携载川芎嗪缓释微粒导电水凝胶修复脊髓损伤实验研究

目的 探讨携载川芎嗪缓释微粒导电水凝胶（以下简称“TGTP水凝胶”）对脊髓损伤大鼠的神经保护作用。方法 将48只成年雌性SD大鼠随机分为4组,假手术组（A组）、模型组（B组）、导电水凝胶组（C组）、TGTP水凝胶组（D组）,每组12只。A组仅行椎板切除术,B～D组均制备脊髓完全横断大鼠模型。分别于造模前及造模后1、3、7、14、28 d采用BBB评分评估各组大鼠后肢运动功能恢复情况。造模后28 d处死动物取材行劳克坚牢蓝（luxol fast blue,LFB）染色检测髓鞘再生情况;Nissl染色检测神经元存活情况;免疫组织化学染色评估炎症相关因子（NF-кB、TNF-α、IL-10）表达情况;免疫荧光染色和Western blot评估神经丝蛋白200(neurofilament 200,NF200)表达。结果 造模后各时间点A组BBB评分均优于其余3组（P<0.05）;14、28 d C、D组BBB评分差异无统计学意义（P>0.05）,但D组BBB评分明显优于B组（P<0.05）。LFB染色与Nissl染色示,A组神经元及髓鞘结构完整,D组髓鞘完整性与神经元存活数量...     

表达VEGF的重组腺相关病毒对大鼠创伤性脊髓损伤的保护作用及其机制研究

目的探讨表达VEGF的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)对大鼠创伤性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的保护作用及其机制。方法取144只成年雄性SD大鼠(体重200～250 g)随机分为4组,每组36只。假手术组(A组)仅手术暴露脊髓。模型对照组(B组)、rAAV-绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein,GFP)组(C组)、rAAV-hVEGF165-GFP组(D组)制备创伤性SCI大鼠模型,术后即刻分别予以20μL生理盐水、rAAV-GFP病毒、rAAV-hVEGF165-GFP病毒脊髓注射治疗。术后3、7 d采用BBB评分观察大鼠后肢运动功能变化;术后7 d通过脊髓组织尼氏小体染色观察脊髓组织病理学变化,脊髓组织神经元透射电镜检测及TUNEL凋亡细胞染色观察脊髓神经元凋亡,Western blot检测水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP-4)表达;术后1、3、5、7 d ELISA法检测VEGF165蛋白表达。结果 BBB评分显示术后3、7 d D组神经功能较B、C组显著改善(P<0.05)。尼氏小体染色显示术后7 d D组脊髓组织结构破坏明显轻于B、C组(P<0.05)。ELISA检测显示D组VEGF165蛋白表达呈低剂量缓释表达,术后3、5、7 d,D组VEGF165蛋白表达均高于其他3组(P<0.05)。透射电镜检测及TUNEL凋亡细胞染色结果显示术后7 d D组脊髓神经元凋亡较B、C组显著减少,凋亡率显著低于B、C组(P<0.05)。Western blot结果显示术后7 d D组脊髓组织AQP-4蛋白表达明显较B、C组减少(P<0.05)。结论表达VEGF的rAAV通过抗神经元凋亡及减轻脊髓水肿对大鼠创伤性SCI起保护作用。     

M2型小胶质细胞移植促进小鼠脊髓损伤修复的实验研究

目的 探讨M2型小胶质细胞（M2 microglia,M2-MG）移植促进小鼠脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）修复的效果。方法 取15只新生2～3 d C57BL/6乳鼠大脑皮质,通过胰蛋白酶消化法分离原代细胞并进行Iba1免疫荧光染色鉴定为MG后,以IL-4极化诱导培养48 h（实验组）,通过精氨酸酶1(Arginase 1,Arg-1)、Iba1免疫荧光染色鉴定其是否极化为M2-MG;以正常培养MG作为对照组。另取5只新生1周C57BL/6乳鼠背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）与M2-MG共培养5 d,观测轴突长度;以单纯DRG作为对照。取42只6周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为假手术组（n=6）、SCI组（n=18）及SCI+M2-MG组（n=18）。手术暴露脊柱T10节段后,假手术组仅切除椎板,SCI组及SCI+M2-MG组行SCI造模后,SCI+M2-MG组同时注射M2-MG。术后观测各组小鼠存活情况,并于术后当天（0）、3、7、14、21、28 d采用BMS(Basso Mouse Scale)评分评价小鼠运动功能恢复情...     

AMPA谷氨酸受体亚基-2在大鼠脊髓损伤急性期对少突胶质前体细胞凋亡的影响

目的:探讨AMPA谷氨酸受体亚基-2 (AMPA-GluR2)在大鼠脊髓损伤急性期对少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)凋亡的影响。方法:60只SD雌性大鼠随机分为假手术组(Sham组,n=15),脊髓损伤组(SCI组,n=15),AMPA受体拮抗剂NBQX组(n=15)和Ca2+通透性AMPA受体拮抗剂JSTx组(n=15)。SCI组、NBQX组和JSTx组应用Allen′s打击法建立大鼠脊髓(T9)损伤模型。采用BBB评分评估各组大鼠脊髓损伤后运动功能恢复情况。HE染色观察脊髓损伤后病理学改变。免疫组化和免疫蛋白印迹(Western blot)法检测AMPA-GluR2在各组大鼠脊髓组织中的表达情况。免疫荧光标记OPCs并应用TUNEL法检测其在各组中的凋亡情况。结果:SCI组BBB评分较假手术组降低(P0.05),脊髓损伤后3d NBQX组(3.60±0.65)和JSTx组(3.80±0.76)BBB评分较SCI组(1.50±0.35)高(P0.05),NBQX组和JSTx组之间无差异(P0.05)。HE染色结果显示SCI组和两个拮抗剂组的脊髓组织均存在损伤,脊髓组织腹侧和腹外侧白质病理学损伤评分显示NBQX组(1.60±0.42)与JSTx组(1.50±0.35)评分较SCI组(2.30±0.20)低(P0.05)。AMPA-GluR2免疫组化结果显示,脊髓损伤后3d SCI组阳性细胞数(6.15±0.52)较假手术组(13.25±0.21)明显减少(P0.05),NBQX组(2.10±0.42)和JSTx组(4.45±0.54)阳性细胞数较SCI组少(P0.05),NBQX组阳性细胞数最少,与JSTx组比较有显著性差异(P0.05)。Western blot结果显示,脊髓损伤后3d SCI组和两个拮抗剂组AMPA-GluR2表达水平均较假手术组(0.94±0.07)降低(P0.05),NBQX组(0.37±0.07)及JSTx组(0.54±0.12)较SCI组(0.69±0.03)低(P0.05),且NBQX组AMPA-GluR2表达水平最低(P0.05)。免疫荧光显示,脊髓损伤后3d各组大鼠脊髓组织均存在免疫荧光标记的OPCs;TUNEL法检测OPCs凋亡指数表明,NBQX组(0.21±0.02)和JSTx组(0.17±0.01)较SCI组(0.42±0.02)均降低(P0.05),且JSTx组较NBQX组降低(P0.05)。结论:大鼠脊髓损伤急性期OPCs凋亡与脊髓组织中AMPA-GluR2表达下降有关。     

血管生成素2与腹膜透析时腹膜血管新生的关系

目的 观察血管生成素2（Angpt-2）和腹膜透析（腹透）时腹膜血管新生的关系。 方法 5/6肾切除制作尿毒症大鼠模型,成模后在腹腔内植入腹透管,根据大鼠体质量每天经腹透管注入定量腹透液（4.25%,Dineal）。按腹透时间分为未腹透组、腹透10 d组、28 d组及56 d组。假手术非尿毒症非透析大鼠为对照组。大网膜抗CD31免疫组化染色后作血管计数,观察腹膜血管新生。用实时定量PCR和Western 印迹分别检测腹膜Angpt-2和血管内皮生长因子（VEGF）表达量变化,同时检测腹膜血管数和Angpt-2、VEGF表达量的关系。 结果 未腹透组、腹透10 d、28 d及56 d组腹膜血管数显著高于对照组[（5±3）、（10±5）、（17±5）及（19±4）比（1±1） 个/HP,均P < 0.05]。腹透28 d组腹膜血管数显著高于腹透10 d组（P < 0.05）,但与56 d组差异无统计学意义。未腹透组或腹透各组腹膜Angpt-2和VEGF表达显著高于对照组（均P < 0.01）,而Angpt-2和VEGF表达量并未随透析时间延长而增加。Angpt-2和VEGF表达量和腹膜血管数呈正相关（r = 0.7756,P < 0.01;r = 0.5223,P < 0.05）。 结论 尿毒症状态和腹透促进腹膜血管新生。腹膜Angpt-2表达增加和腹膜血管新生呈正相关。Angpt-2将可能成为治疗腹膜血管新生的另一靶点     

BMSCs移植对大鼠脊髓损伤后VEGF基因和血管生成的影响

目的研究BMSCs移植对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后运动功能恢复、VEGF基因表达和血管生成的影响,探讨BMSCs治疗SCI的机制。方法取5只4周龄Wistar雄性大鼠骨髓,分离培养BMSCs,取第3～4代细胞进行实验。取Wistar雌性成年大鼠87只,体重220～250 g,随机分为假手术组(A组,21只)、DMEM注射组(B组,33只)和BMSCs移植组(C组,33只)。A组仅咬除T8～10棘突和椎板;B、C组参照Nystrom方法制备T8～10 SCI模型,伤后30 min C组注射BMSCs(共3.0×105个),B组注射等量DMEM。于术后3、7、14、28 d采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分法评价大鼠后肢运动功能;术后3、7、14、28 d应用Ⅷ因子免疫组织化学染色行微血管计数观测血管生成情况;术后1、3、5 d应用RT-PCR法检测损伤脊髓组织内VEGF mRNA的表达。结果术后各时间点B、C组大鼠后肢功能随时间延长均有不同程度恢复,各时间点BBB评分与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。术后28 d,C组BBB评分显著高于B组(P<0.05),其余时间点B、C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后3 d,B、C组损伤周围区脊髓灰质腹侧角内微血管数目明显少于A组(P<0.05);术后7、14、28 d与A组比较差异无统计学意义(P>0.05)。C组术后3、7 d脊髓灰质腹侧角内微血管数目与B组比较差异无统计学意义(P>0.05);但术后14、28 d显著高于B组(P<0.05)。各组术后各时间点损伤周围区脊髓白质内的微血管数目比较差异均无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR检测示,A组大鼠脊髓组织内VEGF mRNA表达水平较低。B、C组与A组相比,于术后1 d开始VEGF mRNA表达增加,3 d时表达达峰值,5 d时表达下降但仍高于A组,各时间点与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05);C组各时间点均高于B组(P<0.05)。结论 BMSCs可能通过上调VEGF基因表达和增加脊髓内新生血管而促进大鼠SCI后运动功能恢复。     

辛伐他汀动员干细胞归巢对大鼠脊髓损伤的修复作用及其机制

目的:观察辛伐他汀动员骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)归巢至脊髓损伤部位对损伤脊髓的修复作用,并探讨其相关机制。方法:成年雌性SD大鼠30只,经尾静脉注射移植大鼠转绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因的BMSCs,24h后随机分为3组:假手术组,仅切除椎板,不损伤脊髓;对照组,脊髓损伤后经蛛网膜下腔注射载体;实验组,脊髓损伤后经蛛网膜下腔注射辛伐他汀。每组10只。对照组和实验组采用改良Allen法(40g.cm)制作T9~T10节段脊髓损伤模型,从L4水平蛛网膜下腔注射辛伐他汀(5mg/kg)或载体。术前及术后1d、3d、7d、14d、21d、28d时盲法进行BBB评分和斜板试验;术后28d处死大鼠,取相应节段脊髓组织行形态计量学观察脊髓空腔体积大小;应用神经元核抗原(NeuN)/神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)与GFP免疫荧光双染法观察移植GFP-BMSCs的迁移及细胞分化情况;Western blot检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)表达水平的变化。结果:术后各时间点假手术组动物BBB评分及斜板试验角度无明显变化,实验组及对照组BBB评分及斜板试验角度明显降低,术后7d、14d、21d、28d时实验组BBB评分高于对照组(P<0.05);术后14d、21d、28d时实验组大鼠的斜板试验角度高于对照组(P<0.05)。术后28d时假手术组脊髓内未见空腔,实验组和对照脊髓损伤部位均可见空洞形成,实验组空腔体积(0.29±0.08mm3)小于对照组(0.57±0.10mm3)(P<0.05);荧光显微镜下观察实验组在脊髓损伤周边可见大量表达绿色荧光的细胞,而对照组和假手术组很少。免疫荧光染色实验组NeuN(+)/GFAP(+)、GFP(+)/GFAP(+)细胞明显多于对照组和假手术组(P<0.05)。Western blot显示治疗组大鼠损伤处脊髓BDNF和VEGF表达高于对照组和假手术组(P<0.05)。结论:辛伐他汀可动员BMSCs归巢至脊髓损伤部位并参与损伤修复,其作用可能与其促进BDNF及VEGF高表达有关。     

靶向PIK3cb双位点shRNA干扰抑制血管移植术后再狭窄

目的 研究RNA干扰（RNAi）对大鼠血管平滑肌细胞磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）p110β亚单位（PIK3cb）基因表达的干扰效应。方法 雄性SD大鼠150只，均行白体颈外静脉-颈总动脉移植手术，随机数字分组法分为6组：空白对照组（25％空白Pluronic F-127）、shRNA-1组、shRNA-2组、1／2（shRNA-1＋shRNA-2）组、阴性对照组（无序质粒）和阳性对照组（渥曼青霉素），每组25只。3个转染组[shRNA-1组、shRNA-2组及1／2（shRNA-1＋shRNA-2）组]通过Pluronic F-127缓释系统将shRNA均匀喷涂于移植静脉周围。分别于术后1、3、7、14及28d各取5只大鼠取材，采用计算机图像分析法测量管腔内膜厚度及新生内膜面积，Western blot（术后3d）及免疫组化染色检测细胞增殖情况。结果 术后3、7、14及28d时，3个转染组血管内膜厚度均较空白对照组及阴性对照组明显减少（P〈0．05）；而新生内膜面积3个转染组（除shRNA-2组第3、7d）于术后1d起即开始明显减少（P〈0．05）。免疫组化染色结果示术后各时间点3个转染组PCNA阳性细胞面积百分比显著低于空白对照组及阴性对照组（P〈0．05）。Western blot检测结果示术后3d3个转染组PCNA蛋白表达明显低于空白对照组及阴性对照组（P〈0．05）。各时间点空白对照组与阴性对照组血管内膜增生情况及PCNA表达情况差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 shRNA真核表达载体转染入移植静脉后能有效抑制管壁平滑肌细胞增殖，是一种防治移植静脉狭窄的基因疗法。     

血管内皮生长因子对脊髓性肌萎缩症中运动神经元变性的作用

目的探究血管内皮生长因子(VEGF)对脊髓性肌萎缩症(SMA)中运动神经元变性的作用。方法采用SMA小鼠模型, 同窝杂合子为对照组, 检测小鼠出生后1、5、9 d脊髓腰椎1～2段运动神经元的数量, 通过转录组测序分析脊髓中基因变化, 采用实时定量聚合酶链反应法(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测脊髓组织中VEGF、Kdr等表达, 最后采用反义核苷酸药物治疗SMA小鼠, 运用qRT-PCR和Western blot检测VEGF基因和蛋白的表达水平。组间比较采用t检验和单因素方差分析。结果出生后5 d和9 d脊髓性肌萎缩症小鼠脊髓L1～L2段运动神经元数量(15.60±1.66、13.0±2.0)少于对照组(25.33±1.18、26.0±2.0), 差异有统计学意义(t=11.37、13.35, P<0.05)。转录组测序结果通过KEGG分析得到在脊髓性肌萎缩症组中, 与血管新生相关的240个基因发生显著变化。通过qRT-PCR验证显示VEGF其中一个与运动神经元死亡密切相关剪接本VEGF165表达(0.56 ±0.07)低于对照组(1.00±0.06)...     

预制微血管样结构凝胶的植入研究

目的 观察含有微血管样结构的凝胶块植入体内后与体内血液循环的连通情况，以及血管内皮细胞生长因子（vEGF165）对凝胶血管化的影响。方法 在纤维蛋白凝胶中以VEGF165诱导小鼠微血管内皮细胞（MVEC）形成微血管样结构，设无VEGF165为对照，将制作的凝胶块用有微孔的塑料薄膜包裹后植入小鼠肠系膜间，2周后取样进行组织学切片，苏木素-伊红（HE）染色和免疫组织化学染色，图像分析并测量血管化面积。结果 凝胶植入2周见实验组凝胶周围有丰富的新生血管网经过塑料薄膜的小孔与凝胶内血管相连，对照组表面新生血管较少。组织学切片（HE染色）见VEGF组血管化总面积约为对照的50倍（P〈0．01）。实验组新生血管直径10～100μm，分布于凝胶中心和周边部位；而对照组新生血管最大直径〈20μm，主要分布于凝胶的周边。结论 含微血管样结构的预制凝胶植入后能形成具有血流灌注的微血管网。纤维蛋白凝胶在此过程中充当了一种较为合适的细胞外基质的作用，而VEGF在这一过程中起到一种诱导、刺激和强化作用。     

Sonic Hedgehog信号通路在成年大鼠脊髓损伤后的表达

目的观察Sonic Hedgehog(Shh)信号通路成分在成年大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后是否表达,探讨Shh信号通路的表达规律及意义。方法取健康雄性SD大鼠64只,随机分为正常组(A组,8只)、假手术组(B组,8只)和SCI组(C组,48只)。A组大鼠不作任何处理;B组大鼠仅咬开T7~9椎板,不作损伤处理;C组大鼠采用改良Al len法制作大鼠SCI模型。取A、B组及C组术后12 h,1、3、7、14、21 d大鼠(n=8),采用BBB评分标准评估大鼠后肢运动恢复情况,免疫荧光染色、实时荧光定量PCR及Western blot法检测SCI区Shh、Gli-1(Glioma-associated oncogene homolog-1)m RNA和蛋白表达水平变化。结果 C组BBB评分随时间延长缓慢升高,但各时间点BBB评分均显著低于A、B组(P0.05)。免疫荧光染色示,C组SCI后可见Shh、Gli-1大量增生。实时荧光定量PCR和Western blot结果示,C组SCI后Shh、Gli-1 m RNA相对表达量和蛋白表达量均逐渐增高,7 d时达最大值,各时间点Shh、Gli-1 m RNA相对表达量和蛋白表达量均显著高于A、B组(P0.05)。相对于A组,C组SCI后Gli-1蛋白在细胞质中表达减少,细胞核中表达增加,呈现出"核转移"现象。结论 SCI后星形胶质细胞可分泌Shh、Gli-1信号分子,两者表达均显著上调并表现出规律的动态变化,提示Shh信号通路可能参与了SCI后神经细胞再生修复的调控。     

降钙素基因相关肽促进大鼠BMSCs迁移及VEGF的表达

目的观察外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)在大鼠BMSCs迁移中的作用及对VEGF、血管黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)表达的影响,探讨CGRP通过BMSCs促进血管生成的作用机制。方法全骨髓法分离、培养SD大鼠BMSCs,采用Western blot法于传代培养1、2、3周时检测BMSCs中CGRP受体(CGRP receptor,CGRPR)蛋白的表达。使用浓度为1×10-8 mol/L的CGRP作用于BMSCs作为实验组,单纯BMSCs作为对照组,在培养72 h时采用细胞趋化实验检测CGRP对BMSCs迁移的影响;在培养1、3、5、7 d采用实时荧光定量PCR检测CGRP作用后VCAM-1 mRNA的表达变化,采用免疫细胞化学染色、Western blot法检测CGRP作用后VEGF的表达变化。结果 Western blot检测示BMSCs稳定表达CGRPR,2周时表达最高。细胞趋化实验显示,实验组CGRP刺激后穿膜迁移细胞数(3.20±1.77)个/HP,较对照组(1.11±0.49)个/HP明显增多(t=4.230,P=0.001)。实时荧光定量PCR检测示,实验组VCAM-1 mRNA表达随时间延长逐渐增加,7 d时最高;实验组3、5、7 d的VCAM-1 mRNA表达量与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。免疫细胞化学染色示,培养1、3 d两组均无阳性染色;培养5、7 d实验组VEGF染色呈阳性,对照组无阳性染色。Western blot检测示,培养1、3 d两组均未检测到VEGF蛋白表达;培养5、7 d实验组VEGF蛋白表达量均明显高于对照组(P<0.05);实验组5 d的VEGF蛋白表达量明显高于7 d(P<0.05)。结论 CGRP能促进BMSCs迁移及VEGF表达,这可能是CGRP调节骨内部血流变化而影响骨代谢的机制之一。     

基于Notch/STAT3信号通路探讨bFGF对大鼠脊髓损伤的治疗机制

目的 探讨bFGF对脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）大鼠的治疗作用及Notch/STAT3信号通路的影响。方法 取10周龄雄性SD大鼠40只,采用自由落体打击法建立T10节段SCI模型,其中32只造模成功随机分为模型组、bFGF组,每组16只;另取16只SD大鼠仅暴露T10棘突、硬脊膜和脊髓,作为假手术组。造模后bFGF组腹腔注射100μg/kg bFGF(1次/d,共28 d),模型组和假手术组大鼠同法注射生理盐水。造模后观察各组大鼠存活情况,于造模前及造模后即刻、14 d、28 d行BBB评分评估后肢功能。造模后28 d取损伤部位脊髓组织,行HE、Nissl和碘化丙啶（propidium iodide,PI）染色,观察脊髓组织病理变化、神经元存活（尼氏体数量）和凋亡（PI红染细胞数量）情况;免疫组织化学染色和ELISA法分别检测组织中星形胶质细胞活化标志物[胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）]及炎症因子[IL-1β、TNF-α、干扰素γ(interferon γ,IFN-γ)]水平;Western b...     

M2型巨噬细胞/小胶质细胞来源线粒体移植治疗小鼠脊髓损伤的实验研究北大核心CSCD

目的 探讨M2型巨噬细胞/小胶质细胞来源线粒体移植治疗小鼠脊髓损伤的效果。方法 取小鼠小胶质细胞(BV2细胞)分别采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、IL-4诱导其向M1型(M1组)及M2型(M2组)极化,以未作任何干预的细胞作为对照(M0组);光镜下观察细胞形态,免疫荧光染色[精氨酸酶1(Arginase 1,Arg-1)]及流式细胞术[诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、Arg-1]鉴定极化后细胞类型,并通过MitoSox Red与DCFH-DA染色评估细胞线粒体功能。使用差速离心法提取M2组BV2细胞来源线粒体,Western blot法测量氧化磷酸酶链(oxidative phosphorylation,OXPHOS)内各相关复合物(复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ与Ⅴ)的表达水平,并与M2型BV2细胞比较,以评估是否获得所需线粒体。取36只雌性C57BL/6小鼠随机分为3组(n=12),其中假手术组仅切除T_(10)椎板,脊髓损伤组及线粒体移植组制备T_(10)脊髓损伤模型后,于损伤节段分别注射线粒体储存液及M2型BV2细胞来源线粒体(100μg)。术后采用BMS(Basso Mouse Scale)评分评价小鼠后肢运动功能,取材行免疫荧光染色(iNOS)、LEA-FITC染色及ELISA检测(VEGFA)。结果 极化诱导后,M1组及M2组BV2细胞分别呈现M1型及M2型巨噬细胞特异性形态改变;免疫荧光染色示M2组的M2型巨噬细胞标志物Arg-1染色阳性表达高于M0组及M1组(P<0.05);流式细胞术检测示M1组的M1型巨噬细胞标志物iNOS表达高于M0组及M2组(P<0.05),M2组Arg-1表达高于M0及M1组(P<0.05)。MitoSox Red及DCFH-DA染色示M2组荧光强度均低于M1组(P<0.05),与M0组差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot法鉴定成功提取M2型BV2细胞来源线粒体。动物实验示,线粒体移植组术后21、28 d BMS评分高于脊髓损伤组(P<0.05);术后14 d损伤局部iNOS阳性细胞数低于脊髓损伤组(P<0.05),但仍高于假手术组(P<0.05);LEA阳性细胞较其余两组增多;VEGFA表达亦高于其余两组(P<0.05)。结论 M2型巨噬细胞/小胶质细胞来源线粒体可通过促进损伤局部血管新生并抑制炎症性M1型巨噬细胞极化,促进小鼠脊髓损伤修复。     

新型大鼠脊髓打击器的制备及建模大鼠的功能与病理评价

[目的]制备一种简便、实用的急性大鼠脊髓损伤建模装置。[方法]用木板、新泡沫板、吸管、手术缝线及金属插销杆等制作新型大鼠脊髓打击器。取36只成年雌性SD大鼠,体质量为220~250 g,随机等分为假手术组(Sham组)、轻度打击组(SCI1组)和重度打击组(SCI2组),利用自制大鼠脊髓打击器建立大鼠脊髓损伤模型,SCI1组采用10 g×25 mm打击规格进行垂直打击损伤,SCI2组采用10 g×50 mm打击规格进行垂直打击损伤。各组大鼠于术前1 d,术后1、3、7、14、21和28 d进行BBB运动学评分,观察大鼠后肢运动功能情况,术后28 d对各组大鼠受损脊髓组织进行HE染色、神经元核抗原(Neu N)免疫组化检测。[结果]Sham组各观察时间点的BBB评分均为21分,各SCI组术后1 d时BBB评分为0分,之后BBB评分结果随时间延长呈逐步恢复趋势,从3 d开始,SCI1组的BBB评分高于SCI2组(P<0.05)。各组大鼠后肢左右侧活动情况无明显差异,实验过程中无大鼠死亡。术后28 d HE染色、Neu N免疫组化结果显示SCI2组脊髓受损程度明显重于SCI1组(P<0.05)。[结论]该新型大鼠脊髓打击器制作简便、可行性高,建立的SCI模型具有稳定性高、可重复性强、损伤程度可调节等特点,适合相关科研人员使用。     

17β-雌二醇对大鼠脊髓损伤后神经保护作用的研究

目的：探讨17β-雌二醇（E2）对大鼠脊髓损伤（SCI）后的神经保护作用及其机制。方法：应用改良的Allen′s重物打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型,将大鼠随机分为两组：A组（PBS对照组）和B组（E2治疗组）,每组42只,B组造模成功后15min及24h腹腔注射E2（4.0mg/kg,以PBS溶解）,A组在相同时间给予等量无菌PBS。分别于伤后7d、14d、21d及28d,应用改良Tarlov评分法和Rivlin斜板试验评价大鼠脊髓神经功能恢复情况。于伤后6h、24h、3d、7d、14d及28d时处死动物,以损伤部位为中心取材,HE染色观察脊髓组织病理变化,TUNEL法染色检测细胞凋亡,免疫组化染色检测caspase-3、Bcl-2的表达情况。结果：从伤后14d起,B组Tarlov评分和斜板试验角度与A组相比差异有显著性（P〈0.01）。TUNEL法检测表明,大鼠SCI后存在细胞凋亡,3d时达高峰,与caspase-3的表达基本一致,B组伤后24h、3d及7d时凋亡细胞比率显著低于A组（P〈0.01或P〈0.05）。免疫组化结果显示B组伤后24h、3d、7d、14d及28d时caspase-3表达低于A组（P〈0.01或P〈0.05）,而Bcl-2表达高于A组（P〈0.01或P〈0.05）。结论：E2能促进大鼠SCI后的神经功能恢复,具有一定的神经保护作用;E2可能是通过减少SCI后继发性细胞凋亡的机制发挥作用的。     

甘草甜素抑制高迁移率族蛋白B1对大鼠脊髓损伤后胶质瘢痕形成的作用及机制研究

目的探讨甘草甜素(glycyrrhizin,GL)抑制高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后胶质瘢痕形成的作用及潜在机制。方法将72只雌性SD大鼠随机分为假手术组(n=12)、SCI模型组(SCI组,n=36)、GL干预组(SCI+GL组,n=12)及NF-κB抑制剂1-吡咯烷二硫代羧酸铵盐(pynolidine dithiocarbamate,PDTC)干预组(SCI+PDTC组,n=12)。SCI组、SCI+GL组及SCI+PDTC组应用改良Allen’s法制备大鼠SCI模型,假手术组仅手术暴露脊髓。首先,对术后1、2、3周SCI组行BBB评分和斜坡实验,Western blot检测胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及HMGB1蛋白表达,并与假手术组进行比较,以选择胶质瘢痕形成最显著时间点的脊髓组织进行后续实验。然后,通过行为学观测(后肢BBB评分及斜坡实验),组织学观察脊髓组织结构,Western blot检测HMGB1、GFAP、NF-κB蛋白表达,以及免疫组织化学染色观测GFAP、硫酸软骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycan,CSPG)蛋白表达,探讨GL对大鼠SCI后胶质瘢痕形成的作用及机制。结果术后SCI组大鼠后肢BBB评分及斜坡角度随时间延长而逐渐增大,但各时间点均明显低于假手术组(P0.05);Western blot检测显示SCI组术后1、2、3周HMGB1及GFAP蛋白相对表达量均明显高于假手术组(P0.05);其中SCI组3周变化最明显,选择该时间点脊髓组织进行后续实验。术后3周,与SCI组相比,SCI+GL组大鼠BBB评分及斜坡角度均明显增大(P0.05);Western blot检测HMGB1、GFAP、NF-κB蛋白相对表达量以及免疫组织化学染色检测GFAP、CSPG蛋白表达均明显下调(P0.05);HE染色显示脊髓组织结构紊乱改善、炎症细胞浸润及胶质瘢痕形成均减少。术后3周,SCI+PDTC组NF-κB、GFAP、CSPG蛋白表达与SCI组相比均明显减少(P0.05);与SCI+GL组相比NF-κB蛋白表达下调更显著,GFAP、CSPG蛋白表达升高(P0.05)。结论 SCI后应用GL抑制HMGB1的表达,可以降低损伤脊髓中GFAP以及CSPG的表达,从而减少胶质瘢痕的形成,促进大鼠后肢运动功能恢复。GL可能通过HMGB1/NF-κB途径发挥抑制胶质瘢痕形成作用。     

胞浆泛素蛋白连接酶2在大鼠脊髓损伤后星形胶质细胞中的表达及意义

目的研究胞浆泛素蛋白连接酶2(Kip1 ubiquitylation-promoting complex 2,KPC2)在大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)过程中的蛋白表达及细胞定位情况,探讨其在SCI修复过程中的生物学功能。方法将成年SD大鼠随机分为2组,对照组7只仅行单纯T9椎板全切除术,实验组49只采用改良Allen法制作T9节段脊髓撞击损伤模型,实验组于伤后6、12 h及1、3、5、7、14 d分别取7只大鼠进行以下检测。采用Western blot检测p27kip1、KPC2、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和细胞周期蛋白A(Cyclin A)在SCI前后的蛋白表达变化,免疫组织化学染色观察KPC2在SCI后的大体定位及表达,免疫荧光双标记染色观察KPC2在SCI过程中与神经元特异性核蛋白(neuronal nuclei,Neu N)、神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和PCNA的共定位情况。细胞水平采用体外培养星形胶质细胞增殖模型,Western blot检测KPC2、P27kip1、PCNA表达;免疫共沉淀分析KPC2、KPC1和p27kip1之间在细胞增殖过程中的相互作用。结果 Western blot结果示SCI后3 d,p27kip1显著下调,伴随KPC2、Cyclin A、PCNA表达明显增加。免疫组织化学染色示KPC2阳性信号广泛分布,包括脊髓灰质和白质,实验组KPC2阳性细胞数显著高于对照组(t=10.982,P=0.000)。免疫荧光双标记染色示在脊髓灰质,对照组和实验组KPC2与Neu N双标记阳性细胞数分别为(0.43±0.53)、(0.57±0.53)个/视野,比较差异无统计学意义(t=0.548,P=0.604);在脊髓白质,对照组和实验组KPC2与GFAP双标记阳性细胞数分别为(3.86±0.90)、(0.71±0.49)个/视野,差异有统计学意义(t=7.778,P=0.000);对照组和实验组KPC2与PCNA标记的星形胶质细胞共定位明显,阳性细胞数分别为(0.57±0.53)、(5.57±1.13)个/视野,差异有统计学意义(t=8.101,P=0.000)。体外培养并模拟星形胶质细胞增殖,提取细胞蛋白行Western blot示PCNA和KPC2蛋白表达在血清刺激增殖后即开始增加,24 h达峰值,而p27kip1表达则逐渐减少。免疫共沉淀示KPC2可沉淀p27kip1、KPC1,p27kip1也可沉淀KPC2、KPC1,且在刺激后相互作用明显增加。结论 SCI后KPC2参与介导的p27kip1表达下调,KPC2与SCI后星形胶质细胞的增殖相关。     

人胶质源性神经生长因子真核表达载体构建及在大鼠脊髓组织中的表达

目的探索人胶质源性神经生长因子（human glial derived neurotrophic factor,hGDNF）真核表达载体,体内直接转染SD大鼠脊髓组织治疗急性脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）的可能性。方法基因重组和限制性内切酶酶切构建真核表达载体pcDNA3-hGDNF,经脂质体DOTAP介导质粒转染SD大鼠脊髓组织,作为实验组;对照组大鼠直接注射空载体脂质体混合物。14d后取材,RT-PCR及Western blot检测hGDNF mRNA及蛋白表达。结果重组真核表达载体pcDNA3-hGDNF经限制性内切酶Hind III和Xba-酶切后,电泳显示400bp hGDNF目的片段和5400bp pcDNA3载体片段。转染大鼠脊髓组织后14d,RT-PCR检测出目的基因mRNA,Western blot检测出hGDNF的蛋白表达。结论构建的真核表达载体pcDNA3-hGDNF能在转染的大鼠脊髓组织中表达,可为基因治疗修复急性SCI奠定基础。 14 胚胎干细胞移植修复脊髓损伤的实验研究 目的观察胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）诱导的神经前体细胞移植,对小鼠脊髓损伤神经功能恢复的影响。方法取由上海市发育生物学重点实验室提供的ES进行细胞培养和体外诱导,收集ES衍生细胞。并进行RT-PCR检测。将50只C57/BL6J小鼠制备为T9、10脊髓半横断模型,将存活的28只小鼠随机分为三组。假手术组（A组）：9只,未作任何处理;手术/细胞组（B组）：10只,于距损伤区域以远约1cm的椎管内注射2~3μl制备的ES衍生细胞,总细胞数为9×105个;手术/DMEM组（C组）：9只,按B组方法注射2~3μl DMEM。术后1、2、4、6和8周采用BBB后肢功能评分观察小鼠神经功能恢复情况,取损伤脊髓进行X-gal染色和免疫组织化学染色观察。结果ES经体外诱导培养,呈圆形或椭圆形小集落生长,有1个或多个核仁。RT-PCR检测,ES细胞诱导后表达巢蛋白及微管相关蛋白,但未表达胶质纤维酸性蛋白。小鼠实验,BBB后肢功能评分显示术后各时间点A组与B、C组比较,差异均有统计学意义（P〈0.01）。B组与C组比较,1、2和4周时,差异有统计学意义（P〈0.01）;6、8周时,组间差异无统计学意义（P〉0.05）。X-gal染色观察,B组呈阳性染色,A、C组均为阴性。免疫组织化学染色观察,B组在损伤脊髓部位,表达兔抗神经微丝蛋白,未表达胶质纤维酸性蛋白。结论将ES培养诱导分化为神经前体细胞移植后,能够存活、迁移,并分化为神经元,但未明显改善神经功能。     

慢病毒介导的脑红蛋白体内基因转染对兔损伤脊髓的作用

【摘要】　目的：观察慢病毒介导脑红蛋白（Ngb）体内基因转染兔损伤的脊髓组织后对后肢运动功能的影响,探讨其作用机制。方法：用球囊压迫法制成兔脊髓损伤（ＳＣＩ）模型96只,随机分为对照组（A组）、生理盐水组（B组）、空载体组（C组）和Ngb慢病毒组（D组）,每组动物24只,A组SCI后无治疗;B组SCI后向脊髓内注射生理盐水;C组SCI后向脊髓内注射空病毒;D组SCI后向脊髓内注射Ngb重组慢病毒。各组分别在1、3、7、14、21d采用BBB运动功能评分系统检测兔后肢运动功能情况;观察损伤脊髓组织内标记荧光的表达;Real-time PCR和Western blot检测Ngb mRNA及其相应蛋白的表达情况,生化方法检测丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）水平。结果：损伤后14d和21d,D组BBB评分明显高于其他3组（P<0.05）,但A、B及C组之间比较无差异（P＞0.05）;C组和D组兔损伤部位脊髓组织均有GFP表达的绿色荧光信号;损伤后7d、14d和21d,D组的Ngb表达与其他3组比较明显增强（P<0.05）;损伤后7d、14d和21d,D组损伤脊髓组织中MDA、NO含量明显低于其他3组（P<0.05）。结论：慢病毒介导脑红蛋白（Ngb）体内基因转染可使Ngb高表达,可能是通过减轻继发性SCI,从而促进SCI后后肢运动功能的恢复。