黄芩苷对转化生长因子β1 诱导的A549 细胞自噬作用的影响

目的探讨黄芩苷对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的A549 细胞自噬作用的影响。方法采用不同浓 度TGF-β1（2.5、5、10 ng·mL-1）诱导A549 细胞48 h后,检测其Collagen I基因与自噬相关基因表达水平,以 确定模型复制的最佳条件。在高、中、低剂量（200、100、50 μg·mL-1）黄芩苷对TGF-β1 诱导的A549 细胞模 型干预后,采用RT-qPCR 法检测细胞的肺纤维化标志基因CollagenⅠ及自噬相关基因（ATG3、ATG5、ATG7、 ATG12）的表达;Western Blot 法检测自噬调节标志蛋白p62、LC3B Ⅱ/Ⅰ的表达;通过转染Ad-mCherry-GFPLC3B 双荧光标记腺病毒检测细胞中自噬流的情况。结果使用10 ng·mL-1 TGF-β1 诱导A549 细胞48 h 后, CollagenⅠ基因表达显著上调,ATG3、ATG5、ATG7、ATG12 基因表达明显下调,差异均有统计学意义（P＜ 0.05,P＜0.01）。经黄芩苷干预后,与模型组相比,黄芩苷高剂量组（200 μg·mL-1）A549 细胞的CollagenⅠ基因 表达显著下调（P＜0.01）,ATG3、ATG5、ATG7、ATG12 基因表达明显上调（P＜0.05）;黄芩苷各给药组A549 细胞的p62 蛋白表达显著下调（P＜0.05,P＜0.01）,LC3B Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著上调（P＜0.05,P＜0.01）;黄芩 苷高剂量组的细胞自噬能力明显激活。结论黄芩苷可能在减少TGF-β1 诱导的A549 细胞外基质沉积的同 时,能够增强细胞的自噬水平,可能是治疗肺纤维化的有效成分。     

金银花石油醚部位抗肺纤维化药效作用及其成分分析

目的对金银花石油醚部位提取物抗肺纤维化药效作用进行探究,并对其药效成分进行分析。方法体 外实验采用5 ng·mL- 1 转化生长因子（TGF）-β1 诱导A549 细胞建立上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）细胞模型,设置空白对照组、模型组、金银花石油醚部位组,RT-PCR 法检测药物干预后 A549 细胞EMT 标志性基因（ColⅠ、Vimentin、E-cadherin、α-SMA）mRNA 表达水平,ELISA 法检测羟脯氨 酸（HYP）含量变化。将36 只雄性C57BL/6 小鼠随机分为假手术组、模型组、吡非尼酮组和金银花石油醚部位 组,暴露式气管内注入博来霉素5 mg·kg-1 进行模型复制,第7 天开始给药,第28 天处死小鼠。HE、Masson 染色观察小鼠肺组织病理形态变化,ELISA 法检测肺组织HYP 含量,RT-PCR 法检测肺组织EMT 标志性基因 表达水平。并对金银花石油醚部位进行UPLC-Q-Extractive/MS 成分定性分析。结果与模型组比较,金银花 石油醚部位可有效抑制TGF-β1 诱导后A549 细胞内ColⅠ、α-SMA、Vimentin（P＜0.05,P＜0.01）mRNA 表 达,促进E-cadherin mRNA（P＜0.01,P＜0.05）表达,降低细胞内羟脯氨酸（P＜0.05,P＜0.01）含量;金银花 石油醚部位可改善小鼠肺组织炎症与纤维化程度,使肺组织ColⅠ、α-SMA、Vimentin mRNA（P＜0.05,P＜ 0.01）的表达量下降,E-cadherin mRNA 表达量上升（P＜0.05,P＜0.01）,羟脯氨酸含量下降（P＜0.05,P＜ 0.01）。LC-MS 共鉴定出金银花石油醚部位中14 种化学成分,以酚类和黄酮类成分为主。结论金银花石油醚 部位通过抑制上皮间质转化过程产生抗肺纤维化作用。酚类和黄酮类成分是其潜在药效物质基础。     

薏苡仁油对人肺泡上皮细胞间质转化的抑制作用研究

目的探讨薏苡仁油对人肺泡上皮细胞间质转化的影响,评估薏苡仁油在肺纤维化治疗方面的应用。方法以A549肺泡上皮细胞为研究对象,用TGF-β1诱导肺泡上皮细胞的间质转化,同时,加入不同浓度的薏苡仁油进行干预。TGF-β1刺激48 h后,应用圆形度定量分析细胞形态的变化;应用免疫细胞化学的方法分析细胞表面上皮特征性蛋白E-cadherin和间质特征性蛋白α-SMA、FN和Collagen I的表达;应用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测细胞分泌MMP-9和TIMP-1水平。结果与正常组比较,TGF-β1组圆形度显著降低(P0.01);E-cadherin表达显著降低(P0.05);FN表达显著升高(P0.01);α-SMA和Collagen I表达升高,MMP-9和TIMP-1的分泌量增加,但均无显著性(P0.05)。与TGF-β1组比较,高剂量组E-cad表达显著增加(P0.05);小剂量组Collagen I的表达显著降低(P0.05);小剂量组TIMP-1分泌量显著增加(P0.05),其它未显示出显著性的影响(P0.05)。结论薏苡仁油能有效抑制体外培养的人肺泡上皮细胞A549的上皮间质转化,抑制MMPs对细胞外基质的破坏。     

莲子心新碱对转化生长因子β1 诱导的H1299 细胞侵袭和迁移的抑制作用及其机制

目的构建转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC） H1299 细胞上皮-间充质转化（EMT）模型,并探讨莲子心新碱（Neoliensine,NeoL）对其侵袭和迁移能力的抑制 作用及潜在机制。方法用5、10、15 ng·mL-1 的TGF-β1 诱导H1299 细胞构建EMT 模型;以15 ng·mL-1 的 TGF-β1 诱导H1299 细胞作为EMT 模型组,以法舒地尔（Fas）为阳性药,设置1、2、3 μmol·L-1 的莲子心新碱 实验组。采用倒置荧光显微镜观察诱导后的细胞形态;用CCK-8 法检测莲子心新碱对H1299 细胞的抑制率; Western Blot 法检测细胞黏附因子E-钙黏蛋白（E-cadherin）以及间充质标记物N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形 蛋白（Vimentin）以及ROCK 1 与P-Smad 2/3 蛋白的表达;Transwell 法检测莲子心新碱对TGF-β1 诱导的H1299 细胞侵袭、迁移的抑制作用;免疫荧光法检测H1299 细胞内ROCK 1 蛋白的表达及分布。结果TGF-β1 诱导 后H1299 细胞形态呈现间充质特性。与对照组比较,随着TGF-β1 浓度的升高,E-cadherin 表达明显降 低（P＜0.05,P＜0.01）,N-cadherin 与Vimentin 表达明显升高（P＜0.01,P＜0.001）,并且ROCK 1 蛋白的表达 也在这一过程中升高（P < 0.05）。莲子心新碱可以抑制H1299 细胞的活力,IC50 为5.04 μmol·L-1;同时与模型 组比较,莲子心新碱抑制了TGF-β1 促进的H1299 细胞EMT 过程及侵袭迁移作用（P＜0.001）,中、高剂 量组明显增加E-cadherin 蛋白的表达（P＜0.05）,明显减少N-cadherin 和Vimentin 蛋白的表达（P＜0.001）,还 明显降低了H1299 细胞内因TGF-β1 诱导而升高的ROCK 1（P＜0.001）和P-Smad2/3（P＜0.001）蛋白的水平。 免疫荧光结果显示莲子心新碱可以抑制TGF-β1 诱导的H1299 细胞胞质中ROCK 1 蛋白的表达及分布。 结论TGF-β1 可以诱导H1299 细胞发生EMT,莲子心新碱可以有效抑制这一过程,其机制可能是抑制了 TGF-β1/Smad/RhoA/ROCK 通路。     

罗勒多糖对TGF-β诱导A549细胞上皮间质转化的抑制作用研究

目的研究罗勒多糖抑制转化生长因子-β(TGF-β)诱导的A549细胞上皮间质转化的作用,揭示罗勒多糖可能治疗特发性肺纤维化的机制。方法 A549细胞分为正常对照组、模型组(TGF-β5 ng·m L~(-1))、罗勒多糖组(TGF-β5 ng·m L~(-1)+罗勒多糖200μg·m L~(-1)),观察各组细胞形态学变化;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)法检测各组Ⅰ型胶原蛋白(colⅠ)和上皮间质转化标志物表达;ELISA法检测各组细胞羟脯氨酸(HYP)浓度。结果与正常对照组比较,模型组细胞成纤维样变;与模型组比较,罗勒多糖组细胞维持上皮细胞形态。与正常对照组比较,模型组colⅠ基因表达明显上调(P0.01),E-cadherin基因表达下调(P0.01),Vimentin、α-SMA基因表达上调(P0.05);与模型组相比,罗勒多糖组E-cadherin基因表达上调(P0.05),Vimentin、α-SMA、colⅠ基因表达下调(P0.05)。与正常对照组比较,模型组HYP含量增加(P0.05);与模型组比较,罗勒多糖组HYP含量减少(P0.05)。结论罗勒多糖能抑制TGF-β诱导的A549细胞上皮间质转化,其作用机制与下调colⅠ、Vimentin、α-SMA基因表达,上调E-cadherin基因表达,降低HYP含量有关,罗勒多糖可用于治疗特发性肺纤维化。     

北沙参石油醚部位抑制TGF-β1诱导的A549细胞上皮间质转化

探讨北沙参石油醚部位对TGF-β1诱导的肺癌Ⅱ型上皮细胞A549上皮间质转化的抑制作用及其可能机制。以A549细胞为研究对象,采用5μg·L~(-1)TGF-β1诱导的上皮间质转化模型进行实验。设置空白对照组、模型组、北沙参石油醚组。MTT法检测北沙参石油醚部位对A549细胞存活率的影响;Real-time PCR分析北沙参石油醚部位对诱导后A549细胞ColⅠ,E-cadherin,Vimentin,α-SMA mRNA表达水平的影响。酶联免疫吸附法(ELISA)检测北沙参石油醚部位对诱导后细胞羟脯氨酸(HYP)分泌水平影响。细胞划痕检测北沙参石油醚部位对细胞运动能力的影响。从实验结果可以看出,北沙参石油醚部位能抑制A549细胞生长且呈药物浓度依赖关系。与模型组相比,北沙参石油醚部位能有效抑制上皮间质转化的标志性蛋白ColⅠ,Vimentin,α-SMA基因的表达,促进E-cadherin基因的表达。降低细胞内羟脯氨酸含量,同时降低细胞的运动能力。由此表明,北沙参石油醚部位能有效抑制TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞发生上皮间质转化,是特发性肺纤维化的潜在治疗药物。其机制可能通过调控ColⅠ,Vimentin,α-SMA,E-cadherin而实现。     

虎杖苷对TGF-β1诱导的人类肺泡上皮A549细胞EMT的影响

目的探讨虎杖苷对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的人类肺泡上皮A549细胞生长及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程的作用机制。方法体外培养A549细胞,随机分成5组:空白组、对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,分别加入普通培养液、含5ng/mL TGF-β1的培养液、含浓度为50μmol/mL的虎杖苷加TGF-β1的培养液、含浓度为100μmol/mL的虎杖苷加TGF-β1的培养液、含浓度为150μmol/mL的虎杖苷加TGF-β1的培养液进行干预,观察并记录不同时间段细胞形态变化;MTT法检测虎杖苷最佳药物浓度;蛋白质印迹法(Western blot)、实时PCR(Real-time PCR)检测上皮标志物E-cad、间质标志物Vimentin蛋白及mRNA表达水平。结果倒置相差显微镜观察到虎杖苷和TGF-β1干预后A549细胞由原来的鹅卵石状上皮形态转变成梭形,且细胞间隙变大,细胞间的连接变得松散,对照组较为明显,低、中、高剂量组比对照组细胞形态稍饱满;48h中剂量组虎杖苷对TGF-β1诱导的A549细胞EMT抑制作用最明显。在虎杖苷和TGF-β1作用下,E-cad蛋白及mRNA表达总体呈下调趋势(P0.05),与对照组比较,各药物组E-cad蛋白及mRNA表达下调幅度较小,且48h比24h明显。而Vimentin蛋白及mRNA表达总体呈上调趋势,与对照组比较,各药物组Vimentin蛋白及mRNA表达上调的幅度较小,且48h比24h明显,差异有统计学意义(P0.05)。结论虎杖苷能抑制TGF-β1诱导的A549细胞EMT过程,并存在时间和剂量依赖性,具有抑制肺纤维化的作用。     

芪术抗癌方对肝癌细胞上皮间质化的影响

【目的】探讨芪术抗癌方对肝癌HepG2细胞上皮间质化的影响。【方法】将HepG2细胞分为空白对照组,转化生长因子β1 （TGF-β1） 组,TGF-β1+芪术抗癌方1 mg/mL组,TGF-β1+芪术抗癌方2 mg/mL组等4组,显微镜下观察处理24 h后细胞的形态变化,划痕实验观察24 h细胞迁移能力,蛋白免疫印迹法检测细胞上皮间质化相关蛋白E钙黏蛋白（E-cadherin）、N钙黏蛋白（N-cadherin）、Vimentin、Snail、纤黏蛋白（Fibronectin）的表达情况。【结果】 HepG2细胞加入TGF-β1后出现上皮间质化样多形改变,而芪术抗癌方2个治疗组均能抑制这一细胞形态改变。划痕实验结果显示,TGF-β1组划痕愈合百分比较空白对照组显著增加（P < 0.05）,而芪术抗癌方2个治疗组划痕愈合百分比较TGF-β1组显著减小（P < 0.05）。蛋白免疫印迹法结果显示：TGF-β1组E-cadherin表达水平较空白对照组降低,N-cadherin、Vimentin、Fibronectin和Snail表达水平较空白对照组均升高,其中2组的Fibronectin表达水平比较,差异有统计学意义（P < 0.05）;与TGF-β1组比较,芪术抗癌方2个治疗组E-cadherin表达水平均升高,N-cadherin、Vimentin、Snail和Fibronectin表达水平均降低,其中,芪术抗癌方1 mg/mL组Vimentin、Snail 表达水平,与 TGF-β1 组比较,差异有统计学意义（均 P < 0.05）,芪术抗癌方 2 mg/mL 组 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Fibronectin表达水平,与TGF-β1组比较,差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。【结论】 芪术抗癌方对TGF-β1诱导的HepG2细胞上皮间质化具有抑制作用。     

益气除痰方干预TGF-β信号途径逆转A549细胞上皮间质转化研究

目的:观察益气除痰方是否能通过干预TGF-β信号途径,逆转肺癌A549细胞上皮间质转化(EMT)。方法:通过暴露于TGF-β_1环境中,诱导肺腺癌细胞株A549发生EMT,并以益气除痰方含药血清进行干预,相差显微镜下观察各组细胞形态变化;划痕实验、Transwell实验检测各组细胞迁移及侵袭能力;Western-blot检测各组细胞EMT相关蛋白及TGF-β信号通路蛋白Smad2/3的表达。结果:镜下可见经TGF-β_1孵育的A549细胞呈现明显的间质细胞形态,益气除痰方含药血清作用24 h后细胞A549细胞出现凋亡且间质化程度较低;划痕实验结果显示:与空白血清组比较,TGF-β_1+空白血清组A549细胞迁移及侵袭能力显著升高,益气除痰方可降低TGF-β_1所升高的细胞迁移及侵袭能力;Western-blot检测显示TGF-β_1可以激活Smad2/3通路下调E-cadherin的表达,上调Vimentin的表达,而益气除痰方含药血清可抑制该过程。结论:益气除痰方可能通过干预TGF-β/Smad信号通路上调E-cadherin表达,下调Vimentin表达,从而逆转肺癌A549细胞上皮间质转化,抑制肿瘤细胞的侵袭迁移。     

12种中药醇提取物对TGF-β1诱导的A549细胞上皮间质转化的干预作用

目的对茯苓、蒲黄、白及、鸡血藤、郁金、红花、牛膝、何首乌、黄芪、仙茅、鹿衔草、白化参共12种中药的醇提取物进行筛选,探讨12种中药醇提取物对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的非小细胞肺癌A549细胞上皮间质转化(EMT)的干预作用。方法10 ng/ml TGF-β1诱导A549细胞;采用MTT法检测12种中药醇提取物对A549细胞增殖的影响;观察醇提取物对TGF-β1诱导的A549细胞形态变化的影响;采用Western blot方法检测醇提取物对TGF-β1诱导的EMT相关标志蛋白的表达,以及对EMT相关信号转导的影响。结果 10 ng/ml的TGF-β1诱导A549细胞48 h后使其发生EMT过程;何首乌醇提取物不影响A549细胞增殖;与TGF-β1组相比较,100μg/ml的何首乌醇提取物能逆转A549细胞形态变化过程;与TGF-β1组相比较,100μg/ml的何首乌醇提取物降低vimentin蛋白表达水平(P0.05),上调E-cadherin蛋白表达水平(P0.05);与TGF-β1组比较,100μg/ml的何首乌醇提取物降低pSmad2和p-Erk蛋白表达水平(P0.05)。结论何首乌醇提取物具有抑制TGF-β1诱导的A549细胞上皮间质转化过程的作用,这可能与Smad2和Erk1/2信号通路有关。     

健脾化瘀方体外通过外泌体影响肝癌细胞的迁移、侵袭及上皮间质转化

目的探讨健脾化瘀方（JHD）通过外泌体对肝癌细胞迁移、侵袭及上皮间质转化（EMT）的影响。方法 利用转化生长因子β1（TGF-β1）刺激MHCC97H 细胞,构建肝癌细胞EMT 模型。根据处理条件,将细胞分为 4 组,①对照组：不进行干预;②模型组：TGF-β1（10 ng·mL-1）;③JHD 低浓度组：TGF-β1（10 ng·mL-1）+健 脾化瘀方（2 mg·mL-1）;④JHD 高浓度组：TGF-β1（10 ng·mL-1）+健脾化瘀方（4 mg·mL-1）。干预48 h 后,采用 超速离心法提取各组细胞培养上清液的外泌体,通过透射电镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）、Western Blot 法检测外泌体标志蛋白（CD63、CD81、HsP70、CD9）,以及外泌体内吞实验对外泌体进行鉴定。将提取的 4 组外泌体分别与MHCC97H 细胞共培养24 h/48 h 后,分离MHCC97H 细胞,进行划细胞划痕实验、Transwell 细胞侵袭实验及Western Blot 法检测EMT 相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）。结果透射电镜下观 察到外泌体的形态呈囊泡状,分布不一,有单个分布,也有聚集成组,背景清晰,无明显污染物,各组外泌体 形态相近,无明显差异,直径在30~140 nm 之间;纳米颗粒追踪分析仪检测到4 组外泌体粒径的峰值在130~ 150 nm 之间,与电镜观察结果基本一致;各组均可检测到外泌体标志蛋白CD63、CD81、HsP70、CD9 表达。 被PKH26 标记的外泌体可被MHCC97H 细胞重新吸收内化。与对照组比较,模型组的MHCC97H 细胞迁移能 力（24、48 h）及侵袭能力均显著增强（P＜0.01）, E-cadherin 蛋白表达显著下调（P＜0.01）, Vimentin、 N-cadherin 蛋白表达显著上调（P＜0.01）。与模型组比较,JHD 高、低浓度组的MHCC97H 细胞迁移能力（24、 48 h）及侵袭能力显著减弱（P＜0.01）,E-cadherin 蛋白表达显著上调（P＜0.01）,Vimentin、N-cadherin 蛋白表 达显著下调（P＜0.01）。结论健脾化瘀方体外可通过外泌体抑制MHCC97H 细胞的迁移、侵袭及上皮间质 转化。     

扶正祛邪方对肺癌A549细胞EMT的抑制作用及机制研究

目的:研究中药复方扶正祛邪方对肺癌A549细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的抑制作用及机制研究。方法:采用MTT方法观察扶正祛邪方对人腺癌A549细胞的抑制作用;采用Transwell方法观察扶正祛邪方对人腺癌A549细胞侵袭的抑制作用;Western blot方法观察A549细胞EMT过程中上皮细胞、间质细胞标志物E-cadherin、Vimentin、FN的表达,转录因子Snail的蛋白表达,以及信号分子PSmad2/3的表达。结果:1MTT结果显示:扶正祛邪方对人腺癌A549细胞的抑制作用呈剂量和时间依赖。2Transwell侵袭实验结果显示:不同浓度的扶正祛邪方对人腺癌A549细胞的穿膜能力有抑制作用(P0.05)。3Western blot结果显示:与模型组相比,扶正祛邪方上调E-cadherin蛋白表达,下调Vimentin、FN、P-Smad2/3蛋白表达(P0.05);结论:1扶正祛邪方对A549细胞有直接的抑制作用;2扶正祛邪方对TGF-β1诱导人腺癌A549细胞EMT有抑制作用,其机制与抑制Smad2/3的磷酸化,进而减少Snail蛋白的表达有关。     

健脾消癌方对转化生长因子-β1诱导的SW620细胞上皮间质转化的影响

目的观察健脾消癌方对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的SW620细胞上皮间质转化的影响,探讨其防治结直肠癌的可能机制。方法体外培养结直肠癌细胞SW620。CCK-8法和Transwell小室实验测定细胞增殖、侵袭及迁移能力,qRT-PCR和Western blot检测E-cadherin和Vimentin的基因和蛋白表达。结果健脾消癌方药物血清能抑制SW620细胞体外增殖、迁移和侵袭能力;与空白组比较,TGF-β1诱导组细胞E-cadherin表达水平下降,Vimentin表达水平升高(P0.05);与TGF-β1诱导组比较,健脾消癌方+TGF-β1组细胞E-cadherin表达水平升高,Vimentin表达水平下降(P0.05)。结论健脾消癌方可通过调控TGF-β1诱导的SW620细胞上皮间质转化过程,抑制结肠癌的生长、侵袭和迁移能力,达到防止结直肠癌复发和转移的目的。     

补中益气汤含药血清对TGF-β1介导的A549细胞中Twistl表达的影响

目的:观察补中益气汤含药血清对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)介导的人肺腺癌A549细胞上皮间质转化过程中Twistl表达的影响。方法:制备最佳浓度补中益气汤最佳浓度含药血清作用于TGF-β1诱导的A549细胞,实验分组为空白血清组、空白血清+TGF-β1组、以及补中益气汤最佳浓度补中益气汤含药血清+TGF-β1组。采用免疫组化、western-blot和realtime PCR法分别检测Twistl在蛋白和基因水平表达的变化。结果:最佳浓度的补中益气汤含药血清能使上皮间质化的A549细胞中Twistl蛋白表达下降,mRNA表达水平降低。结论:补中益气汤含药血清能抑制TGF-β1介导的A549细胞上皮间质化过程中Twistl表达。     

补中益气汤含药血清对TGF-β1介导的A549细胞中拓扑异构酶Ⅱα表达的影响

目的:观察补中益气汤含药血清对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)介导的人肺腺癌A549细胞上皮间质转化过程中耐药标志物TopoⅡα表达的影响。方法:制备最佳浓度补中益气汤含药血清作用于TGF-β1诱导的A549细胞,实验分组为空白血清组、最佳浓度补中益气汤含药血清+TGF-β1组、以及空白血清+TGF-β1组。采用免疫组化、western-blot和realtime PCR法分别检测TopoⅡα在蛋白和基因水平表达的变化。结果:最佳浓度的补中益气汤含药血清能使上皮间质化的A549细胞中TopoⅡα蛋白表达增加,mRNA表达水平升高。结论:补中益气汤含药血清能增加TGF-β1介导的A549细胞上皮间质化过程中TopoⅡα表达。     

天龙咳喘灵提取物对A549细胞上皮间质转化的影响及机制研究北大核心CSCD

目的探讨天龙咳喘灵提取物能否抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的A549细胞上皮-间质转化(EMT)及其作用机制。方法 1.用TGF-β1刺激体外培养的A549细胞发生EMT,观察天龙咳喘灵提取物干预后细胞形态的改变,Real-time PCR和Western blot检测上皮标志E-cadherin和间质标志Fibronectin的表达情况。2.检测不同时间点TGF-β1和天龙咳喘灵提取物对Notch1、Jagged1和Hey1表达的影响。3.转染Jagged1si RNA并用TGF-β1刺激细胞,检测E-cadherin和Fibronectin的蛋白表达情况。结果 1.与空白对照组比较,TGF-β1组细胞发生间质细胞形态变化,E-cadherin的m RNA和蛋白表达下调,Fibronectin表达上调;与TGF-β1组相比,天龙咳喘灵提取物组细胞恢复上皮细胞形态,E-cadherin的m RNA和蛋白表达上调,Fibronectin表达下调。2.TGF-β1刺激后,Jagged1、Hey1的表达量随着时间上调,而Notch1表达量无明显变化;天龙咳喘灵提取物可使Notch1、Jagged1、Hey1的表达量均随着时间下调。3.转染Jagged1 si RNA成功敲除Jagged1基因后,TGF-β1诱导的E-cadherin表达下调和Fibronectin表达上调受到抑制。结论天龙咳喘灵提取物通过下调Notch信号通路抑制TGF-β1诱导的上皮间质转化。     

基于Wnt 通路探讨生地黄水提物对单侧输尿管梗阻大鼠肾纤维化 的作用机制

目的观察生地黄水提物对单侧输尿管梗阻（UUO）模型大鼠肾纤维化的影响,并基于Wnt 通路探讨其 延缓肾纤维化进程的可能机制。方法通过结扎左侧输尿管建立UUO 大鼠模型。将SD 大鼠随机分为假手术 组、模型组和生地黄低、中、高剂量组（0.8、1.6、3.2 g·kg-1）,术后连续灌胃给药14 d。采用HE 染色法及 Masson 染色法观察生地黄水提物对梗阻侧肾脏病理损伤和纤维化的改善作用;采用免疫组化法检测肾脏纤维 化相关蛋白CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin 的表达和分布;免疫荧光法检测上皮间质转化标志蛋白α-SMA、 E-cadherin 的表达;Western Blot 法检测Wnt 通路关键蛋白Wnt5a、GSK-3β 和β-catenin 的表达。结果与假 手术组比较,模型组大鼠肾脏病理损伤和间质胶原纤维沉积严重,E-cadherin 表达和分布减少,CollagenⅠ、 α-SMA、Vimentin 以及Wnt5a、GSK-3β、β-catenin 蛋白表达明显上调（P＜0.01）。与模型组比较,生地黄各 剂量组能够改善UUO 大鼠的肾小管扩张、小管上皮细胞空泡变性以及坏死等病理学改变和间质胶原沉积,增 加E-cadherin 表达和分布,并明显下调CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin、Wnt5a、GSK-3β 和β-catenin 蛋白表 达（P＜0.05,P＜0.01）。结论生地黄水提物能够改善UUO 模型大鼠肾脏病理损伤和纤维化程度,其机制可 能与抑制Wnt 通路活化,阻抑上皮间质转化,从而减少细胞外基质沉积,延缓纤维化进程有关。     

天龙咳喘灵提取物对A549细胞上皮间质转化的影响及机制研究

目的探讨天龙咳喘灵提取物能否抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的A549细胞上皮-间质转化(EMT)及其作用机制。方法 1.用TGF-β1刺激体外培养的A549细胞发生EMT,观察天龙咳喘灵提取物干预后细胞形态的改变,Real-time PCR和Western blot检测上皮标志E-cadherin和间质标志Fibronectin的表达情况。2.检测不同时间点TGF-β1和天龙咳喘灵提取物对Notch1、Jagged1和Hey1表达的影响。3.转染Jagged1si RNA并用TGF-β1刺激细胞,检测E-cadherin和Fibronectin的蛋白表达情况。结果 1.与空白对照组比较,TGF-β1组细胞发生间质细胞形态变化,E-cadherin的m RNA和蛋白表达下调,Fibronectin表达上调;与TGF-β1组相比,天龙咳喘灵提取物组细胞恢复上皮细胞形态,E-cadherin的m RNA和蛋白表达上调,Fibronectin表达下调。2.TGF-β1刺激后,Jagged1、Hey1的表达量随着时间上调,而Notch1表达量无明显变化;天龙咳喘灵提取物可使Notch1、Jagged1、Hey1的表达量均随着时间下调。3.转染Jagged1 si RNA成功敲除Jagged1基因后,TGF-β1诱导的E-cadherin表达下调和Fibronectin表达上调受到抑制。结论天龙咳喘灵提取物通过下调Notch信号通路抑制TGF-β1诱导的上皮间质转化。     

地黄对人肺泡上皮细胞间质转化的抑制作用

目的:探讨地黄(环烯醚萜类苷、低聚糖和多糖提取物按照一定比例形成的组合物)对人肺泡上皮细胞间质转化的影响和机制。方法:MTT法分析地黄对A549细胞增殖的影响。TGF-β1诱导A549肺泡上皮细胞的间质转化并进行不同剂量的地黄干预;圆形度定量法和免疫细胞化学法分析细胞形态和细胞E-cad、FN、Collagen-I和α-SMA蛋白的表达;双抗体夹心酶联免疫吸附法检测细胞分泌MMP-9和TIMP-1水平。结果:地黄对A549细胞增殖的抑制作用随着剂量的增加而增强,200μg/ml剂量显著抑制细胞增殖(P0.01)。与正常组比较,TGF-β1组圆形度和E-cad表达显著降低,α-SMA、FN和Collagen-I表达显著升高,MMP-9和TIMP-1分泌量显著增加(P0.01)。与TGF-β1组比较,50μg/ml、100μg/ml组的圆形度和E-cad表达显著升高,α-SMA表达显著降低;地黄对FN、Collagen-I的表达和MMP-9分泌量没有显著的影响;25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml组TIMP-1分泌量显著增加。结论:地黄能有效抑制A549人肺泡上皮细胞的上皮间质转化,作用机制涉及TGF-β1信号转导通路,尚有抑制MMP-9降解细胞外基质的作用。     

基于PI3K/Akt信号通路探讨固本解毒方含药血清对肺癌A549细胞EMT的影响

目的 观察固本解毒方对肺癌A549细胞上皮间质转化（EMT）的影响,从磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路探讨其作用机制。方法 制备固本解毒方含药血清,噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞存活率并筛选固本解毒方浓度用于后续实验。分为空白组、固本解毒方组（2.5%、5%、10%含药血清）、PI3K/Akt通路激活剂（SC79）组、固本解毒方+SC79组。划痕实验检测细胞迁移力,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化（p）-Akt、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、p-GSK-3β蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测N-cadherin、Vimentin mRNA表达。结果 与空白组比较,固本解毒方组含药血清（2.5%、5%、10%、20%、40%）A549细胞活力降低（P<0.05）,选择固本解毒方含药血清10%、5%、2.5%作为高、中、低浓度进行后续实验。与空白组比较,固本解毒方组A549细胞迁移力降低。Real-time PCR结果显示,与空白组比较,固本解毒方组A549细胞N-cadherin、Vimentin mRNA表达显著降低（P<0.01）。Western blot结果显示,与空白组比较,固本解毒方组（含药血清5%、10%）A549细胞E-cadherin蛋白表达显著升高（P<0.01）,固本解毒方组N-cadherin、Vimentin、p-Akt、p-GSK-3β蛋白表达显著降低（P<0.01）,p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β表达明显降低（P<0.05,P<0.01）。与SC79组比较,固本解毒方组（含药血清10%）E-cadherin蛋白表达显著升高（P<0.01）,N-cadherin、Vimentin、p-Akt、p-GSK-3β、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β表达显著降低（P<0.01）。与固本解毒方组（含药血清10%）比较,固本解毒方+SC79组（含药血清10%）E-cadherin蛋白表达显著降低（P<0.01）,N-cadherin、Vimentin、p-Akt、p-GSK-3β、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达显著升高（P<0.01）。结论 固本解毒方可抑制肺癌A549细胞迁移和EMT,其机制与调控PI3K/Akt信号通路有关。