人乙醇脱氢酶ADH1C*1等位基因的克隆与鉴定

目的:克隆人乙醇脱氢酶ADH1C*1等位基因.方法:取人癌旁正常肝组织,用RT-PCR法获得ADH1C基因的cDNA,然后用双酶切得到目的基因并定向克隆到pUC19载体上.经过蓝白筛选后,用限制性酶谱和DNA测序以及BLAST对比分析进行鉴定.结果:①用RT-PCR方法扩增出与预期大小相符的ADH1C基因片段;②经蓝白筛选获得了带pUC19-ADH1C重组质粒的白色菌落;③用限制性酶谱和DNA测序并作BLAST分析证实pUC19-ADH1C*1重组质粒构建成功.结论:本实验构建的pUC19-ADH1C*1重组质粒,含有ADH1C*1结构基因的所有序列,与GeneBank数据库中的ADH1C基因的RefSeq序列比对,其碱基序列的一致性达到99%,氨基酸序列的一致性达到100%.在构建pUC19-ADH1C*1重组质粒时,采用双酶切的方法,可以很方便的定向克隆到真核表达载体中进行进一步的研究.     

云南汉族酒精依赖综合征与ADH2、ALDH2基因多态性的关联研究

目的 了解乙醇脱氢酶2(ADH2)和乙醛脱氢酶2(ALDH2)的不同基因型及等位基因频率在云南汉族酒精依赖综合征患者组和健康对照组的分布差异. 方法 应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析法,对ADH2基因和ALDH2基因的特定片段进行特异性扩增,限制性内切酶酶切,非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳检测,结合硝酸银染色法判定基因型. 结果 ADH2基因存在2种等化基因(ADH2*1、ADH2*2)和3种基因型(ADH2*1/*1、*1/*2和*2/*2),2种等位基因的分布在两组的差异有统计学意义(P<0.05),ADH2*2等位基因频率在酒精依赖综合征患者组降低,3种基因型的分布在两组无显著差异(P>0.05).ALDH2基因存在2种等位基因(ALDH2*1、ALDH2*2)和3种基因型(ALDH2*1/*1、*1/*2和*2/*2),2种等位基因和3种基因型的分布在两组中的差异均有统计学意义(P<0.05),酒精依赖综合征患者组AL-DH2*1/*2基因型和ALDH2*2等位基因频率降低. 结论 ADH2*2等位基因和ALDH2*2等位基因对于酒精依赖综合征发病有保护作用.     

乙醇依赖综合征与ADH2、CYP4502E1基因多态性的相关研究

目的对云南汉族酒依赖综合征与ADH2、CYP4502E1基因多态性进行相关性研究;方法采用PCR—RFLP方法,对来自云南地区的44例乙醇依赖综合征患者以及与其配比的30例对照个体的ADH2基因第3外显子处G143A单核苷酸多态位点等位基因频率和基因型频率、CYP2E1基因5’端非编码区的RsaL／PstI酶切位点多态性等位基因频率和基因型频率以及是否与乙醇依赖综合征相关进行分析。结果（1）在患者组ADH2基因3种基因型ADH2^＊1／^＊1、ADH2^＊1／^＊2、ADH2^＊2／^＊2分别为36％、43％、21％,患者组和对照组相比较无显著差异（P〉0．05）;等位基因ADH2^＊1和ADH2^＊2在患者组中的基因频率为0．58和0．42,患者组和对照组相比较分布有差异（P〈0．05）,患者组ADH2^＊2等位基因频率降低;（2）CYP2E1基因在患者组中A、B型基因分布为59％、41％,患者组和健康对照组两种基因型的分布有差异（P〈0．05）,B型基因在乙醇依赖组升高;等位基因C1和C2在患者组中的频率为0．80和0．20,患者组和对照组两种等位基因分布有差异（P〈0．05）,患者组C2等位基因频率升高。结论CYP2E1基因多态性与乙醇依赖综合征发生有关,ADH2^＊2等位基因对于乙醇依赖综合征发病有保护作用,而C2等位基因在乙醇依赖综合征的发生中起一定的作用。     

乙醇脱氢酶1B-rs1229984和乙醛脱氢酶2基因-rs671多态性实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立乙醇脱氢酶1B （ADH1B）基因rs1229984（G/A）和乙醛脱氢酶2基因rs671（G/A）多态性的实时荧光定量PCR分型方法。方法 分别采用双TaqMan-MGB探针法建立ADH1B-rs1229984多态性,和ARMS-TaqMan探针法建立ALDH2-rs671多态性的实时荧光定量PCR分型方法。根据荧光定量PCR的循环阈值（Ct值）的差值ΔCt值判定等位基因型,并采用所建方法对345例中国汉族人进行了分型检测。结果 所建方法对345例研究对象分型检测显示,ADH1B-rs1229984多态性的GG （ADH1B*1/*1）、GA （ADH1B*1/*2）和AA （ADH1B*2/*2）型的ΔCt值（ΔCt=G型TaqMan-MGB探针Ct值-A型TaqMan-MGB探针Ct值）分别为-13.72±1.33（40例）、0.50±0.17（150例）和6.62±0.54（155例）;ALDH2-rs671的GG （ALDH2*1/*1）、GA （ALDH2*1/*2）和AA （ALDH2*2/*2）型的ΔCt值（ΔCt=G引物反应体系Ct值-A引物反应体系Ct值）分别为-15.30±0.84（239例）、0.17±0.45（96例）和15.86±0.74（10例）。345例研究对象中,ADH1B*1/*2和ALDH2*1/*1（31.3%）、ADH1B*2/*2和ALDH2*1/*1（28.7%）是2个等位基因的主要组合型（60%）,未见ADH1B*1/*1和ALDH2*2/*2组合型。结论 所建分型检测方法皆具有闭管、一步检测、准确和高通量等特点。     

ADH1B R48H多态性与口腔癌的关联研究

目的:检测乙醇脱氢酶1B(ADH1B)R48H多态性与口腔癌的关系。方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法在80例口腔癌患者和108例正常对照中进行基因分型,并用χ2检验检测ADH1BR48H多态性的基因型和等位基因频率在病例组和对照组中是否有差异。结果:ADH1B R48H多态性的基因型和等位基因频率在病例组和对照组的差异无统计学意义。结论:ADH1B R48H多态性可能在口腔癌的发生中不起主要作用。     

青岛市汉族群体ADH2和ALDH2基因多态性及其与乙醇代谢速率关系

目的了解青岛市汉族人群乙醇脱氢酶（ADH2）和乙醛脱氢酶（ALDH2）基因的多态性分布及其乙醇代谢速率。方法提取青岛市179例汉族健康人的DNA,用扩增片段长度多态性方法,设计特殊引物对ADH2和ALDH2基因的特定序列进行扩增,并检测不同ADH2基因型受试者的乙醇代谢速率。结果 ADH2基因的两种等位基因ADH2＊1和ADH2＊2频率分别为42.74%和57.26%,3种基因型ADH2＊1/＊1、ADH2＊1/＊2和ADH2＊2/＊2频率分别为15.08%、55.31%和29.61%;ALDH2基因的两种等位基因ALDH2＊1和ALDH2＊2频率分别为72.26%和23.74%,3种基因型ALDH2＊1/＊1、ALDH2＊1/＊2和ALDH2＊2/＊2频率分别为59.78%、39.96%和7.26%。ADH2＊1/＊1基因型的乙醇代谢速率为（113.6±3.6）mg/（L·h）,ADH2＊1/＊2为（85.9±6.0）mg/（L·h）,ADH2＊2/＊2为（60.6±4.0）mg/（L·h）,差异有显著性（F=95.22,P〈0.01）。结论青岛市汉族群体ADH2和ALDH2存在基因多态性,ADH2基因多态性与乙醇代谢的快慢有关。     

Genotype of ethanol metabolizing enzyme genes by oligonucleotide microarray in alcoholic liver disease in Chinese people

目的　利用基因芯片检测乙醇代谢相关酶的单核苷酸多态性 (SNPs) ,并阐明乙醇代谢相关酶基因多态性与酒精性肝病的关系。方法　参照“酒精性肝病的诊断依据及治愈、好转标准” ,并排除乙型肝炎表面抗原和丙型肝炎抗体阳性者 ,不典型者做肝穿刺活检 ,选择 16 5例嗜酒者 ,其中无肝脏损害的有 4 3例 ,酒精性肝病 12 2例 ;正常对照组 6 5例为研究对象。抽取 3ml外周血 ,分离外周血单核细胞 ,按常规提取DNA ,行 4重不对称PCR ,PCR产物与寡核苷酸探针微阵列芯片杂交 ,并扫描分析结果。结果　健康对照组、嗜酒者组、无肝脏损害的嗜酒者组和酒精性肝病组的ADH2 1等位基因频率分别为37 6 9% ,5 5 76 % ,4 6 5 1% ,5 9 0 2 % ;ADH2 2等位基因频率相应为 6 2 31% ,4 4 2 4 % ,5 3 4 9% ,4 0 98% ;未发现ADH2 3型等位基因。嗜酒者和酒精性肝病患者的ADH2 1频率明显高于健康对照 ,酒精性肝病患者高于无肝脏损害的嗜酒者 ;无肝脏损害的嗜酒者的ADH3 2频率高于健康对照 ;嗜酒者和酒精性肝病患者的ALDH2 2等位基因低于健康对照组 ,酒精性肝病患者ALDH2 2等位基因频率显著低于无肝脏损害的嗜酒者。嗜酒者组未发现ALDH2 2等位基因的纯合子。结论　ADH2 ,ADH3和ALDH2基因多态性将影响国人的饮酒倾向 ;ADH2 2 ,AD     

乙醇脱氢酶1B基因变异与高甘油三酯血症对早发冠心病的影响

目的探讨乙醇脱氢酶（ADH）1B基因变异（ADH1B*1/2）与高甘油三酯血症（HTG）交互作用对早发冠心病的影响。方法采用以医院为基础的病例对照研究方法，选择新诊断的冠心病患者为研究对象；男性55岁及55岁以前和女性65岁及65岁以前患冠心病为早发冠心病，男性55岁以后和女性65岁以后患冠心病为迟发冠心病。以167例早发冠心病患者为病例组，以235例迟发冠心病患者为对照组。TG>2.26?mmol/L为高甘油三酯血症；运用PCR-限制性片段长度多态性检测ADH1B*1/2基因变异；用多元Logistic回归调整潜在的混杂因素及估计比值比（OR）。用相加模型分析ADH1B*1/2基因变异与HTG间交互作用。结果ADH1B*1/2基因变异与HTG之间对早发冠心病具有正交互作用，协同效应指数（S）为1.72；交互效应超额相对危险度（RERI）为1.78；归因交互效应百分比（AP）为33.77％。用多元Logistic回归调整性别、吸烟指数、饮酒指数、体重指数、总胆固醇及舒张压后，ADH1B*1/2基因变异与HTG之间对早发冠心病仍具有正交互作用。调整上述混杂因素后，S为2.96；RERI为3.01；AP为54.29％。结论ADH1B*1/2基因变异与HTG在早发冠心病的患病中存在明显的正相加模型交互作用，使早发冠心病患病危险性增加约3倍；ADH1B*1/2基因变异与HTG同时存在时，在早发冠心病患病危险性中约54％是由两者交互作用所导致。     

动脉导管未闭患儿TFAP2B基因变异筛查

目的   检测动脉导管未闭(PDA)患儿TFAP2B基因序列，探讨TFAP2B基因变异与PDA的关系。方法   选取74例PDA患儿为病例组，100例健康儿童为对照组，分别收集外周血并提取基因组DNA。应用聚合酶链反应扩增TFAP2B基因的全部外显子及其两侧的部分内含子，采用Sanger测序法对扩增片段进行测序。将所测得序列与Genbank及NCBI数据库中TFAP2B基因序列进行比对，以识别TFAP2B基因有无突变或多态性。应用χ2检验比较TFAP2B基因多态在病例组和对照组之间的频率分布差异。结果   病例组和对照组TFAP2B基因均发现1个新的单核苷酸多态位点(SNP)，TFAP2B基因第1外显子编码区上游第34位鸟嘌呤转变为腺嘌呤(c.1-34G→A)。该位点等位基因及基因型在病例组和对照组间的频率分布差异无统计学意义(P＞0.05)。结论   TFAP2B基因c.1-34G→A单核苷酸多态位点与动脉导管未闭之间无明显相关。     

人胸腺素α原cDNA序列多态性分析

目的:通过对人胸腺素α原(prothymosin-α,ProTα)cDNA测序来分析人胸腺素α原的序列多态性.方法:应用RT-PCR技术从健康人外周血及健康新生儿脐带血中扩增胸腺素α原cDNA,纯化后与克隆载体pMD18-T连接,进行克隆测序,并与标准序列比对,分析其多态性.结果:序列分析结果表明,克隆的ProTα基因的核苷酸序列并不一致.与已报道的胸腺素α原基因(NM-002823)进行比较,发现存在2种变异:Ⅰ类变异包括107位单核苷酸突变(A→G)、110～121位和191～205位的核苷酸片段缺失;Ⅱ类变异为306位单核苷酸(G)缺失,多见于年龄60～80岁者.结论:本研究中ProTα cDNA序列存在2种变异,但并未影响其N-端前28个氨基酸.     

ADH2基因多态性与酒精性心肌病关系的研究

目的研究ADH2基因多态性与酒精性心肌病的关系。方法采用前瞻性研究，随机选择56例正常人和64例嗜酒的非酒精性心肌病及非酒精性肝病患者及82例酒精性心肌病患者为研究对象，应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性方法检测ADH2基因多态性。结果嗜酒组和酒精性心肌病组ADH2＊1／-k1及ADH2＊1／＊2型频率高于对照组（P〈0．05），而ADH2＊2／＊2型频率低于对照组（P〈0．05）。同时，嗜酒组和酒精性心肌病组ADH2＊1等住基因的频率高于对照组（P〈0.05），而ADH2＊2等位基因的频率低于对照组（P〈0.05）。嗜酒组和酒精性心肌病组ADH2基因型频率无统计学差异，等住基因的频率亦无统计学差异。结论ADH2基因多态性与嗜酒相关。与酒精性心肌病发生的关系未得到证实。     

基因的多态性与广东人尖锐湿疣的关系

目的 研究低分子量多肽（LMP）基因多态性与尖锐湿疣发病的关系。方法 应用聚合酶链反应一限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）技术检测尖锐湿疣患者和正常人群低分子量多肽基因LMP2和LMP70。结果 LMP2＊B等位基因频率在尖锐湿疣患者中增高（P〈0．05），LMP7等位基因频率与正常对照组比较，差别无显著性（P〉0．05），LMP2和LMP7基因型频率与对照组比较差别无显著性（P〉0．05）。结论LMP2＊B等位基因可能与尖锐湿疣发病有关。     

重组体pcDNA3.1(+)-tyr的构建及在小鼠NIH3T3细胞中的表达

[目的]克隆酪氨酸酶基因(tyr),构建pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞表达。[方法]用RT-PCR法从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆tyr全长cDNA片段,利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)的T7启动子下游,并用脂质体法导入NIH3T3细胞,RT-PCR,酪氨酸酶活性测定及多巴染色法检测tyr的表达。[结果]成功克隆1.74kb的全长tyr cDNA片段,经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致,tyr准确克隆入pcDNA3.1(+)的多克隆位点,RT-PCR及酪氨酸酶活性测定等方法检测到转染了重组体的NIH3T3细胞中有tyr的表达。[结论]本实验成功构建了pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并成功导入NIH3T3细胞中表达。     

大连汉族慢性肾小球肾炎尿毒症与HLA - DRB1的相关性分析

[目的]探讨大连汉族慢性肾小球肾炎尿毒症与HLA - DRB1等位基因的相关性,找出大连地区汉族慢性肾小球肾炎尿毒症的易感基因和保护基因.[方法]以2003年9月-2009年5月等待肾移植的511名慢性肾小球肾炎尿毒症患者为病例组,以中国造血干细胞库大连HLA实验室健康捐献者为对照组,对两组的HLA - DRB1基因的...     

云南省精神分裂症患者关联基因检测

目的:采用简易微列阵法检测谷氨酸递质系统中与精神分裂症相关联的基因。方法:采用简易微阵列法,即PCR-等位基因特异性引物延伸和硝酸纤维素膜杂交法分析云南省255例精神分裂症患者和262名对照4个候选基因的4个SNP位点[rs778293(G72/G30)、rs2299225(GRM3)、rs11146020(GRIN1)和rs2814351(GRID1)]与精神分裂症的关联性。结果:对照组谷氨酸递质系统中的4个基因的4个SNP位点均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。4个位点中,rs778293位点与精神分裂症存在关联性(基因型频率χ2=14.017,等位基因频率χ2=14.951,P<0.05)。结论:G72/G30基因SNP多态性与精神分裂症有关。     

Association between SNP rs10569304 on the second expressed region of hole gene and the congenital heart disease

The correlation of single nucleotide polymorphism (SNP) rs10569304 on the second expressed region of hole gene and congenital heart disease (CHD) of human being, and the effect of hole gene on CHD were investigated. 179 patients with CHD as CHD group and 183 healthy people as control group were selected in the case-control study. DNA was abstracted from the peripheral blood by phenol-chloroform method. Primer was designed for the flanking sequence of SNP rs10569304 on the second expressed region of hole gen...     

C57BL／6小鼠ZFP580C端编码基因的克隆及序列分析

【目的】克隆C57BL／6小鼠ZFP580C端编码基因cDNA序列，并进行序列测定和分析。【方法】参照GENBANK公布的C57BL／6小鼠ZFP580eDNA序列（注册号为AK005257），根据ZFP580C端编码基因eDNA序列设计1对引物，采用RT-PCR技术，从C57BL／6小鼠的肾脏组织中扩增ZFP580C端编码基因eDNA序列，回收纯化后与T载体连接，构建重组子pMD18-T-ZFP580，转化大肠杆菌DH5a。阳性克隆以限制性酶切分析与PCR法鉴定后，测定序列并分析。【结果】自C57BL／6小鼠肾脏组织获得总RNA，扩增出255bp的基因片段，成功构建阳性克隆重组子pMD-T-ZFP580，经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致。所测定的C57BL／6小鼠ZFP580C端基因eDNA序列与13本RIKEN基因组中心于GENBANK注册（注册号为AK005257）的完全一致，与人ZNF580C端编码基因eDNA序列比较，核苷酸序列同源性为90％；该eDNA序列所编码的氨基酸序列与人ZNT580基因C端比较，同源性为100％，均编码有3个串联重复的C2H2型锌指蛋白主构域。其氨基酸序列与大鼠、犬、牛比较，同源性分别为100％、100％、98％。【结论】成功克隆C57BL／6小鼠ZFP580C端编码基因，该基因在不同种属间高度保守。     

流动引物PCR高效筛选阳性XRCC1基因敲除小鼠细胞的方法

[目的]探索流动引物PCR筛选阳性XRCC1基因敲除细胞的可行性。[方法]构建基因敲除质粒,嘌呤霉素抗性基因5’端加上额外的来自野生型基因被敲除位点内的20 bp DNA序列。使用流动引物(floating primer)和这20 bp序列结合,PCR筛选阳性克隆。[结果]利用流动引物成功筛选小鼠体细胞XRCC1(X射线修复交叉互补蛋白)一个等位基因敲除的阳性克隆子。[结论]流动引物PCR方法可以应用于基因敲除小鼠体细胞的筛选。