雷帕霉素对急性髓系白血病细胞系HL-60和HL-60/VCR生长的抑制作用

为了探讨mTOR抑制剂雷帕霉素对急性髓系白血病（acute myeloid leukemia;AML）细胞的增殖和药物敏感性的影响。以AML细胞株HL-60和多药耐药HL-60/VCR细胞系为研究对象,采用MTT法测定生长曲线和流式细胞术检测细胞周期;Western blot检测P糖蛋白（P-glycoprotein,Pgp）的表达。结果显示：与空白对照组细胞比较,雷帕霉素能抑制HL-60和HL-60/VCR细胞生长增殖（p〈0.05）,且随着浓度升高,增殖抑制率逐渐增高,24-72小时的细胞增殖抑制率随着时间的延长而有所增高（p〈0.05）,同时可阻滞细胞从G1期到S期的细胞周期转换。雷帕霉素抑制HL-60/VCR细胞的Pgp蛋白的表达。与柔红霉素单独应用相比,雷帕霉素50nmol/L、100nmol/L与柔红霉素联合应用使HL-60和HL-60/VCR细胞增殖抑制率明显增高（p〈0.05）,尤其是当先加雷帕霉素,而24小时后再加柔红霉素时。结论：mTOR抑制剂雷帕霉素对HL-60和多药耐药的HL-60/VCR细胞的生长均有抑制作用,除伴G0/G1期阻滞外,还增加细胞对柔红霉素的敏感性,这为临床难治性AML治疗提供新的治疗手段。     

雷帕霉素诱导HL-60细胞自噬及UCH-L3的表达

目的:探讨雷帕霉素能否诱导人早幼粒细胞白血病细胞株(human promyelocytic leukemia cells,HL-60)发生自噬及在此过程中泛素羧基末端水解酶L3(ubiquitin C-terminal Hydrolase L3,UCHL3)的表达变化。方法:应用CCK-8法检测不同浓度雷帕霉素处理HL-60细胞后的生长抑制率。2μmol/L雷帕霉素作用HL-60细胞不同时间后,在荧光显微镜下观察HL-60细胞的形态变化;应用透射电镜观察自噬小体的发生情况,real-time PCR检测自噬标志性基因LC3-Ⅱ和UCHL-3的mRNA表达变化,Western blot检测UCH-L3的蛋白表达变化。结果:不同浓度雷帕霉素对HL-60细胞增殖均有抑制作用,与对照组相比,差异均有统计学意义(P0.05)。在荧光显微镜下,对照组细胞内荧光强度低,雷帕霉素组细胞荧光强度随着处理时间延长也相应增强。2μmol/L雷帕霉素处理细胞12和24 h后,在透射电镜下可见对照组内自噬小体数量少,而在处理组细胞内自噬小体数量增多,且形态典型特异;与对照组相比LC3-Ⅱ mRNA表达量增加,而UCH-L3的mRNA和蛋白表达量均下降(P0.05)。结论:雷帕霉素能诱导HL-60细胞发生自噬性死亡。UCH-L3可能在调控白血病细胞自噬性死亡中发挥作用。     

抗肿瘤药物雷帕霉素调控子宫内膜癌细胞增殖、分化、凋亡的研究机制

目的雷帕霉素对子宫内膜癌细胞增殖、分化、凋亡的影响及机制。方法 5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L、160 nmol/L的雷帕霉素作用于子宫内膜癌HEC-1B细胞24 h、48 h、72 h后,CCK8检测细胞增殖,计算IC50;36 nmol/L的雷帕霉素作用于HEC-1B细胞0 d、1 d、3 d、5 d、7 d后,RT-PCR检测细胞中ALP的mRNA表达;36 nmol/L的雷帕霉素作用于HEC-1B细胞48 h,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测Cleaved caspase3、m TOR、p-p70S6K蛋白表达。结果随着时间及浓度的增加,10 nmol/L、20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L、160 nmol/L的雷帕霉素组细胞存活率均显著低于对照组(P0.01),根据IC50值选择36 nmol/L的雷帕霉素作为后续研究对象;ALP在1 d、3 d、5 d、7 d的mRNA表达均显著高于对照组(P0.01);与对照组比较,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达均显著升高,m TOR、p-p70S6K蛋白表达显著下调(P0.01)。结论雷帕霉素能显著抑制子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖,诱导细胞分化及促进细胞凋亡,其机制与抑制m TOR/p70S6K信号通路有关。     

别欧前胡素诱导急性髓系HL-60细胞凋亡机制研究

目的探讨别欧前胡素诱导急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的机制。方法对数生长期HL-60细胞随机分为对照组(普通培养液)、10mg/L别欧前胡素组(10mg/L别欧前胡素+培养液)、30mg/L别欧前胡素组(30mg/L别欧前胡素+培养液)、50mg/L别欧前胡素组(50mg/L别欧前胡素+培养液),培养48h时行锥虫蓝染色检测4组HL-60细胞增殖抑制率,应用流式细胞仪检测细胞周期,采用实时荧光定量PCR法检测B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)mRNA相对表达量,采用Western blot法检测Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-8蛋白相对表达量。结果培养48h,对照组及10、30、50mg/L别欧前胡素组细胞增殖抑制率[(1.53±0.18)%、(15.20±0.10)%、(32.80±0.10)%、(72.20±0.06)%]逐渐增加(P0.05);对照组及10、30、50mg/L别欧前胡素组G1期细胞比率[(40.26±3.80)%、(41.91±5.60)%、(48.79±9.70)%、(60.42±6.30)%]逐渐增加(P0.05),S期细胞比率[(34.38±7.20)%、(33.89±8.60)%、(27.86±5.30)%、(23.42±6.70)%]、G2/M期细胞比率[(21.36±7.80)%、(20.23±5.80)%、(19.35±6.90)%、(16.16±9.80)%]逐渐降低(P0.05);对照组及10、30、50mg/L别欧前胡素组Bcl-2mRNA相对表达量(1.00±0.06、0.82±0.03、0.53±0.02、0.24±0.01)、Bcl-2蛋白相对表达量(1.13±0.04、1.09±0.10、0.85±0.04、0.55±0.10)逐渐降低(P0.05),Bax mRNA相对表达量(1.00±0.08、1.20±0.07、1.45±0.03、1.64±0.04)、Bax蛋白相对表达量(0.88±0.11、1.07±0.06、1.11±0.02、1.29±0.04)、cleaved-caspase-8蛋白相对表达量(1.23±0.05、1.32±0.04、1.56±0.06、1.93±0.06)逐渐增加(P0.05)。结论别欧前胡素可抑制急性髓系白血病HL-60细胞增殖,阻滞细胞于G1期,通过外源性和内源性途径诱导HL-60细胞凋亡,且呈剂量依赖性。     

雷帕霉素抑制mTOR活性阻抑ALK阳性淋巴瘤细胞株生长的研究

目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路与间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性淋巴瘤的关系.方法 采用Western blot法分析雷帕霉素作用于Karpas299、BaF3/NPM-ALK及BaF3细胞前后,mTOR相关蛋白表达的改变;MTT法检雷帕霉素对细胞增殖的影响;Annexin V/PI染色法检测雷帕霉素对细胞凋亡的影响;PI染色法检测细胞周期改变.结果 ALK+ Karpos299、BaF3/NPM-ALK和BaF3细胞均高表达mTOR信号通路磷酸化蛋白、磷酸化p70S6K(p-pTOS6K)及4E-BP1(p-4E-BP1)蛋白.去除IL-3 1 h的BaF3细胞p70S6K及4E-BP1蛋白去磷酸化.10 nmol/L雷帕霉素作用48 h,p-p70S6K及p-4E-BP1蛋白表达下降,以p-p70S6K蛋白表达下降为主.相对于对照组各细胞株的抑制率为Karpas299细胞24.4%、BaF3/NPM-ALK细胞37.8%和BaF3细胞61.6%.Karpas299细胞在10 nmol/L雷帕霉素作用后细胞凋亡率从(11.97±0.11)%增至(15.87±0.62)%(P<0.05);BaF3细胞凋亡率由(3.23±0.11)%增至(7.67±0.49)%(P<0.05);BaF3/NPM-ALK细胞凋亡率从(1.90±0.47)%增至(2.80±0.27)%(P>0.05),无诱导调亡作用.三株细胞在10 nmol/L雷帕霉素作用48 h后,G1期细胞比率均有不同程度的增加,以BaF3/NPM-ALK细胞最为显著,从(37.63±1.91)%增加至(69.77±5.44)%;其次为Karpas299细胞,从(31.13±2.51)%增至(40.70±1.47)%;BaF3细胞最少,由(53.57±2.22)%增至(63.70±1.20)%(P值均<0.05).结论 NPM-ALK融合蛋白激酶激活了mTOR信号通路;雷帕霉素通过抑制mTOR活性,使细胞周期停滞于G1期,从而抑制ALK+淋巴细胞肿瘤性生长.     

雷帕霉素通过EZH2/Hedgehog信号通路诱导慢性髓系白血病细胞凋亡

目的:探讨雷帕霉素诱导慢性髓系白血病(CML)细胞凋亡的机制。方法:对CML细胞K562用雷帕霉素10(A组)、15(B组)和20(C组) nmol/L分别处理24 h,对照组不加雷帕霉素。采用MTT法检测雷帕霉素对K562细胞增殖的影响, AnnexinV-FITC/PI双染法检测雷帕霉素对K562细胞凋亡的影响, RT-PCR检测雷帕霉素对K562细胞EZH2/Hedgehog信号通路基因表达水平,Western blot检测雷帕霉素对K562细胞凋亡及相关信号通路蛋白表达水平。结果:MTT法检测发现,不同浓度雷帕霉素对细胞增殖有明显抑制作用,其中C组的细胞存活率37.6%±3.4%,显著低于其它各组(P0.05)。通过AnnexinV-FITC/PI双染法检测发现,C组细胞的凋亡率为93.1%±8.1%,显著高于其它各组(P0.05)。Western blot检测发现,K562细胞在雷帕霉素作用后,C组的Caspase-3和BAX蛋白相对表达水平分别为0.36±0.04、0.39±0.06,显著高于其它各组(P0.05);BCL-2蛋白水平0.17±0.03,显著低于其它各组(P0.05)。RT-PCR检测发现,K562细胞在雷帕霉素作用后,EZH2与Hedgehog基因mRNA水平明显下降(P0.05),而Ptch1基因m RNA水平明显上升(P0.05)。Western blot检测发现,K562细胞在雷帕霉素作用后,其EZH2与Hedgehog蛋白表达水平下降,而Ptch1蛋白水平上升(P0.05)。C组的EZH2与Hedgehog蛋白相对水平分别为0.21±0.03、0.16±0.05,显著低于其它各组(P0.05);Ptch1蛋白水平0.46±0.06,显著高于其它各组(P0.05)。结论:雷帕霉素可抑制白血病细胞中EZH2蛋白表达,从而干扰Hedgehog信号通路的激活,并促进凋亡蛋白的表达,减少抗凋亡蛋白水平,最终诱导白血病细胞的凋亡。     

联合抑制mTORC2与热休克蛋白90对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨m TORC2与HSP90共同受抑对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法:人多发性骨髓瘤细胞株U266细胞在培养过程中分别加入雷帕霉素20 nmol/L、17-AAG 600 nmol/L、雷帕霉素20 nmol/L+17-AAG600 nmol/L、PBS溶液进行干预,比较各组的细胞抑制率、形态变化、凋亡率以及caspase-3和AKT蛋白的表达。结果:联合使用雷帕霉素和17-AAG对多发性骨髓瘤细胞生长抑制作用明显的大于单一使用相同浓度相应药物;雷帕霉素、17-AAG及两药联合干预组细胞的凋亡率明显的大于PBS对照组,并且联合用药干预细胞的凋亡率明显大于单一使用相同浓度相应药物的干预细胞的凋亡率;雷帕霉素、17-AAG及两药联合干预组U266细胞的caspase-3蛋白表达明显的大于PBS对照组,并且联合用药干预细胞中caspase-3蛋白表达明显大于单一使用相同浓度相应药物;雷帕霉素、17-AAG及两药联合干预组U266细胞AKT蛋白表达明显小于对照组,联合用药干预组细胞AKT蛋白表达明显小于单一使用相同浓度相应药物,其差异均具有显著性(P0.05)。结论:联合抑制m TORC2与HSP90能抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖并且诱导细胞的凋亡。     

TIEG1对HL-60细胞凋亡及Bcl-2/Bax表达的影响

本研究旨在观察TIEG1对HL-60细胞凋亡及Bcl-2/Bax表达的影响。用不同浓度的TIEG1处理HL-60细胞,采用MTT法检测细胞生长抑制率。用12.03 ng/ml TIEG1处理HL-60细胞,以流式细胞术检测细胞凋亡,以RT-PCR方法检测Bcl-2及Bax的表达变化。结果表明,TIEG1对HL-60细胞具有增殖抑制作用,其抑制效应呈时间及剂量依赖性。TIEG1 12.03 ng/ml增殖抑制作用较为明显。在细胞凋亡过程中,Bax表达呈升高趋势,而Bcl-2呈下降趋势(P<0.05)。结论:TIEG1可以抑制HL-60细胞增殖,进而诱导其凋亡,且呈时间、剂量依赖性。在TIEG1诱导HL-60细胞凋亡的过程中,Bcl-2/Bax与TIEG1诱导HL-60细胞凋亡相关。     

mTOR抑制剂雷帕霉素对伯基特淋巴瘤细胞增殖抑制的研究

目的:探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂雷帕霉素对伯基特淋巴瘤细胞株Raji细胞和CA46细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响及其作用机制,寻找其靶向治疗方法。方法:采用MTT法观察雷帕霉素对Raji细胞和CA46细胞增殖抑制作用,PI单染流式细胞术分析雷帕霉素对Raji细胞和CA46细胞周期分布的影响,Annexin V-FITC+PI双染流式细胞术分析雷帕霉素对Raji细胞和CA46细胞凋亡的影响,Western blot法检测雷帕霉素对Raji细胞和CA46细胞RPS6磷酸化水平及survivin、caspase-3蛋白表达水平的影响。结果:雷帕霉素能够明显抑制Raji细胞和CA46细胞的增殖,在雷帕霉素为1 nmol/L时,细胞增殖抑制率即达到20%,表现出雷帕霉素良好的生物活性,且抑制作用具有时间依赖性(r=0.507)和浓度依赖性(r=0.838)。不同浓度雷帕霉素分别作用于Raji和CA46细胞24和48 h后,与对照组相比,发现细胞周期处于G_1/G_0期细胞逐渐增多,S期和G2/M期细胞则逐渐减少,呈现时间依赖性(r=0.961)和浓度依赖性(r=0.947)。雷帕霉素100 nmol/L作用于Raji和CA46细胞48 h后,Annexin V+PI双染流式细胞术检测显示细胞明显凋亡,且主要为中晚期凋亡。Western blot法检测显示,雷帕霉素作用于Raji细胞和CA46细胞后,RPS6磷酸水平及survivin表达水平明显降低,caspase-3表达水平明显升高,且具有时间依赖性(r=0.926)和浓度依赖性(r=0.985)。结论:雷帕霉素能够通过抑制mTOR下游通路RPS6蛋白磷酸化,进而抑制mTOR/RPS6通路活化,阻滞细胞周期于G_1/G_0期,达到有效抑制伯基特淋巴瘤细胞株Raji细胞和CA46细胞增殖,同时下调抗凋亡蛋白survivin的表达,激活内源性促凋亡蛋白caspase-3而诱导细胞发生凋亡。     

骨髓间充质干细胞对HL-60细胞增殖的影响

本研究探讨骨髓间充质干细胞(MSC)对HL-60细胞增殖的影响及相关的分子机制。将单独培养的HL-60细胞作为对照组,与MSC共培养的HL-60细胞作为实验组。在不同时间计数两组HL-60细胞,描绘其时间-数量曲线;流式细胞仪检测2组HL-60细胞的细胞周期、凋亡细胞比例及Survivin和Bcl-2蛋白的表达。结果表明,实验组HL-60细胞的增殖明显受抑,在第5-7天差异显著(P<0.01),实验组HL-60细胞分布于G0/G1期的比例增加〔对照组(47.0±9.0)%vs实验组(70.0±16.0)%,P=0.003)〕,并且出现凋亡峰。实验组HL-60细胞Survivin和Bcl-2蛋白表达同时下调。Bcl-2表达率在对照组为(63.0±9.1)%,实验组为(50.0±14.1)%(P=0.045);Survivin表达率在对照组为(94.0±9.3)%,实验组为(77.0±11.8)%(P=0.006)。结论:骨髓MSC对HL-60细胞的增殖有抑制作用,并促进HL-60细胞凋亡。     

雷帕霉素对人前列腺癌C4-2B细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨雷帕霉素对人前列腺癌C4-2B细胞增殖和凋亡的影响。方法采用购自中国科学院上海细胞生物学研究所人前列腺癌C4-2B细胞,分为两组,实验组分别选择10 nmol/L、20 nmol/L、40 nmol/L、60 nmol/L浓度雷帕霉素的DMEM培养基处理,对照组选择含0. 1%DMSO的培养基。在体外用CCK8实验和软琼脂克隆形成实验检测细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞株的凋亡情况。结果 C4-2B在雷帕霉素的作用下增殖能力明显减弱,并呈现一定的时间依赖性和剂量依赖性;软琼脂克隆形成实验显示,与对照组相比实验组C4-2B克隆形成的数目减少,体积明显变小;与对照组相比,流式细胞术显示细胞经雷帕霉素处理以后细胞的凋亡比率明显增加。结论雷帕霉素能够抑制C4-2B细胞的增殖,促进其凋亡。     

蟾蜍灵在诱导HL-60细胞凋亡过程中对Bcl-2和PKC的影响

为了研究蟾蜍灵在诱导HL-60细胞凋亡过程中对Bcl-2表达与裂解和磷酸化的作用,及对蛋白激酶C(PKC)活性与PKCs亚细胞定位的影响,分别采用台盼蓝拒染法检测细胞生存率,细胞染色法观察凋亡形态,流式细胞术分析细胞周期,琼脂糖凝胶电泳检测凋亡DNA片段化,[γ-32P]同位素掺入法测定PKC活性,Westernblot分析Bcl-2及PKC蛋白表达。结果表明:①蟾蜍灵抑制HL-60细胞增殖,24、48及72小时的IC50分别为(25.8±2·1)、(8.0±1.2)及(2.3±0.3)nmol/L;②50nmol/L蟾蜍灵作用24小时可诱导HL-60细胞凋亡;③50nmol/L蟾蜍灵处理HL-60细胞6-24小时,Bcl-2蛋白表达水平明显下调,并出现23kD的裂解片段,磷酸化水平逐渐降低;④1-100nmol/L蟾蜍灵分别作用30分钟,对PKC总活性无影响,但可促使PKCβⅡ膜转位。结论:蟾蜍灵诱导HL-60细胞凋亡可能与Bcl-2表达降低、裂解及脱磷酸化有关。     

白藜芦醇逆转急性髓系白血病细胞HL-60/ADR耐药的凋亡机制

目的:探讨白藜芦醇(Resveratrol,Res)逆转急性髄系白血病细胞HL-60/ADR耐药的凋亡机制。方法:将HL-60/ADR细胞分为对照组(Control)、阿霉素(ADR)处理组、Res处理组和ADR+Res联合处理组4组。应用CCK-8法测定细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞内阿霉素(ADR)自发荧光强度和细胞凋亡率;RT-PCR法检测耐药基因MRP1、抗凋亡基因BCL-2和促凋亡基因BAX mRNA表达水平,Western blot法测定MRP1、BCL-2和BAX蛋白表达水平。结果:25、50、100和200μmol/L Res作用于HL-60/ADR细胞48 h后,细胞的最大抑制率分别为44%、61%、76%和81%,呈浓度依赖性(r=0.876,P0.05);与ADR组的半数抑制浓度(IC50)(8.534±1.111μmol/L)相比,ADR+Res组HL-60/ADR细胞的IC50(1.591±0.373μmol/L)明显减少(P0.05)。ADR联合Res后HL-60/ADR耐药细胞内ADR自发荧光强度明显增加(P0.05);Res组和ADR+Res组细胞凋亡率均显著增加(P0.05)。Res组和ADR+Res组的MRP1 mRNA、BCL-2 mRNA表达水平显著下降(P0.05),BAX mRNA表达水平明显上升(P0.05)。Res组和ADR+Res组M RP1、BCL-2蛋白表达水平显著下降(P0.05),BAX蛋白明显上升(P0.05)。结论:白藜芦醇具有逆转HL-60/ADR细胞耐药的作用,可能是通过促进HL-60/ADR细胞凋亡、抑制耐药蛋白M RP1而发挥作用,其促凋亡机制与抑制BCL-2和增强BAX表达有关。     

别欧前胡内酯对HL-60细胞凋亡的影响

目的探讨别欧前胡内酯对人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞凋亡的影响及可能的机制。方法对数生长期人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞随机分为对照组和4、16、32、64、128mg/L别欧前胡内酯组。别欧前胡内酯作用24h,应用透射电子显微镜观察HL-60细胞形态学改变,MTT法检测别欧前胡内酯对HL-60细胞增殖的影响,根据细胞生长抑制率计算别欧前胡内酯对HL-60细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50),流式细胞仪检测HL-60细胞凋亡率及线粒体膜电位改变。结果别欧前胡内酯作用24h,对照组HL-60细胞表面光滑,形态正常,大小均匀;64、128mg/L别欧前胡内酯组HL-60细胞数目明显减少,且体积变小,呈凋亡形态改变;MTT检测结果显示,别欧前胡内酯对HL-60细胞增殖具有明显的抑制作用,IC50值为(75±13)mg/L;流式细胞仪检测结果显示,对照组HL-60细胞凋亡率为(11.6±5.2)%,4、16、32、64、128 mg/L别欧前胡内酯组HL-60细胞凋亡率分别为(17.2±6.1)%、(24.2±8.6)%、(36.1±4.5)%、(46.0±7.3)%和(69.9±10.2)%,随别欧前胡内酯浓度增加,HL-60细胞凋亡率逐渐增高,线粒体膜电位逐渐降低(P0.05)。结论别欧前胡内酯可明显促进人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞凋亡,其机制可能与改变HL-60细胞线粒体膜电位有关。     

大蒜素对LM-8细胞Bcl-2及Bax表达的影响

背景:有研究证实,大蒜素对LM-8细胞增殖及凋亡有影响.目的:观察大蒜素干预C3H小鼠骨肉瘤细胞株LM-8细胞Bcl-2、Bax凋亡蛋白的表达,以及LM-8细胞的形态学变化与Bcl-2及Bax变化的关系.设计:随机分组,非盲法,细胞水平体外实验.单位:实验于2006-09/2007-05在华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室完成.材料:实验所用C3H小鼠LM-8骨肉瘤细胞株购自解放军第四军医大学实验动物中心.大蒜素为武汉汇海公司产品,是从大蒜球茎中分离出的硫化物.Cell Counting Kit-8试剂购于上海同仁化学研究所,Bcl-2和Bax抗体及SP试剂盒购于福州迈新生物技术开发公司.方法:以含体积分数为0.1新生牛血清的1640完全培养基,培养LM-8细胞,制作细胞爬片.SP免疫细胞组织化学技术检测细胞爬片中Bcl-2和Bax蛋白表达;倒置显微镜下观察5.0,10.0和15.0 mg/L质量浓度大蒜素作用前后LM-8细胞形态变化;将LM-8细胞调整至7.5×107L-1接种于96孔板,用1.0,5.0,10.0和15.0 mg/L质量浓度的大蒜素处理细胞,设立不加任何处理因素的对照组及不含细胞和药物的培养基空白组,孵育24,48,72 h后取出培养板,加入CCK-8测定吸光度值,计算LM-8细胞生长抑制率:以5.0,10.0和15.0 mg/L质量浓度大蒜素干预LM-8细胞24,48,72 h,消化离心收集细胞,以流式细胞仪分析细胞凋亡率的变化.主要观察指标:LM-8细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达;LM-8细胞形态及增殖、凋亡情况.结果:①Bcl-2和Bax蛋白表达:大蒜素可以降低Bcl-2表达,增强Bax表达,经15.0mg/L大蒜素作用72h,Bcl-2和Bax蛋白表达阳性率及Bcl-2/Bax表达与对照组比较,差异有显著性意义(P＜0.01).②LM-8细胞的形态:经不同质量浓度大蒜素干预后均出现明显凋亡表现.③LM-8细胞的增殖:大蒜素能明显抑制LM-8细胞的增殖,当大蒜素浓度从1.0 mg/L增加到15.0 mg/L,LM-8细胞72 h时生长抑制率由(23.87±3.26)%增至(58.32±5.38)%,在72 h其药物半数抑制率浓度是11.09 mg/L.④LM-8细胞的凋亡:5.0,10.0和15.0 mg/L质量浓度的大蒜素作用72 h后可诱导LM-8细胞凋亡,且呈浓度依赖性(P＜0.05).结论:①大蒜素可抑制LM-8细胞增殖,该效应与大蒜素的浓度和时间有关.②大蒜素可诱导LM-8细胞凋亡,作用呈浓度依赖性.③大蒜素抑制LM-8细胞增殖和诱导LM-8细胞凋亡的机制可能与下调Bcl-2的表达和上调Bax的表达有关.     

灯盏花乙素对急性髓系白血病细胞增殖的影响及作用机制研究

目的:探讨灯盏花乙素(SCU)对急性髓系白血病(AML)细胞增殖、周期与凋亡的影响及相关分子机制。方法:体外培养人AML HL-60细胞，分别以0、2、4、8、16、32、64μmol/L浓度的SCU处理HL-60细胞，采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率。以4、8、16μmol/L浓度的SCU处理HL-60细胞，并设置阴性对照组(NC组)，采用流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡，Western blot法检测细胞周期、凋亡相关蛋白及JAK2/STAT3通路相关蛋白的表达。结果:SCU对HL-60细胞具有明显的增殖抑制作用，且增殖抑制作用呈浓度(r=0.958)、时间(r=0.971)依赖性。与NC组比较，SCU 4、8、16μmol/L组HL-60细胞G0/G1期比例、细胞凋亡率均显著升高，S期比例均显著降低(P <0.05); p21、p53、caspase-3、Bax蛋白相对表达量均显著升高，CDK2、cyclin E、Bcl-2蛋白相对表达量均显著降低(P <0.05),p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值均显著降低(P <0.05)，且上述...     

急性B淋巴细胞白血病REH细胞对雷帕霉素敏感性与mTOR通路激活的关系

目的探讨在急性B淋巴细胞白血病细胞系REH中敲除抑制哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)活性的基因nprl2后,细胞对雷帕霉素的敏感性。方法构建靶向nprl2基因的CRISPR-Cas9载体,并包装为病毒CRISPR-Cas9-nprl2-sg1、CRISPR-Cas9-nprl2-sg2、CRISPR-Cas9-nprl2-sg3感染REH细胞(分别为REH-nprl2-sg1、REH-nprl2-sg2和REH-nprl2-sg3细胞),感染72 h后采用1 mg/L的嘌呤霉素处理72 h,提取细胞DNA进行PCR,进行一代测序,测序结果为杂峰的是感染成功细胞(REH-nprl2-sg1)(敲除组)。REH细胞感染不含sgRNA的CRISPR-Cas9质粒空载体为对照组。采用实时定量PCR检测2组细胞nprl2 mRNA表达水平,采用CCK8法检测2组细胞培养第1～7天细胞活性,计算细胞增殖倍数;2组分别加入0.1、1、10、100、1 000、10 000 nmol/L雷帕霉素,培养72 h后检测细胞活性,比较雷帕霉素对2组细胞的半数抑制浓度。结果敲除组细胞nprl2 mRNA相对表达量(0.012 3±0.002 7)低于对照组(0.833 0±0.070 8)(P0.05);敲除组第5～7天细胞增殖倍数(15.134±0.312、20.589±0.436、37.595±0.917)高于对照组(13.690±0.106、17.920±0.291、18.817±0.217)(P0.05),第1～4天与对照组比较差异无统计学意义(P0.05);1、10、100、1 000、10 000 nmol/L雷帕霉素处理后,敲除组细胞活性(0.806±0.001、0.478±0.013、0.323±0.002、0.274±0.008、0.279±0.003)较对照组(1.000±0.011、0.711±0.045、0.538±0.034、0.432±0.019、0.403±0.025)明显降低(P0.05),敲除组雷帕霉素对细胞半数抑制浓度(0.48 nmol/L)小于对照组(2.07 nmol/L)。结论敲除nprl2后的REH细胞对雷帕霉素的敏感性明显提高,在伴有mTOR通路突变的急性B淋巴细胞白血病患者中联合使用雷帕霉素可能有较好治疗效果。     

槲皮素调控EGFR/AKT/mTOR信号通路影响人乳腺癌细胞株T47D增殖、凋亡的实验研究

目的对槲皮素调控表皮生长因子/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(EGFR/AKT/m TOR)信号通路影响人乳腺癌细胞株T47D增殖、凋亡进行分析。方法人乳腺癌细胞株T47D随机分为三组:对照组、雷帕霉素组和槲皮素组。对照组T47D细胞给予溶剂DMSO孵育,雷帕霉素组T47D细胞给予雷帕霉素(10μM)孵育,槲皮素组T47D细胞给予槲皮素(20μM)孵育。分析各组T47D细胞的凋亡蛋白及EGFR/AKT/m TOR信号通路蛋白的表达。结果与对照组相比,槲皮素组和雷帕霉素组细胞增殖受到明显地抑制(P0.05);槲皮素组和雷帕霉素组T47D细胞的促进凋亡分子Bax、Caspase3和Caspase9蛋白及mRNA水平明显高于对照组而抑制凋亡分子Bcl2蛋白及mRNA水平明显低于对照组(P0.05);槲皮素组和雷帕霉素组T47D细胞EGFR、AKT及m TOR蛋白及荧光强度均明显低于对照组(P0.05)。结论槲皮素能够通过抑制EGFR/AKT/m TOR信号通路促进人乳腺癌细胞株T47D的细胞凋亡过程。     

硼替佐米联合维生素C对淋巴瘤细胞株Jurkat凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响

目的分析硼替佐米联合维生素C(VitC)对淋巴瘤细胞株Jurkat凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。方法收集淋巴瘤细胞株Jurkat细胞并分成30 nmol/L硼替佐米组、100μg/ml VitC组及联合组(30 nmol/L硼替佐米联合100μg/ml VitC治疗)。用流式细胞仪和CCK-8检测Jurkat细胞凋亡率和周期及采用免疫组织化学法检测Bcl-2和Bax的表达情况。结果 VitC组使Jurkat细胞的生长方式从局部聚集变化成平均分布;硼替佐米组于1～2 d期间Bcl-2的表达水平较VitC组及联合组降低得更慢,其Bax的表达水平较VitC组及联合组升高得更慢,且VitC组的Bax的表达水平显著高于硼替佐米组。硼替佐米组Jurkat细胞抑制率较VitC组显著升高(P 0. 01),联合组Jurkat细胞抑制率较VitC组和硼替佐米组均显著升高(P 0. 01)。相比对照组,硼替佐米组、VitC组及联合组Jurkat细胞凋亡率均显著升高(P 0. 01),且VitC组和联合组Jurkat细胞凋亡率较硼替佐米组均显著升高(P 0. 01)。结论 VitC有利于抑制早期淋巴瘤细胞株Jurkat的增殖,同时细胞凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax的表达情况与VitC诱导Jurkat细胞凋亡关系密切。     

navitoclax联合阿糖胞苷在HEL细胞凋亡中的作用

目的探讨navitoclax(NTX)联合阿糖胞苷(cytarabine, Ara-C)对HEL细胞凋亡的影响及可能机制。方法取对数生长期HEL细胞,随机分为NTX组、Ara-C组和联合组,分别应用不同浓度NTX、Ara-C、NTX+Ara-C处理72 h,采用CCK-8法测定细胞活率,计算50%细胞抑制时的药物浓度(half maximal inhibitory concentration, IC_(50)),依据IC_(50)进行后续试验。分别取NTX组、Ara-C组和联合组处理24、48 h时细胞,采用流式细胞术检测早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率;采用实时荧光定量PCR法检测Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, BAX)mRNA、Bcl-2同源拮抗剂(Bcl-2 homologous antagonist/killer, BAK)mRNA、Bcl-2细胞凋亡相互作用介质(Bcl-2 interacting mediator of cell death, BIM)mRNA相对表达量,并进行比较。结果联合组应用NTX 10 nmol/L+Ara-C 20 nmol/L、NTX 100 nmol/L+Ara-C 200 nmol/L处理72 h细胞活率[(35.27±4.04)%、(13.58±1.33)%]低于NTX组应用NTX 10 nmol/L、100 nmol/L[(103.44±9.26)%、(65.56±3.37)%]、Ara-C组应用Ara-C 20 nmol/L、200 nmol/L处理72 h[(53.46±5.42)%、(20.92±1.74)%](P0.05);联合组应用NTX 1 000 nmol/L+Ara-C 2 000 nmol/L、NTX 10 000 nmol/L+Ara-C 20 000 nmol/L处理72 h细胞活率[(11.92±0.94)%、(8.86±1.26)%]低于Ara-C组应用Ara-C 2 000 nmol/L、20 000 nmol/L处理72 h[(19.43±0.43)%、(13.46±0.70)%](P0.05);处理24 h,联合组、NTX组、Ara-C组细胞早期凋亡率[(39.40±0.80)%、(19.50±1.13)%、(7.23±0.73)%]、总凋亡率[(50.01±0.65)%、(28.01±0.56)%、(10.20±0.71)%]依次降低(P0.05),联合组、NTX组晚期凋亡率[(10.61±1.45)%、(8.51±0.85)%]高于Ara-C组[(2.97±0.09)%](P0.05),联合组与NTX组比较差异无统计学意义(P0.05);处理48 h,联合组、NTX组、Ara-C组细胞早期凋亡率[(67.13±9.11)%、(15.03±0.87)%、(4.50±0.07)%]、晚期凋亡率[(15.70±1.33)%、(3.66±0.49)%、(2.22±0.31)%]、总凋亡率[(82.83±10.31)%、(18.70±1.28)%、(6.72±0.37)%]依次降低(P0.05);联合组处理24 h BAK mRNA相对表达量(1.27±0.45)高于NTX组(0.68±0.14)(P0.05),处理48 h BAK mRNA相对表达量(3.66±0.27)高于NTX组(0.90±0.04)、Ara-C组(1.06±0.41)(P0.05);处理24、48 h,联合组、NTX组、Ara-C组BAX mRNA相对表达量(24 h:1.34±0.41、1.14±0.18、0.96±0.28;48 h:1.09±0.48、0.93±0.14、1.04±0.26)、BIM mRNA相对表达量(24 h:0.89±0.07、1.06±0.20、1.04±0.22;48 h:1.19±0.30、0.87±0.08、1.14±0.15)比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 NTX联合Ara-C能明显诱导HEL细胞凋亡,其机制与上调前凋亡蛋白BAK表达有关。