肝细胞生长因子激活剂的抑制剂-1基因对宫颈癌细胞自噬及凋亡调控的影响

目的探讨肝细胞生长因子激活剂的抑制剂-1(hepatocyte growth factor activator inhibitor-1, HAI-1)基因对宫颈癌细胞自噬及凋亡调控的机制。方法对数生长期HeLa细胞分为转染组和对照组,转染组转染HAI-1质粒,对照组细胞正常培养。采用实时荧光定量PCR法检测2组细胞HAI-1 mRNA表达情况,采用AO染色和流式细胞术检测2组细胞自噬情况,采用ELISA检测2组细胞自噬相关因子LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白水平,应用流式细胞仪检测2组细胞凋亡率,采用Western blot法检测细胞Bax和Bcl-2蛋白相对表达量。结果转染组细胞HAI-1 mRNA相对表达量(1.57±0.26)、AO细胞荧光强度(52.14±3.88)、LC3-Ⅱ蛋白[(3.42±0.85)μg/L]、Beclin-1蛋白[(14.69±1.96)μg/L]水平、细胞凋亡率[(86.75±6.42)%]、Bax蛋白相对表达量(1.24±0.13)和Bax/Bcl-2(7.75±0.83)高于对照组[0.48±0.09、5.47±0.32、(1.10±0.22)μg/L、(10.12±0.53)μg/L、(12.64±1.33)%、0.25±0.06、0.17±0.05)](P0.05),LC3-Ⅰ蛋白水平[(0.59±0.11)μg/L]、Bcl-2蛋白相对表达量(0.16±0.04)低于对照组[(3.26±0.82)μg/L、1.47±0.15](P0.05)。结论 HAI-1转染通过增加HeLa细胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达,降低LC3-Ⅰ蛋白表达,提高Bax/Bcl-2来调节宫颈癌细胞的自噬和凋亡。     

白藜芦醇对肾细胞癌ACHN细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨白藜芦醇对肾细胞癌ACHN细胞增殖及凋亡的影响及可能机制。方法对数生长期ACHN细胞随机分为对照组(100μmol/L培养液)、25μmol/L白藜芦醇组(100μmol/L培养液+25μmol/L白藜芦醇)、50μmol/L白藜芦醇组(100μmol/L培养液+50μmol/L白藜芦醇)、100μmol/L白藜芦醇组(100μmol/L培养液+100μmol/L白藜芦醇)、200μmol/L白藜芦醇组(100μmol/L培养液+200μmol/L白藜芦醇)。培养12、24、48 h,采用CCK-8法检测细胞增殖活力;培养24 h,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用荧光探针法检测ACHN细胞氧化型二氯荧光素(dichlorofluorecin, DCF)荧光强度,采用Western blot法检测B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphom-2, Bcl-2)、caspase-3蛋白表达。结果对照组及25、50、100、200μmol/L白藜芦醇组培养12 h(0.71±0.01、0.63±0.01、0.56±0.03、0.48±0.02、0.39±0.02)、24 h(1.19±0.04、1.00±0.02、0.79±0.03、0.63±0.03、0.41±0.06)、48 h(1.62±0.02、1.15±0.03、0.79±0.04、0.62±0.04、0.41±0.08)细胞增殖活力吸光度值依次降低(P0.05),培养24 h细胞凋亡率[(7.73±0.87)%、(12.64±1.13)%、(29.43±1.25)%、(37.73±1.24)%、(48.56±1.78)%]依次升高(P0.05);培养24 h,对照组及25、50、100、200μmol/L白藜芦醇组细胞DCF荧光强度[(5.40±0.70)、(14.97±1.33)、(17.03±0.80)、(19.67±1.16)、(31.50±2.28)u/(s·mg)]及caspase-3相对表达量(0.24±0.02、0.58±0.02、1.19±0.05、1.41±0.05、1.74±0.06)依次升高,Bcl-2相对表达量(1.67±0.10、1.11±0.16、0.94±0.11、0.67±0.09、0.53±0.02)依次降低(P0.05)。结论白藜芦醇可诱导肾细胞癌ACHN细胞内活性氧累积,上调caspase-3表达,下调Bcl-2表达,进而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,且呈剂量依赖性。     

别欧前胡内酯对HL-60细胞凋亡的影响

目的探讨别欧前胡内酯对人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞凋亡的影响及可能的机制。方法对数生长期人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞随机分为对照组和4、16、32、64、128mg/L别欧前胡内酯组。别欧前胡内酯作用24h,应用透射电子显微镜观察HL-60细胞形态学改变,MTT法检测别欧前胡内酯对HL-60细胞增殖的影响,根据细胞生长抑制率计算别欧前胡内酯对HL-60细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50),流式细胞仪检测HL-60细胞凋亡率及线粒体膜电位改变。结果别欧前胡内酯作用24h,对照组HL-60细胞表面光滑,形态正常,大小均匀;64、128mg/L别欧前胡内酯组HL-60细胞数目明显减少,且体积变小,呈凋亡形态改变;MTT检测结果显示,别欧前胡内酯对HL-60细胞增殖具有明显的抑制作用,IC50值为(75±13)mg/L;流式细胞仪检测结果显示,对照组HL-60细胞凋亡率为(11.6±5.2)%,4、16、32、64、128 mg/L别欧前胡内酯组HL-60细胞凋亡率分别为(17.2±6.1)%、(24.2±8.6)%、(36.1±4.5)%、(46.0±7.3)%和(69.9±10.2)%,随别欧前胡内酯浓度增加,HL-60细胞凋亡率逐渐增高,线粒体膜电位逐渐降低(P0.05)。结论别欧前胡内酯可明显促进人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞凋亡,其机制可能与改变HL-60细胞线粒体膜电位有关。     

碳酸酐酶Ⅸ抑制剂对乳腺癌细胞在低氧环境下的生长抑制作用及其机制

目的探讨碳酸酐酶Ⅸ(carbonic anhydraseⅨ, CAⅨ)抑制剂对人乳腺癌MCF-7细胞在低氧环境中的增殖抑制作用和机制。方法人乳腺癌MCF-7细胞培养24 h后,采用实时定量PCR法检测细胞在1%低氧和21%正常氧气环境下CAⅨmRNA相对表达量;将对数生长期人乳腺癌MCF-7细胞分为25、50、100μmol/L U-104组(分别加入含25、50、100μmol/L U-104的细胞培养液进行处理)和对照组(加入等量细胞培养液),低氧环境下培养48 h后,采用MTT法检测各组人乳腺癌MCF-7细胞的存活率,采用AnnexinV/PI双染流式细胞术检测对照组和100μmol/L U-104组细胞凋亡率;培养24 h后,采用Western blot法检测对照组和50、100μmol/L U-104组凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白相对表达量。结果培养24 h后,MCF-7细胞1%低氧环境中CAⅨmRNA相对表达量(23.93±4.02)高于21%正常氧环境(1.00±0.00)(P0.05);培养48 h后,对照组及25、50、100μmol/L U-104组细胞存活率[100%、(57.30±5.06)%、(28.84±3.52)%、(9.63±2.58)%]依次降低(P0.05),100μmol/L U-104组细胞凋亡率[(89.46±3.05)%]高于对照组[(6.54±0.92)%](P0.05);培养24 h后,对照组及50、100μmol/L U-104组细胞Bcl-2蛋白相对表达量(0.576±0.040、0.253±0.030、0.103±0.020)依次降低(P0.05),Bax蛋白(0.103±0.020、0.216±0.020、0.413±0.030)和caspase-3蛋白(0.216±0.020、0.373±0.010、0.540±0.020)相对表达量依次增高(P0.05)。结论 CAⅨ抑制剂U-104在低氧条件下对乳腺癌MCF-7细胞有明显增殖抑制作用,其机制可能是U-104抑制了CAⅨ在低氧状态下的活性,激活Bax、caspase-3和抑制Bcl-2,从而诱导乳腺癌细胞的凋亡。     

雷帕霉素对人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡及Bax、Bcl-2表达的影响

目的探讨雷帕霉素对人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡及Bax、Bcl-2表达的影响。方法体外培养人HL-60细胞,并将不同浓度(10 nmol/L、20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L、160 nmol/L)雷帕霉素(溶于DMSO)作用于HL-60细胞,另设空白对照组和相同体积的DMSO组。然后应用CCK8技术检测各组细胞增殖抑制率,应用荧光显微镜和Td T酶介导的末端缺失原位标记法观察其凋亡情况,应用QPCR、Western blot等方法观察48 h不同组别Bax、Bcl-2基因和蛋白表达情况。结果 CCK-8检测结果显示,不同浓度雷帕霉素处理组细胞生长抑制率明显大于对照组和DMSO组(P0.05),而且随着浓度的增加,其抑制率也明显增高。随着雷帕霉素浓度的增加,HL-60凋亡细胞逐渐增多,细胞凋亡率分别为(8.4±1.3)%、(14.7±1.9)%、(28.5±2.7)%、(51.6±5.4)%、(52.7±4.8)%,与对照组相比差异均有统计学意义(P0.01)。QPCR和Western blot结果显示,和对照组相比,随着雷帕霉素浓度的增加Bax mRNA和蛋白表达水平逐渐增高,且均远大于对照组(P0.01);然而Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平却随着雷帕霉素浓度的增加逐渐降低,且均远小于对照组(P0.01)。结论雷帕霉素可以明显抑制HL-60细胞生长,并可能通过促进Bax表达,抑制Bcl-2生成来诱导HL-60细胞凋亡,且上述作用呈剂量依赖性。     

薯蓣皂苷元对三阴乳腺癌细胞系HCC1937增殖及凋亡的影响

目的探讨薯蓣皂苷元对人三阴乳腺癌细胞系HCC1937增殖及凋亡的影响。方法对数生长期人三阴乳腺癌HCC1937细胞株分为空白组(培养液)、实验1组(培养液+10mg/L薯蓣皂苷元)、实验2组(培养液+25mg/L薯蓣皂苷元)。采用MTT法观察薯蓣皂苷元培养24、48、72h时HCC1937细胞生长抑制率;流式细胞仪检测薯蓣皂苷元培养48h时HCC1937细胞周期及细胞凋亡;Western blot法检测薯蓣皂苷元培养48h时Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)、P53、caspase3蛋白表达;Transwell实验观察薯蓣皂苷元培养24h时HCC1937细胞侵袭能力。结果薯蓣皂苷元培养24、48、72h,HCC1937细胞生长抑制率在实验1组分别为(6.86±2.56)%、(15.57±1.86)%、(14.84±4.64)%,在实验2组分别为(11.78±2.16)%、(24.48±3.70)%、(31.38±3.76)%,均高于空白组[(3.34±2.56)%、(8.47±1.86)%、(7.73±4.64)%](P0.05),且实验2组高于实验1组(P0.05);薯蓣皂苷元培养48h,实验1组G_1期细胞比例、细胞凋亡率分别为(36.21±3.12)%、(21.99±2.36)%,实验2组分别为(50.26±2.36)%、(26.17±3.46)%,均高于空白组[(28.35±2.54)%、(17.25±1.23)%](P0.05),实验2组高于实验1组(P0.05);薯蓣皂苷元培养24h,实验1组、实验2组HCC1937侵袭细胞数目[(64.00±11.01)%、(30.33±6.11)%]低于空白组[(146.00±9.16)%](P0.05),实验2组低于实验1组(P0.05);薯蓣皂苷元培养48h时,实验1组、实验2组HCC1937细胞Bcl-2表达量低于空白组,Bax、caspase3表达量高于空白组(P0.05),实验1组Bcl-2表达量低于实验2组,Bax、caspase3表达量高于实验2组(P0.05),3组P53蛋白表达量比较差异无统计学意义(P0.05)。结论薯蓣皂苷元可抑制人三阴乳腺癌细胞系HCC1937增殖与侵袭,可能机制为使肿瘤细胞G_1期阻滞,下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达,上调促凋亡蛋白Bax、caspase3表达。     

川芎嗪对氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡反应的影响

目的研究川芎嗪对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的体外动脉粥样硬化(AS)样损伤内皮细胞抗凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax表达的影响,为川芎嗪临床应用提供新的理论及实验依据。方法 ox-LDL(50 mg/L,12 h)诱导体外培养的人冠状动脉内皮细胞,加入川芎嗪(1和10μmol/L),Western blot检测川芎嗪对Bcl-2及Bax蛋白表达的影响。结果 ox-LDL可抑制AS样损伤细胞模型Bcl-2蛋白的表达(与正常对照组比较,ox-LDL模型组Bcl-2与β-actin的相对光密度比值显著降低:0.33±0.08 vs.0.58±0.09,P<0.01),增加Bax蛋白的表达(ox-LDL模型组vs.正常对照组:0.67±0.10 vs.0.21±0.05,P<0.01);川芎嗪则可有效逆转上述病理改变[川芎嗪(1和10μmol/L)显著增加Bcl-2蛋白的表达:0.55±0.06,0.61±0.10,P<0.01;显著降低Bax蛋白表达:0.15±0.09,0.18±0.06,P<0.01]。结论川芎嗪靶向内皮细胞,抑制ox-LDL诱导的AS早期内皮细胞的凋亡反应,从而有效干预AS早期泡...     

miR-802对叉头框转录因子M1抑制A549/DDP细胞顺铂耐药性的靶向调控作用

目的探讨miR-802抑制非小细胞肺癌A549/DDP细胞的顺铂耐药性及其对叉头框转录因子M1(forkhead box protein M1, FoxM1)的靶向调控作用。方法 A549、A549/DDP细胞采用反转录PCR法检测miR-802相对表达量。将A549/DDP细胞分为空白转染组和miR-802过表达组(过表达组),分别转染miR-NC和miR-802类似物(miR-802 mimics),转染24、48、72、96 h后,采用反转录PCR法检测2组细胞miR-802相对表达量,并采用CCK-8法检测2组细胞增殖率;转染48 h后,CCK-8法检测转染后A549/DDP细胞对DDP的敏感性,采用流式细胞仪检测2组细胞凋亡率和细胞周期,采用Western blot法检测转染后A549/DDP细胞内FoxM1蛋白相对表达量。结果 A549/DDP细胞miR-802相对表达量(0.21±0.03)低于A549细胞(0.85±0.12)(P<0.05);转染24、48、72、96 h,过表达组细胞miR-802相对表达量依次增高(P<0.05),且均高于空白转染组(P<0.05);转染48、72、96 h,空白转染组细胞增殖率依次增高(P<0.05),且均高于过表达组(P<0.05);转染48 h,过表达组细胞半数抑制浓度[(35.28±2.17)mg/L]和细胞早期凋亡率[(17.2±1.1)%]均高于空白转染组[(14.22±1.28)mg/L、(9.0±0.8)%](P<0.05),S期和G2/M期细胞比率[(21.30±0.20)%、(8.35±0.33)%]及细胞内FoxM1蛋白相对表达量(0.21±0.04)均低于空白转染组[(27.54±0.52)%、(14.67±0.70)%、0.44±0.06](P<0.05)。结论 miR-802可能通过抑制FoxM1表达而降低非小细胞肺癌A549/DDP细胞的顺铂耐药性。     

人参皂甙Rg3对糖尿病肾病大鼠肾组织Bax和B淋巴细胞瘤-2蛋白表达及肾细胞凋亡的影响

目的探讨糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)大鼠应用人参皂甙Rg3处理后肾组织Bax、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白表达变化及肾细胞凋亡情况。方法120只雄性SD大鼠,随机分为模型组、治疗组和对照组各40只。模型组、治疗组腹腔注射质量分数2%链尿佐菌素溶液制备DN模型,对照组腹腔注射等量生理盐水。造模成功后,治疗组将0.5 mg/kg人参皂甙Rg3与生理盐水混合溶液灌胃,模型组、对照组大鼠给予等量生理盐水灌胃,均1次/d,连续28 d。疗程结束后大鼠麻醉处死,取肾组织行病理检查,采用TUNEL法检测肾组织细胞凋亡,Western blot法检测肾组织Bax、Bcl-2蛋白相对表达量,实时荧光定量PCR法检测肾组织Bax mRNA、Bcl-2 mRNA相对表达量。结果对照组大鼠肾组织系膜结构、肾小管均正常,小管膜完整光滑,间质未增生;模型组大鼠肾组织系膜结构异常,间质严重增生,肾小管萎缩严重,小管膜粗糙;与模型组比较,治疗组大鼠肾组织系膜细胞增生减轻,肾小管萎缩减少,纤维组织减少;模型组、治疗组、对照组大鼠肾细胞凋亡率[(0.91±0.23)%、(0.56±0.14)%、(0.21±0.03)%]依次降低(P<0.05);模型组、治疗组、对照组肾组织Bax蛋白相对表达量(1.79±0.31、2.73±0.24、3.26±0.12)、Bcl-2蛋白相对表达量(1.42±0.12、2.59±0.25、4.40±0.31)、Bax mRNA相对表达量(0.35±0.02、1.45±0.91、3.12±1.17)、Bcl-2 mRNA相对表达量(1.34±0.87、1.73±0.67、3.91±0.75)依次增高(P<0.05)。结论人参皂甙Rg3对DN大鼠有显著治疗作用,可明显改善大鼠肾组织形态,降低肾细胞凋亡率,上调Bax、Bcl-2表达。     

navitoclax联合阿糖胞苷在HEL细胞凋亡中的作用

目的探讨navitoclax(NTX)联合阿糖胞苷(cytarabine, Ara-C)对HEL细胞凋亡的影响及可能机制。方法取对数生长期HEL细胞,随机分为NTX组、Ara-C组和联合组,分别应用不同浓度NTX、Ara-C、NTX+Ara-C处理72 h,采用CCK-8法测定细胞活率,计算50%细胞抑制时的药物浓度(half maximal inhibitory concentration, IC_(50)),依据IC_(50)进行后续试验。分别取NTX组、Ara-C组和联合组处理24、48 h时细胞,采用流式细胞术检测早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率;采用实时荧光定量PCR法检测Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, BAX)mRNA、Bcl-2同源拮抗剂(Bcl-2 homologous antagonist/killer, BAK)mRNA、Bcl-2细胞凋亡相互作用介质(Bcl-2 interacting mediator of cell death, BIM)mRNA相对表达量,并进行比较。结果联合组应用NTX 10 nmol/L+Ara-C 20 nmol/L、NTX 100 nmol/L+Ara-C 200 nmol/L处理72 h细胞活率[(35.27±4.04)%、(13.58±1.33)%]低于NTX组应用NTX 10 nmol/L、100 nmol/L[(103.44±9.26)%、(65.56±3.37)%]、Ara-C组应用Ara-C 20 nmol/L、200 nmol/L处理72 h[(53.46±5.42)%、(20.92±1.74)%](P0.05);联合组应用NTX 1 000 nmol/L+Ara-C 2 000 nmol/L、NTX 10 000 nmol/L+Ara-C 20 000 nmol/L处理72 h细胞活率[(11.92±0.94)%、(8.86±1.26)%]低于Ara-C组应用Ara-C 2 000 nmol/L、20 000 nmol/L处理72 h[(19.43±0.43)%、(13.46±0.70)%](P0.05);处理24 h,联合组、NTX组、Ara-C组细胞早期凋亡率[(39.40±0.80)%、(19.50±1.13)%、(7.23±0.73)%]、总凋亡率[(50.01±0.65)%、(28.01±0.56)%、(10.20±0.71)%]依次降低(P0.05),联合组、NTX组晚期凋亡率[(10.61±1.45)%、(8.51±0.85)%]高于Ara-C组[(2.97±0.09)%](P0.05),联合组与NTX组比较差异无统计学意义(P0.05);处理48 h,联合组、NTX组、Ara-C组细胞早期凋亡率[(67.13±9.11)%、(15.03±0.87)%、(4.50±0.07)%]、晚期凋亡率[(15.70±1.33)%、(3.66±0.49)%、(2.22±0.31)%]、总凋亡率[(82.83±10.31)%、(18.70±1.28)%、(6.72±0.37)%]依次降低(P0.05);联合组处理24 h BAK mRNA相对表达量(1.27±0.45)高于NTX组(0.68±0.14)(P0.05),处理48 h BAK mRNA相对表达量(3.66±0.27)高于NTX组(0.90±0.04)、Ara-C组(1.06±0.41)(P0.05);处理24、48 h,联合组、NTX组、Ara-C组BAX mRNA相对表达量(24 h:1.34±0.41、1.14±0.18、0.96±0.28;48 h:1.09±0.48、0.93±0.14、1.04±0.26)、BIM mRNA相对表达量(24 h:0.89±0.07、1.06±0.20、1.04±0.22;48 h:1.19±0.30、0.87±0.08、1.14±0.15)比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 NTX联合Ara-C能明显诱导HEL细胞凋亡,其机制与上调前凋亡蛋白BAK表达有关。     

银杏达莫注射液对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用机制研究

目的探讨银杏达莫注射液(Gin)对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用机制。 方法选取36只Wistar实验大鼠，按随机数字表法分为正常组(N组)、肝缺血再灌注模型组(M组)和银杏达莫注射液干预组(T组)，每组12只，M组、T组采用夹闭肝固有动脉1 h再灌注1 h的方法模拟大鼠肝缺血再灌注模型。T组造模前1周开始每日按3.6 ml/kg腹腔注射Gin，N、M组造模前1周开始每日注射同量生理盐水。采用苏木精-伊红(HE)染色检测肝组织细胞形态，Masson染色和天狼星红染色检测肝组织胶原纤维；免疫印迹(Western blot)检测肝组织B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)，Bcl-相关X蛋白(Bax)、Smad和蛋白激酶B(Akt)的蛋白表达水平；聚合酶链式反应(PCR)检测肝组织中Bax、Bcl-2、Smad和Akt mRNA表达水平；免疫组织化学检测肝组织中Bax、Bcl-2、白介素6(IL-6)和IL-10的表达情况，以及检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平。 结果HE染色显示，M组肝组织细胞损伤严重且炎症细胞多、细胞水肿明显；Masson和天狼星红染色表明，M组胶原纤维沉积较N组明显；3种染色结果均显示，T组肝组织炎性浸润、胶原纤维沉积程度均较M组轻。Western blot结果发现，以β-actin为内参，M组Bax、Bcl-2蛋白相对表达量(0.91±0.28，0.68±0.24)高于N组(0.22±0.19，0.23±0.12)(均P<0.01)，T组Bax蛋白相对表达量(0.48±0.11)低于M组(P<0.01)，Bcl-2蛋白相对表达量(0.89±0.25)高于M组(P<0.01)；以GAPDH为内参，M组Akt、Smad蛋白相对表达量(0.72±0.34，1.03±0.13)高于N组(0.17±0.09，0.57±0.26)(均P<0.01)，T组Akt蛋白相对表达量(1.47±0.89)高于M组(P<0.01)，Smad蛋白相对表达量(0.62±0.42)低于M组(P<0.01)。PCR结果显示，M组Bax、Bcl-2、Akt和Smad mRNA表达水平(0.76±0.03，0.55±0.06，0.96±0.09，1.58±0.16)均高于N组(0.29±0.04，0.36±0.05，0.64±0.06，0.53±0.14)(均P<0.01)，T组Bax和Smad mRNA表达水平(0.36±0.04，1.05±0.26)低于M组(均P<0.01)，Bcl-2和Akt mRNA表达水平(0.85±0.04，1.46±0.19)高于M组(均P<0.01)。免疫组织化学结果显示，M组Bax、Bcl-2、IL-6、IL-10阳性表达面积[(39.52±0.78)%，(4.62±0.94)%，(38.04±3.11)%，(6.48±1.14)%]均高于N组[(0.99±0.13)%，(0.96±0.12)%，(0.46±0.06)%，(0.47±0.17)%](均P<0.01)；T组Bax、IL-6阳性表达面积[(8.18±1.22)%，(6.05±0.92)%]低于M组(均P<0.01)，Bcl-2、IL-10阳性表达面积[(48.13±2.65)%，(31.91±4.86)%]高于M组(均P<0.01)。与N组SOD、MDA水平[(274.81±10.42)U/ml，(2.25±0.51)nmol/ml]相比，M组SOD水平[(113.24±8.52)U/ml]下降，MDA水平[(5.19±0.99)nmol/ml]升高(均P<0.01)。T组SOD水平[(221.51±6.25)U/ml]高于M组(P<0.01)，MDA水平[(3.91±0.86)nmol/ml]低于M组(P<0.01)。 结论银杏达莫注射液预处理可能通过PI3K/Akt和TGF-β/Smad信号通路介导的抑制细胞凋亡和纤维化发挥对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用。     

催乳素对葡萄球菌肠毒素A诱导T细胞凋亡的影响

目的:观察作为重要细胞因子的催乳素在T细胞活化诱导凋亡过程中的作用。方法:实验于2005-03/2006-06在校级实验室新乡医学院免疫学实验室完成。实验材料:正常人外周血由新乡医学院第一附属医院提供,葡萄球菌肠毒素A(sigma)。实验方法:①T细胞活化诱导凋亡模型的建立:取健康人外周血5mL,加入等体积淋巴细胞分离液,采用密度梯度离心法获得淋巴细胞。完全1640培养基重悬细胞,加入葡萄球菌肠毒素A(SEA),置于37℃、体积分数为0.05的CO2培养,至第4天,800r/min离心10min,以新鲜完全1640培养基换液,尽可能除去SEA。培养液中加入人白细胞介素2继续培养2周待用。②催乳素干预:将获得细胞离心并弃去培养液,用新鲜完全1640培养基重悬,调整细胞密度为5×109L-1,加入24孔板中,分别加入4mg/LSEA诱导细胞凋亡,同时加入20,300,1000μg/L催乳素,以不加催乳素的为对照组。③实验评估:于培养0,16,24h时采用MTT法检测T细胞增殖情况。培养16h时用流式技术检测细胞凋亡情况,并通过琼脂糖凝胶电泳检测T细胞凋亡DNA,并采用流式细胞术检测T细胞膜表面Fas和FasL,WesternBlot法检测T细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax。结果:①MTT法检测T细胞增殖:不同质量浓度催乳素干预组在16,24h的T细胞数量较对照组明显增多[吸光度值:对照组:0.65±0.02,0.54±0.04;20μg/L催乳素组:0.81±0.04,0.71±0.11;300μg/L催乳素组:1.14±0.10,1.22±0.10;1000μg/L催乳素组:1.12±0.12,1.22±0.12,P<0.01]。0～24h内300,1000μg/L催乳素组T细胞数量呈上升趋势(P<0.01),20μg/L催乳素组T细胞数量呈下降趋势(P<0.01)。②流式细胞术检测T细胞凋亡率:培养16h时,与对照组比较,各质量浓度催乳素干预组T细胞凋亡率降低[(46.80±9.21)%,(31.40±7.03)%,(17.50±4.29)%,(10.20±3.84)%,P<0.05]。③流式细胞术检测T细胞膜表面Fas、FasL:与对照组比较,各质量浓度催乳素干预组Fas和FasL细胞阳性率均下降[Fas:(88.0±17.3)%,(43.0±13.1)%,(22.0±6.7)%,(25.0±8.2)%,P<0.01;FasL:(46.0±17.5)%,(33.0±11.4)%,(31.0±14.0)%,(28.0±13.8)%,P<0.05]。④WesternBlot检测T细胞Bcl-2、Bax:与对照组比较,20μg/L催乳素组Bax和Bcl-2表达均无明显差异(P>0.05),300μg/L,1000μg/L催乳素组Bax表达明显降低(P<0.05),Bcl-2表达明显升高(P<0.05)。结论:在葡萄球菌肠毒素A诱导的T细胞活化诱导凋亡过程中,催乳素以细胞因子的身份,可通过抑制Fas、FasL和Bax表达,提高Bcl-2表达,来抑制T细胞凋亡,维持T细胞增殖。     

沉默HCCR-2基因对胰腺癌细胞Bcl-2和Bax表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的利用反义寡核苷酸(ASODN)干扰技术探讨人宫颈癌癌基因-2(HCCR-2)对人胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制。方法经脂质体介导将HCCR-2ASODN转染人胰腺癌细胞株PANC-1,荧光显微镜观察细胞内荧光信号,流式细胞仪检测细胞转染效率及凋亡率;噻唑盐(MTT)比色法检测转染细胞的增殖活性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测转染细胞HCCR-2、Bcl-2、Bax mRNA与蛋白表达。结果 HCCR-2ASODN转染PANC-1细胞的转染效率为85.04%。反义组、无义组和单加培养液组细胞凋亡率分别为(24.04±2.38)%、(2.44±0.13)%、(2.54±0.21)%,反义组较其他组细胞凋亡显著增加(P<0.01);相应的各组细胞增殖活性分别为2.38±1.03、3.78±1.69、3.72±1.54,反义组细胞增殖较其他组显著被抑制(P<0.01)。反义组、无义组和单加培养液组细胞HCCR-2mRNA表达量分别为0.29±0.16、0.55±0.31、0.57±0.33;Bcl-2mRNA表达量分别为0.31±0.14、0.63±0.28、0.62±0.35;BaxmRNA表达量分别为0.68±0.36、0.24±0.09、0.23±0.12;HCCR-2蛋白表达量分别为0.47±0.28、0.93±0.48、0.95±0.42;Bcl-2蛋白表达量分别为0.35±0.19、0.82±0.51、0.81±0.45;Bax蛋白表达量分别为0.91±0.42、0.42±0.21、0.39±0.20,较其他组,反义组细胞HCCR-2、Bcl-2mRNA及蛋白表达量显著降低(P<0.01),而Bax mRNA及蛋白表达量显著增加(P<0.01)。结论下调PANC-1细胞HCCR-2表达后,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡增加,其作用机制与Bcl-2表达降低而Bax表达升高有关。     

葛根总黄酮体外诱导Kasumi-1细胞凋亡及其分子机制

目的 探讨葛根总黄酮(puerariae radix flavones,PRF)对人急性髓系白血病细胞系Kasumi-1细胞凋亡的影响,并对其可能的分子机制进行初步研究.方法 以不同浓度PRF作用Kasumi-1细胞48 h,瑞氏染色及Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡变化,FITC-Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率,实时定量PCR技术检测AMLl -ETO融合基因表达,Western blot法检测Bcl-2、Bim及Caspase相关酶的变化.结果 PRF能有效诱导Kasumi-1细胞凋亡.以50、200及500 μg/ml的PRF分别处理细胞,其早期凋亡率依次为(14.1±0.8)％、(17.7±1.3)％及(32.4±1.4)％,较空白对照组[(7.8±0.7)％]明显增加(P＜0.05),作用呈浓度依赖性;抗凋亡蛋白Bcl-2相对表达量依次为0.85±0.05、0.62±0.07及0.43±0.05,呈下调趋势(P＜0.01);而促凋亡蛋白Bim相对表达量分别为0.21±0.06、0.39±0.04及0.75 +0.05,Caspase-3蛋白相对表达量分别为0.92±0.04、1.21±0.07及1.33±0.04,Caspase-9蛋白相对表达量分别为0.35±0.05、0.53±0.03及0.69±0.07,均呈上调趋势(P＜0.01).Caspase-8蛋白表达量及AML1 -ETO融合基因表达量则无明显改变.结论 一定浓度PRF诱导Kasumi-1细胞凋亡可能与下调细胞Bcl-2、上调Bim及活化Caspase相关酶有关,与AML1 -ETO融合基因无明显相关性.     

人脐带间充质干细胞对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响及可能机制

目的探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响及可能作用机制。方法取传代培养至第5代的hUC-MSCs细胞,应用显微镜下观察细胞形态,采用流式细胞术检测细胞表面标志物。取细胞数分别为0个/mL(对照组)、1×10~6个/mL(低剂量组)、2×10~6个/mL(中剂量组)、4×10~6个/mL(高剂量组)第5代hUC-MSCs细胞悬液0.5 mL,接种于Transwell小室膜上,应用Transwell小室与对数生长期SKOV3细胞共培养60 h,采用CCK-8法检测SKOV3细胞增殖相对抑制率,采用流式细胞术检测SKOV3细胞凋亡率,采用实时荧光定量PCR法检测SKOV3细胞PI3K mRNA、Akt mRNA、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2) mRNA、caspase-3 mRNA相对表达量。结果显微镜下第5代hUC-MSCs呈贴壁长梭状细胞,单核,大小较均一,呈漩涡状、放射状或平行排列,仍可保持原代hUC-MSCs细胞典型形态;流式细胞仪检测结果显示,第5代hUC-MSCs细胞表面CD44、CD29表达率分别为(98.406 7±0.133 2)%、(98.393 3±0.366 9)%,CD34、CD45表达率分别为(0.013 3±0.005 8)%、(0.006 7±0.005 8)%。第5代hUC-MSCs细胞与SKOV3细胞共培养60 h,低剂量组、中剂量组、高剂量组SKOV3细胞凋亡率[(40.63±0.74)%、(45.53±0.67)%、(56.53±0.57)%]、细胞增殖相对抑制率[(23.96±1.55)%、(40.35±1.34)%、(46.25±2.41)%]和caspase-3 mRNA相对表达量(1.46±0.02、1.91±0.04、2.37±0.01)依次增高(P均0.05),且均高于对照组[(31.60±0.53)%、0、1](P0.05)。低剂量组、中剂量组、高剂量组PI3K mRNA(0.60±0.02、0.46±0.02、0.34±0.04)、Akt mRNA(0.85±0.04、0.66±0.03、0.46±0.05)、Bcl-2 mRNA(0.85±0.04、0.69±0.04、0.39±0.03)相对表达量依次降低(P均0.05),且均低于对照组(1、1、1)(P0.05)。结论 hUC-MSCs细胞与SKOV3细胞共培养可促进SKOV3细胞凋亡,且hUC-MSCs细胞数越多促凋亡作用越强,其机制可能与下调Bcl-2、上调caspase-3表达,抑制PI3K/Akt信号通路有关。     

自噬对肾小管细胞毒性损伤后线粒体功能的影响及相关机制研究

目的研究自噬对肾小管细胞毒性损伤后线粒体功能的影响及相关机制。方法将人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)分为杂化siRNA组(对照无关序列片段siRNA转染细胞)、杂化siRNA+顺铂组(对照无关序列片段siRNA转染细胞+10μmol/L顺铂溶液)、沉默Pink1+顺铂组(Pink1沉默转染细胞+10μmol/L顺铂溶液)和沉默Parkin+顺铂组(Parkin沉默转染细胞+10μmol/L顺铂溶液)。培养12 h后,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法测定各组细胞存活率,JC-1法检测线粒体膜电位,荧光法检测各组细胞内三磷酸腺苷(ATP)的含量,Western blotting和免疫荧光探针检测自噬相关蛋白的相对表达。结果杂化siRNA+顺铂组的细胞存活率为(88.2±2.7)%,显著低于杂化siRNA组[(101.3±3.1)%](P<0.05);沉默Pink1+顺铂组和沉默Parkin+顺铂组的存活率为(80.1±2.3)%、(79.4±3.0%),显著低于杂化siRNA+顺铂组(P<0.05)。杂化siRNA+顺铂组的线粒体膜电位和ATP含量为(0.90±0.01)、(0.82±0.01)nmol/mg,显著低于杂化siRNA组[(1.01±0.02)、(1.00±0.04)nmol/mg](P<0.05);沉默Pink1+顺铂组和沉默Parkin+顺铂组的线粒体膜电位(0.79±0.02、0.77±0.02)和ATP[(0.66±0.05)、(0.66±0.02)nmol/mg]含量显著低于杂化siRNA+顺铂组(P<0.05)。杂化siRNA+顺铂组的Pink1、Parkin、Beclin蛋白的相对表达量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值(1.68±0.04、1.80±0.05、1.87±0.05、2.01±0.04)显著高于杂化siRNA组(1.00±0.04、1.00±0.05、1.01±0.01、1.04±0.02)(P<0.05);而沉默Pink1+顺铂组和沉默Parkin+顺铂组的Pink1、Parkin、Beclin蛋白的相对表达量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值(1.17±0.05、0.69±0.05、1.37±0.05、1.43±0.02;1.22±0.04、0.57±0.06、1.39±0.03、1.38±0.10)显著低于杂化siRNA+顺铂组(P<0.05)。杂化siRNA+顺铂组的自噬阳性点数为(12.2±0.7)个,显著多于杂化siRNA组[(2.4±0.3)个](P<0.05);而沉默Pink1+顺铂组和沉默Parkin+顺铂组的荧光点数[(5.3±0.8)、(5.6±0.5)个]显著少于杂化siRNA+顺铂组(P<0.05)。结论顺铂处理可诱导HK-2细胞的线粒体自噬作用,从而改善顺铂引起的肾小管细胞毒性损伤和线粒体功能,其作用机制可能与Pink1/Parkin蛋白的表达情况有关。     

整合素连接激酶抑制剂对人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的探讨整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)抑制剂在人近端肾小管上皮细胞转分化中的作用及可能机制。方法对数生长期人近端肾小管上皮细胞(HK-2)随机分为对照组(无糖DMEM/F12培养液)、高糖组(30.0mmol/L葡萄糖DMEM/F12培养液)、抑制剂组(30.0 mmol/L葡萄糖DMEM/F12培养液+30.0μmol/L QLT0267 100μL),培养48h后,倒置相差显微镜下观察细胞形态,Western blot法检测HK-2细胞ILK、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(phosphorylated Akt,P-Akt)相对表达量,反转录PCR法检测ILK mRNA、纤连蛋白(fibronectin,Fn)mRNA表达量。结果对照组HK-2细胞呈椭圆形或圆形,细胞间连接紧密,呈岛屿状生长;高糖组细胞向长梭型转变,细胞间紧密连接消失,呈离散状生长;抑制剂组细胞改变同高糖组,但程度较轻;高糖组、抑制剂组HK-2细胞E-cadherin相对表达量(0.43±0.04、0.80±0.05)均低于对照组(1.04±0.05)(P0.05),且高糖组低于抑制剂组(P0.05);高糖组、抑制剂组P-Akt相对表达量(0.49±0.05、0.31±0.03)均高于对照组(0.21±0.01)(P0.05);且高糖组高于抑制剂组(P0.05),高糖组、抑制剂组HK-2细胞ILK相对表达量(0.52±0.02、0.51±0.02)均高于对照组(0.22±0.01)(P0.05),高糖组与抑制剂组比较差异无统计学意义(P0.05);高糖组、抑制剂组及对照组HK-2细胞Akt相对表达量(0.91±0.03、0.92±0.02、0.94±0.05)比较差异均无统计学意义(P0.05);高糖组、抑制剂组HK-2细胞ILK mRNA(1.83±0.23、1.64±0.07)、Fn mRNA相对表达量(2.06±0.07、1.79±0.06)均高于对照组(0.83±0.04、1.14±0.08)(P0.05),且高糖组Fn mRNA相对表达量高于抑制剂组(P0.05),ILK mRNA相对表达量与抑制剂组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论ILK抑制剂QLT0267可抑制ILK下游效应分子Akt的磷酸化,减少Fn、E-cadherin下调,从而抑制或延缓肾小管上皮细胞转分化进程。     

转化生长因子-β_1对人牙周膜干细胞生物学行为的影响

目的探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)增殖和迁移能力的影响及作用机制。方法对数生长期人PDLSCs随机分为TGF-β1组(培养液+10μg/L TGF-β1)和对照组(培养液),采用CCK-8法检测2组培养第1、2、3、4、5、6、7天细胞增殖能力;培养48h,采用Transwell小室法检测2组细胞迁移能力,Western blot法检测2组Notch1胞内段(Notch1intracellular domain,NICD)蛋白相对表达量。结果 TGF-β1组培养第1天细胞吸光度值(0.45±0.02)与对照组(0.45±0.03)比较差异无统计学意义(P0.05),培养第2、3、4、5、6、7天细胞吸光度值(0.81±0.08、1.82±0.07、2.14±0.09、2.49±0.11、2.69±0.12、2.78±0.08)均高于对照组(0.61±0.04、1.17±0.05、1.47±0.10、1.99±0.11、2.20±0.03、2.29±0.08)(P0.05);培养48h,TGF-β1组迁移细胞数目[(61.40±2.30)%]较对照组[(31.80±1.48)%]多,NICD蛋白相对表达量(0.49±0.01)较对照组(0.35±0.01)高(P0.05)。结论 TGF-β1可激活Notch1信号通路,促进人PDLSCs增殖和迁移。     

鸦胆子油乳对戈舍瑞林去势抵抗性前列腺癌PC3细胞株化疗敏感性的影响

目的探讨质量分数10%鸦胆子油乳(Brucea javanica oil emulsion, BJOE)对戈舍瑞林去势抵抗性前列腺癌PC3细胞株化疗敏感性的影响及机制。方法对数生长期戈舍瑞林去势抵抗性前列腺癌PC3细胞株分为空白组、BJOE组、多西他赛组、多西他赛+BJOE组,细胞培养液中分别加入磷酸盐缓冲液、质量分数10%BJOE、0.6μg/L多西他赛、质量分数10%BJOE+0.6μg/L多西他赛进行干预。培养24、48、72 h时,采用MTT法检测4组细胞增殖抑制率;培养48 h时,采用流式细胞术检测4组细胞凋亡率,采用Hoechst 33258染色观察细胞形态学变化,采用实时荧光定量PCR法检测4组细胞B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、caspase-3 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测4组细胞Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白相对表达量。结果培养24、48、72 h时,多西他赛+BJOE组、多西他赛组、BJOE组细胞增殖抑制率依次降低(P0.05),3组细胞增殖抑制率均随时间延长而增高(P0.05);培养48 h时,空白组细胞核圆形或椭圆形,细胞质分布均匀;BJOE组、多西他赛组、多西他赛+BJOE组部分细胞呈不规则状态,染色质固缩、体积缩小,部分出现蓝色凋亡小体,其中多西他赛+BJOE组凋亡现象最明显;培养48 h时,多西他赛+BJOE组、多西他赛组、BJOE组、空白组细胞凋亡率[(28.71±3.15)%、(18.85±2.03)%、(14.62±1.57)%、(9.10±1.02)%]依次降低(P0.05),Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量依次增高(P0.05),Bax、caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量依次降低(P0.05)。结论质量分数10%BJOE与多西他赛联用可抑制戈舍瑞林去势抵抗性前列腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,增强细胞对多西他赛化疗敏感性,可能与下调Bcl-2 mRNA和蛋白表达,上调Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达有关。     

miR-577对胶质瘤细胞上皮-间质转化的调控作用及机制

目的探讨miR-577调控胶质瘤细胞上皮-间质转化活性的机制。方法将人源性胶质瘤细胞U87细胞分为miR-577类似物组、miR-577抑制物组和空白对照组,分别转染miR-577 mimic、miR-577 inhibitor和miR577-NC。转染24 h后,采用划痕实验检测各组细胞迁移距离,采用Transwell小室实验检测各组细胞侵袭细胞数,采用反转录PCR法检测各组细胞β-catenin mRNA表达水平,采用Western blot法检测各组细胞vimentin、E-cadherin蛋白相对表达量。结果 miR-577抑制物组、空白对照组、miR-577类似物组细胞迁移距离[(3.44±0.55)、(2.13±0.21)、(1.04±0.14)mm]、侵袭细胞数[(128.50±8.11)、(84.60±4.20)、(39.80±6.01)个]、细胞β-catenin mRNA相对表达量(0.80±0.06、0.61±0.04、0.45±0.06)和vimentin蛋白相对表达量(0.82±0.06、0.67±0.08、0.31±0.02)均依次降低(P0.05),E-cadherin蛋白相对表达量(0.44±0.04、0.76±0.05、0.89±0.08)依次增高(P0.05)。结论 miR-577可能作为抑癌基因,通过阻断Wnt/β-catenin信号通路的活性,降低人源性胶质瘤U87细胞上皮-间质转化活性,从而抑制肿瘤发展。