.078）,（3.029±0.089）,（3.735±0.059）]较对照组（1.322±0.191）明显上调（P=0.036,P=0.000,P=0.000,P=0.000）;细胞表达自噬底物P62蛋白[（0.776±0.061）,（0.602±0.119）,（0.419±0.117）,（0.384±0.068）]较对照组（0.957±0.035）明显下调（P=0.028,P=0.001,P=0.000,P=0.000）;低氧组细胞GFP-LC3斑点计数相对值为（40.667±6.028）,较对照组（18.667±5.508）明显增加（P=0.010）。雷帕霉素增加自噬后,低氧诱导的HK-2细胞凋亡（26.433±3.402）及cleaved-caspase3蛋白表达（0.265±0.066）较低氧对照组[（36.133±5.856）,（0.358±0.060）]明显减少（P=0.012,P=0.000）;巴弗洛霉素A1抑制自噬后,低氧诱导的HK-2细胞凋亡增多（49.233±3.412）及cleaved-caspase3蛋白表达（1.242±0.110）较低氧对照组[（25.933±3.650）,（0.659 ± 0.060）]明显增加（P=0.000,P=0.000）。结论：自噬在低氧诱导的HK-2细胞凋亡中起保护作用。     

Beclin-1、P62、LC3B在肺炎链球菌感染小鼠肺部中的表达变化

目的：探讨自噬相关蛋白Beclin-1、P62及微管相关蛋白轻链3B（microtubule-associated protein light chain 3B,LC3B）在肺炎链球菌感染小鼠肺部中的表达及意义。方法：生长至对数生长期的肺炎链球菌标准株D39用无菌PBS调节浓度为1.5×109 CFU/mL,采用鼻滴的方法对50只SPF级雌性Balb/c鼠（6~8 周,16~20 g）进行处理,分别在感染后0、6、12、24、48 h收集Balb/c小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）及肺组织,瑞氏-吉姆萨染色进行BALF细胞计数,HE染色观察肺组织病理学改变,Western blot 检测自噬相关蛋白Beclin-1、P62、LC3B在肺组织中的表达水平,免疫荧光观察LC3B在肺组织中的表达情况。结果：HE染色显示,小鼠鼻饲肺炎链球菌后12 h及24 h后肺组织内出现大量炎症细胞浸润。BALF中总细胞数量及中性粒细胞数量于感染后6 h开始增高[（1.280±0.506） vs. （6.272±1.312）,P=0.000;（0.000±0.000） vs. （3.456±1.308）,P=0.000],在12 h时达到高峰[（1.280±0.506） vs. （19.456±0.997）,P=0.000;（0.000±0.000） vs. （15.040±1.012）,P=0.000],48 h后基本恢复正常水平[（1.280±0.506） vs. （3.520±0.933）,P=0.005;（0.000±0.000） vs. （0.128±0.175）,P=0.835]。Western blot结果显示：自噬相关蛋白Beclin-1于感染后6 h开始增加[（0.626±0.078） vs. （0.921±0.093）,P=0.002],48 h时达到最高水平[（0.626±0.078） vs. （1.884±0.158）,P=0.000];自噬相关蛋白P62于感染后6 h开始减少[（2.915±0.094） vs. （2.275±0.269）,P=0.000],48 h时降低至最低水平[（2.915±0.094） vs. （1.178±0.142）,P=0.000];自噬相关蛋白LC3B于感染后12 h开始升高[（0.747±0.197） vs. （1.429±0.318）,P=0.006],24 h时达到高峰[（0.747±0.197） vs. （2.002±0.451）,P=0.000],48 h后降低[（0.747±0.197） vs. （1.563±0.501）,P=0.002]。免疫荧光显示：小鼠感染后12 h与24 h,肺组织中LC3B蛋白表达水平增加。结论：肺炎链球菌感染小鼠肺部后激活自噬的发生,且自噬在免疫调节过程中发挥着重要作用。     

黄芪多糖对CLP诱导的脓毒症小鼠急性肝损伤MDA、caspase-3和ICAM-1的影响研究

目的：探讨黄芪多糖（astragalus polysaccharide,ＡＰＳ）对脓毒症诱导的小鼠急性肝损伤丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde,MDA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）和细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）的影响。方法：将小鼠随机分为假手术组（SHAM组,n=25）、脓毒症组（SEP组,n=25）、APS处理组（APS组,n=25）、生理盐水处理组（NS组,n=25）,采用盲肠结扎穿刺术（cecal ligation puncture,CLP）造模,APS组经腹腔注射APS 50 mg/（kg?d）,NS组经腹腔注射等量生理盐水,SHAM组和SEP组不做特殊处理。染色观察肝脏组织病理变化;检测①血浆中MDA、caspase-3和ICAM-1变化;②肝组织匀浆MDA和caspase-3变化;③肝脏组织中caspase-3蛋白的表达。结果：SEP组12 h开始表现肝细胞水肿进行性加重,48 h达到高峰。APS干预后,肝细胞损害严重程度较SEP组明显改善。通过APS处理后,24、48 h APS组血浆中MDA[（29.69±4.62） mol/ml,P=0.041;（23.95±4.10） mol/ml,P=0.003]、caspase-3[（33.12±9.01） ?滋mol/L,P=0.000;（31.25±8.68） ?滋mol/L,P=0.000]和ICAM-1[（439.49±71.66） ?滋g/L,P=0.009;（321.87±68.64） ?滋g/L,P=0.000]浓度降低,肝组织匀浆MDA与caspase-3浓度亦在相应时相点开始降低。24、48 h APS组caspase-3蛋白[（19.93±4.53） ?滋mol/L,P=0.005;（16.91±4.76） ?滋mol/L,P=0.000]表达较SEP组明显降低。结论：APS可有效减轻急性肝损伤,其作用可能与降低MDA、ICAM-1以及抑制caspase-3表达有关。     

Rho激酶抑制剂对先天性膈疝大鼠模型胎仔肺血管重构的作用

目的：探讨先天性膈疝（congenital diaphragmatic hernia,CDH）大鼠模型胎仔肺Rho激酶的表达及其抑制剂法舒地尔对肺血管重构的影响。方法：将定时配种成功的SD雌鼠随机分为对照组（5只）、膈疝组（6只）和法舒地尔干预组（6只）。分别给予膈疝组和干预组除草醚（100 mg/只）一次性灌胃建立CDH动物模型,对照组灌等量橄榄油。孕16.5 d给予干预组腹腔注射法舒地尔（15 mg/kg,1次/d,连续３ d）,对照组和膈疝组予等量生理盐水腹腔注射。定时剖宫产取出胎肺,光镜下进行肺血管重构观察,采用RT-PCR法和Western blot法观察肺组织Rho激酶表达变化;Western blot法检测Rho激酶底物肌球蛋白磷酸酶的磷酸化状态。结果：膈疝组肺小动脉管壁厚度占血管外径百分比（WT%）和肺小动脉中膜厚度百分比（MT%）均明显高于对照组[（26.88±2.41） vs. （13.50±1.45）;（25.59±2.57） vs. （16.47±2.07）,P=0.000];管腔面积与血管总面积百分比（LA%）明显低于对照组[（39.22±2.23） vs. （61.20±3.23）,P=0.000]。法舒地尔干预组WT%、MT%显著低于膈疝组[（15.38±2.14） vs. （26.88±2.41）;（17.69±1.79） vs. （25.59±2.57）,P=0.000],LA%明显高于膈疝组[（58.67±3.06） vs. （39.22±2.23）,P=0.000]。与对照组相比,膈疝组Rho激酶mRNA和蛋白质表达明显升高,肌球蛋白磷酸酶磷酸化水平也明显增高（P=0.000）。法舒地尔干预后Rho激酶mRNA和蛋白、肌球蛋白磷酸酶磷酸化水平均较膈疝组明显降低（P<0.01）。结论：先天性膈疝胎仔肺内存在肺血管重构,Rho/Rho激酶信号通路参与此过程,产前给予法舒地尔明显改善CDH胎仔的肺血管重构。     

过表达NICD通过下调基因JunB的表达抑制BMP9

目的：研究Notch信号通路在骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化过程中的作用及其机制。方法：将细胞分为5组：空白组（Blank,n=3）,BMP9处理组（BMP9,n=3）,空白质粒对照组（BMP9+Control,n=3）,过表达Notch1胞内段质粒（Notch1 intracellular domain,NICD）处理组（BMP9+NICD,n=3）,DAPT处理组（BMP+DAPT,n=3）。通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和钙盐染色分别验证过表达NICD对成骨分化早晚期情况的影响。进一步采用定量逆转录PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-RCR）和Western blot检测基因NICD、Hey1及成骨相关基因Smad-1/5/8、p-Smad-1/5/8、OPN、Runx2、OCN、JunB的表达。结果：早期ALP活性及染色结果显示,NICD组较Control组能显著抑制C3H10T1/2细胞成骨分化过程中ALP的形成[5 d：（33 167.66±2 018.45） vs. （146 451.00±14 889.67）,P=0.000;7 d：（58 981.33±4 724.70） vs. （89 588.66±5 928.32）,P=0.000],γ-分泌酶抑制剂（N-[N-（3,5-difluorophen-acetyl）-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT）完全抑制Notch通路时得到相同的结果[5 d：（44 812.66±4 174.94） vs. （146 451.00±14 889.67）,P=0.000;7 d：（64 622.93±4 724.70） vs. （89 588.66±5 928.32）,P=0.000]。茜素红S染色结果显示,NCID抑制钙盐结节的形成,而DAPT阻断Notch通路明显促进钙盐结节形成。qRT-PCR结果表明,NCID组中NICD及靶基因Hey1的表达较Control组明显增加[（3.90±0.02） vs. （0.35±0.01）,P=0.000;（19.79±0.01） vs. （11.80±0.02）,P=0.000],Western blot得到相同结果[（1.32±0.01） vs. （0.19±0.01）,P=0.000],且NICD明显抑制成骨分化相关基因JunB、Runx2、OCN、OPN等的表达[（0.10±0.01） vs. （0.53±0.01）,P=0.000;（0.18±0.01） vs. （0.30±0.02）,P=0.000;（0.36±0.01） vs. （0.62±0.02）,P=0.000;（0.07±0.01） vs. （0.48±0.01）,P=0.000],而转录因子Smad-1/5/8、p-Smad-1/5/8的表达不受影响[（0.74±0.02） vs. （0.73±0.03）,P=0.000;（0.63±0.01） vs. （0.58±0.04）,P=0.000],DAPT阻断Notch通路后上述相关基因的表达明显增加。结论：本实验结果首次证明,NICD激活Notch通路对BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的抑制作用可能是通过抑制JunB基因发挥作用,而非调控BMP9/Smad（bonemorphogenetic protein 9/drosophila mothers against decapentaplegic）信号通路。     

颗粒蛋白前体通过调控调节性T细胞影响急性肺损伤白细胞介素-10表达和肺巨噬细胞极化的实验研究

目的：研究颗粒蛋白前体（progranulin,PGRN）在小鼠急性肺损伤（acute lung injury,ALI）模型中对调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）的调控及其对白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）表达和肺巨噬细胞极化的影响。方法：将 C57BL/6小鼠随机分为 Control 组、脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）组、LPS+PGRN 治疗组。用 LPS 气道滴注诱导小鼠 ALI 模型,LPS+PGRN 治疗组在 LPS 处理半小时后采用 0.1 mg/kg 的 PGRN 气道滴注。给药 24 h 后用水合氯醒麻醉小鼠,取小鼠肺组织及肝素抗凝血。肺组织病理切片HE染色评估肺损伤;流式细胞术检测外周血 Tregs;酶联免疫吸附法检测血浆 IL-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α、IL-10 表达;免疫荧光检测肺巨噬细胞表型。结果：不同处理组间外周血 Tregs,血浆中 IL-6、TNF-α、IL-10,肺组织中 M1、M2 型肺巨噬细胞存在统计学差异（F=69.340,P=0.000;F=73.100,P=0.000;F=17.800,P=0.000;F=11.780,P=0.003;F=67.560,P=0.000;F=197.100,P=0.000）。并且 PGRN 治疗后,ALI 小鼠肺损伤明显减轻,外周血 Tregs 明显增高[LPS：（4.714±0.265）%,LPS+PGRN：（8.930±0.255）%,P=0.000],血浆中促炎因子 IL-6[LPS：（3 021.000±294.900） pg/mL,LPS+PGRN：（276.700±148.000） pg/mL,P=0.000]和TNF-α表达[LPS：（90.980±10.240） pg/mL,LPS+PGRN：（20.410±9.190） pg/mL,P=0.002]明显降低,血浆抑炎因子 IL-10 表达明显上升[LPS：（296.400±44.280） pg/mL,LPS+PGRN：（2 551.000±0 655.100） pg/mL,P=0.014],M1 型肺巨噬细胞减少[LPS：（17.870±1.890）%,LPS+PGRN：（4.436±0.248）%,P=0.000],M2 型肺巨噬细胞增多[LPS:（2.284±0.444）%,LPS+PGRN：（11.920±0.458）%,P=0.000]。结论：在小鼠ALI模型中,PGRN能够通过调控Tregs改变IL-10的表达,影响肺巨噬细胞极化。     

姜黄素调控脂多糖诱导成骨细胞线粒体功能改变及凋亡研究

目的：研究脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和姜黄素（curcumin,Cur）对成骨细胞线粒体功能活性改变及凋亡的影响。方法：体外培养小鼠原代成骨细胞,并将细胞分为4组：无任何处理的对照组（N组）;10 μmol/L姜黄素预处理2 h,使用正常培养基培养24 h组（Cur组）;用1 mg/L LPS处理24 h组（LPS组）;用10 μmol/L姜黄素预处理2 h,然后再用1 mg/L LPS处理成骨细胞24 h组（Cur +LPS组）。利用线粒体荧光探针测量线粒体活性氧的产生,检测线粒体氧化呼吸链酶活性、线粒体膜电位、细胞内ATP的合成及细胞凋亡情况。结果：在经过1 mg/L LPS刺激后,小鼠成骨细胞线粒体内活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成为对照组的2.59倍;与对照组相比,LPS组氧化呼吸链酶Ⅰ活性降低21%,氧化呼吸链酶Ⅲ活性降低26%,氧化呼吸链酶Ⅳ活性降低28%;线粒体细胞膜电位降低32%,ATP合成量为（0.79±0.06） μmol/mg蛋白,细胞凋亡数目增加3.2倍;而Cur+LPS组较LPS组相比,小鼠成骨细胞内ROS水平降低（1.48±0.21 vs. 2.59±0.32,P=0.003）,氧化呼吸链酶Ⅰ活性升高（0.98±0.02 vs. 0.79±0.03,P=0.000）,氧化呼吸链酶Ⅲ活性升高（0.93±0.03 vs. 0.74±0.03,P=0.004）,氧化呼吸链酶Ⅳ活性升高（0.92±0.05 vs. 0.72±0.02,P=0.009）,线粒体膜电位增加（0.91±0.04 vs. 0.68±0.04,P=0.002）,ATP合成量增加（1.53±0.05 vs. 0.79±0.06,P=0.000）,细胞凋亡数目减少（1.67±0.42 vs. 5.33±0.80,P=0.002）。结论：姜黄素预处理组的成骨细胞线粒体功能得以明显改善,并且细胞凋亡数目明显减少,为姜黄素可能被进一步应用于临床治疗慢性牙周炎提供一定的实验依据。     

Vaspin对棕榈酸诱导的INS-1细胞自噬水平的影响

目的：研究脂肪细胞因子Vaspin对棕榈酸诱导的INS-1细胞自噬水平的影响。方法：培养INS-1细胞,分为正常组：用普通培养基培养24h;棕榈酸（palmiticacid,PA）组：以0.5mmol/LPA培养24h;PA+Vaspin组：先加入320ng/mLVaspin预培养2h,再以0.5mmol/LPA+320ng/mLVaspin共培养24h;PA+Vaspin+雷帕霉素（rapamycin）组：先以50nmol/LRapamycin预培养2h,再以0.5mmol/LPA+320ng/mLVaspin共培养24h;PA+Vaspin+3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）组：先以1mmol/L3-MA预培养2h,再以0.5mmol/LPA+320ng/mLVaspin共培养24h。葡萄糖（3.3mmol/L和16.7mmol/L）刺激胰岛素分泌实验检测各组胰岛素分泌水平,Westernblot检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）、p-mTOR、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及P62蛋白水平,mRFP-GFP-LC3检测自噬流水平,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果：与正常组相比,PA组INS-1细胞上清液中胰岛素分泌水平在3.3mmol/L葡萄糖和16.7mmol/L葡萄糖刺激下均降低[（1.02±0.08）ng/mLvs.（0.54±0.06）ng/mL,P=0.000;（1.15±0.13）ng/mLvs.（0.71±0.05）ng/mL,P=0.000）],PA+Vaspin组较PA组升高[（0.76±0.03）ng/mLvs.（0.54±0.06）ng/mL,P=0.001;（0.91±0.04）ng/mLvs.（0.71±0.05）ng/mL,P=0.011）];与正常组相比,PA组INS-1细胞p-mTOR与mTOR蛋白比值低（2.04±0.14vs.1.19±0.09,P=0.000）,PA+Vaspin组p-mTOR与mTOR蛋白比值较PA组高（1.51±0.05vs.1.19±0.09,P=0.005）;同时,PA组自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与正常组相比明显增加（0.81±0.07vs.0.65±0.04,P=0.005;2.35±0.25vs.1.16±0.11,P=0.000）,P62蛋白水平降低（1.04±0.19vs.0.60±0.08,P=0.000）;PA+Vaspin组Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平较PA组低（0.58±0.04vs.0.81±0.07,P=0.001;1.95±0.08vs.2.35±0.25,P=0.007）,P62蛋白增加（0.82±0.03vs.0.60±0.08,P=0.032）;PA组自噬溶酶体数量较正常组多（8.33±1.53vs.0.33±0.58,P=0.000）,Vaspin干预后降低（3.67±1.53vs.8.33±1.53,P=0.001）;同时,PA干预INS-1细胞24h后细胞凋亡明显增加（7.91±0.50vs.22.15±2.05,P=0.000）,PA+Vaspin组较PA组细胞凋亡减少（13.23±1.97vs.22.15±2.05,P=0.000）。结论：Vaspin能够改善棕榈酸诱导的INS-1细胞过度自噬和细胞凋亡,改善胰岛β细胞分泌功能。     

姜黄素改善N2a/APP695swe细胞线粒体功能和抑制细胞凋亡的作用

目的：观察姜黄素（curcumin）对N2a/APP695swe细胞线粒体形态和功能及细胞凋亡的影响;探讨其可能的神经保护机制。方法：实验细胞分为4个组：N2a/APP695组（WT）、N2a/APP695swe组（APP）、溶剂对照组（DMSO,5 μmol/L）、姜黄素组（Curcumin,5 μmol/L）。流式细胞术分别检测细胞凋亡、活性氧水平和膜电位水平、免疫细胞化学检测细胞色素C的表达、电镜观察细胞线粒体形态的改变,Western blot检测Caspase3、Caspase9蛋白表达,分光光度检测Caspase3、Caspase9酶活性。结果：流式细胞术结果显示,Curcumin组细胞的凋亡率、活性氧水平较APP组明显降低[（0.05±0.01） vs. （0.18±0.01）,P=0.000;（49.67±4.16） vs. （197.67±8.08）,P=0.000];而Curcumin组线粒体膜电位较APP组升高[（1.00±0.03） vs. （0.64±0.03）,P=0.000]。电镜结果发现姜黄素可以减轻线粒体的肿胀,改善其形态。同时免疫细胞化学结果显示姜黄素减少了细胞色素C的释放。Western blot检测发现,与APP组相比,Curcumin组Caspase3、Caspase9蛋白的表达均降低[（0.62±0.12） vs. （1.39±0.10）,P=0.000;（0.64±0.20） vs. （1.78±0.03）,P=0.000];并且Curcumin组较APP组的Caspase3与Caspase9的活性明显降低[（0.66±0.04） vs. （2.12±0.06）, P=0.000;（0.58±0.04） vs. （0.93±0.03）, P=0.000]。结论：姜黄素能抑制N2a/APP695swe细胞的凋亡,其机制可能与改善线粒体功能有关。