豚鼠前庭单个毛细胞的分离

从7只豚鼠前庭中取出壶腹嵴、位觉斑,放置在胶原酶溶液中孵育50min～60 min后行机械分离。获得均含有皮板和纤毛的两种类型活性毛细胞83(±23)个,其中Ⅰ型毛细胞里烧瓶状,细胞中部有明显的颈;Ⅱ型毛细胞呈圆形式椭圆形,胞体比Ⅰ型毛细胞小;Ⅰ、Ⅱ型毛细胞的比例是62:19;分离后5h仍有40％的毛细胞具有活性。另外,笔者还观察到失活的早期变化是胞内出现颗粒。实验结果表明,酶消化后辅以机械分离,可获得大量单个、离体的活性毛细胞,并且能利用进行哺乳动物前庭的生理学研究。     

新生小鼠内耳前庭毛细胞分离方法

单离前庭毛细胞是研究内耳前庭生理、病理等机制的重要模型。１９８９年Ｖａｌａｔ［１］成功地分离出保持细胞活性的哺乳类动物前庭毛细胞,近年来,国内外学者对酶分离结合机械分离法分离哺乳类动物前庭细胞进行了深入的研究,取得了很大的进展。本实验运用化学法并辅以...     

豚鼠椭圆囊斑感觉毛细胞损伤后修复的超微结构观察

目的：研究豚鼠前庭感觉毛细胞损伤后的修复与再生，探讨再生可能的前体细胞。方法：用扫描及透射电镜观察豚鼠椭圆囊斑感觉毛细胞于庆大霉素（ＧＭ）损伤后修复过程的超微结构。结果：发现ＧＭ处理后第４￣７日，椭圆囊斑微纹区缺损的毛细胞由支持细胞填补，第３０日可见部分毛细胞表面长出较细、短的不成熟纤毛束，形态结构类型Ⅱ型的感觉毛细胞。结论：类似Ⅱ型的感觉毛细胞可能为新生的毛细胞；前庭感觉毛细胞再生的前体细胞可能     

多粘菌素B对豚鼠内耳碳酸酐酶活性的影响

为了解多粘菌素Ｂ（ＰＢ）对内耳碳酸酐酶（ＣＡＨ）的影响，用Ｈａｎｓｓｏｎ法和Ｙｏｋｏｔａ法观察豚鼠鼓室注射生理盐水或ＰＢ１万Ｕ／ｍｌ后内耳ＣＡＨ的定位，结果发现生理盐水组豚鼠内耳ＣＡＨ分布广泛，血管纹，内外毛细胞表现为极强阳性，前庭暗细胞表现强阳性，ＰＢ组内耳ＣＡＨ活性普遍减低，电镜下外毛细胞内ＣＡＨ反应物几乎消失，并且出现细胞水肿，推测ＰＢ破坏细胞膜的通透性后影响ＣＡＨ的活性，加重对内耳的损害。     

链霉素、庆大霉素和卡那霉素对豚鼠单个离体毛细胞活性影响的比较

为比较氨基甙类抗生素对豚鼠单个离体外毛细胞和前庭毛细胞的影响, 用酶解加机械分离方法获得单个离体的外毛细胞和前庭毛细胞,置于分别含有１ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ的链霉素、庆大霉素和卡那霉素的培养液中短期培养,并以ＦＤＡ－ＰＩ双染色法鉴定细胞活性。结果发现在仅含上述药物的培养液中, 细胞活性无明显改变, 而在无钙、镁培养液中３ 种药物均可引起细胞形态和活性的改变,其中链霉素和庆大霉素对前庭毛细胞活性影响较大,卡那霉素对外毛细胞活性影响较强。临床上链霉素可首选用于经外淋巴灌流治疗梅尼埃病     

多粘菌素B对豚鼠内耳碳酸酐酶活性的影响

为了解多粘菌素Ｂ（ＰＢ）对内耳碳酸酐酶（ＣＡＨ）的影响，用Ｈａｎｓｓｏｎ法和Ｙｏｋｏｔａ法观察豚鼠鼓室注射生理盐水或ＰＢ１万Ｕ／ｍｌ后内耳ＣＡＨ的定位。结果发现生理盐水组豚鼠内耳ＣＡＨ分布广泛，血管纹、内外毛细胞表现为极强阳性，前庭暗细胞表现为强阳性。ＰＢ组内耳ＣＡＨ活性普遍减低，电镜下外毛细胞内ＣＡＨ反应产物几乎消失，并且出现细胞水肿。推测ＰＢ破坏细胞膜的通透性后影响ＣＡＨ的活性，加重对内耳的损害     

胚胎期豚鼠前庭终器细胞凋亡的检测

目的 研究豚鼠胚胎正常期前庭终器形态变化及细胞凋亡，探讨细胞凋亡在前庭终器发育中的作用。方法 选用胚胎40和50d正常豚鼠，光镜观察基前庭终器发育形态变化，末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）测定毛细胞和支持细胞凋亡，并以电镜观察凋亡细胞胞核变化。结果 胚胎40d，豚鼠前庭壶腹、椭圆囊斑及球囊斑已分化，前庭上皮出现一层毛细胞及多层支持细胞；胚胎50d，支持细胞层数减少，毛细胞数目增加，伴有神经纤维出现。TUNEL检测提示大量毛细胞和支持细胞发生凋亡。电镜下前庭上皮细胞发生分化，凋亡的毛细胞和支持细胞胞核染色质浓缩边集。凋亡细胞与新生细胞相邻。结论 细胞凋亡是豚鼠内耳前庭终发育的必然现象，凋亡的发生对保证内耳正常结构和功能密切相关。     

人单纯疱疹病毒1型对血管平滑肌细胞脂质代谢的影响

目的；研究人单纯疱疹病毒１型（ＨＳＶ－１）对血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）脂质代谢的影响，探讨ＨＳＶ－１与动脉粥样硬化（ＡＳ）的关系。方法：ＨＳＶ－１感染体外培养的年 脉平滑肌细胞，观察细胞形态和超生结构的改变，以及细胞内脂质代谢的变化。结果：ＨＳＶ－１感染后，用ＰＣＲ法能检出ＳＭＣ内存在ＨＳＶ－１核酸片段；感染后２４ｈ和３６ｈ，感染组细胞内总胆因醇（ＣＨ）较对照组明显增高，ＨＥ染色和电镜下均显示感染组     

G1Na-TK基因转染联合无环鸟苷(ACV)对人肾癌细胞株GRC-1细胞的体外杀伤作用

目的：探索ＨＳＶ１－ＴＫ基因联合应用无环鸟苷（ＡＣＶ）对人肾癌细胞株ＧＲＣ－１细胞的杀伤作用。方法对分别培养及混合培养的ＧＲＣ－１细胞和ＣＲＣ１－ＴＫ细胞,用不同浓度ＡＣＶ进行处理,然后观察细胞形态及数量的改变。结果在ＡＣＶ作用下,ＧＲＣ－１细胞的形态及数量无明显改变;ＧＲＣ－１／ＴＫ细胞被明显杀伤,数量明显减少,当今２５．０％ＧＲＣ－１／ＴＫ细胞的混合培养细胞即可观察到明显杀伤作用。结论ＨＳＶ１     

丙型肝炎病毒基因型与丙型肝炎临床病情关系的研究

应用引物特异ＰＣＲ法对沈阳地区８３例各型丙型肝炎，６例原发性肝癌抗－ＨＣＶ及ＨＣＶＲＮＡ均阳性的血清标本进行ＨＣＶ基因分型，旨在了解本地区ＨＣＶ基因型分布情况及ＨＣＶ不同基因型与丙型肝炎病人临床病情轻重的关系。结果表明：ＨＣＶ－Ⅱ型感染占５７．３％（５１／８９）、ＨＣＶ－Ⅲ型感染占２８．１％（２５／８９）、Ⅱ／Ⅲ混合型感染占１３．５％（１２／８９）、未分型占１．１％（１８９）；急性肝炎、慢性肝炎轻度、中度、重度、肝炎后肝硬化及原发性肝癌中ＨＣＶ－Ⅱ型感染分别占６２．５％、３５．５％、６６．７％、８５．７％、９０．９％及１００％，而ＨＣＶ－Ⅲ型感染分别占２５％、４６．７％、８．３％、０％、９．１％及０％。提示沈阳地区ＨＣＶ感染以Ⅱ型为主，其次为Ⅲ型及Ⅱ／Ⅲ混合型，ＨＣＶ不同基因型与丙型肝炎病人临床病情的严重程度呈密切相关     

Cholinergic agonists increase intracellular calcium concentration in guinea pig vestibular hair cells

Objective To better understand the cholinergic receptors in vestibular hair cells (VHC) an d their subtypes, and to investigate the effects of cholinergic agonists on intr acellular calcium concentration (［Ca(2+)］(i) ) in guinea pig VHCs.Methods VHCs were isolated from guinea pig crista ampullaris by enzymatic and mechanical methods. The effect of cholinergic agonists on ［Ca(2+)］(i) was examined using laser scanning confocal microscopy and the Ca［2+］ sensitive dye Fluo -3.Results The results showed that the addition of acetylcholine (ACh) and carbachol (CCh), muscarnic and nicotinic agonists, induced ［Ca(2+)］(i) increases in all th e VHCs, whereas acetylcholine bromide (ACh-Br), a nicotinic agonist, induced th e ［Ca(2+)］(i) increase in only a small percentage of VHCs. The ACh or CC h-induced Ca［2+］ response could be partially suppressed by atropine. In th e presence of 0.1 mmol/L atropine, the amplitudes of ACh or CCh-induced ［Ca(2+)］(i) responses became significantly smaller than those in atropine free medium (P<0.01). Conclusions The results suggest the existence of cholinergic receptors in guinea pig VHCs. It is the muscarnic agonists rather than nicontic receptors that dominate ［Ca(2+)］(i) variation. Atropine can suppress muscarnic agonist-induced Ca［2 +］ responses.     

胆碱能受体激动剂对豚鼠离体前庭毛细胞内钙离子浓度的影响

目的：通过观察胆碱能受体激动剂对离体前庭毛细胞内钙离子浓度的影响,探讨前庭毛细胞膜所存在的胆碱能受体及其分型、受体的脱敏现象。方法：用胶原酶消化后机械分离法,分离豚鼠壶腹嵴前庭毛细胞（VHC), 钙敏荧光探针 Fluo-3 荧光染色,用激光扫描共聚焦显微镜记录VHC细胞内游离钙离子浓度（[Ca2+]i）的动态变化。结果：①胆碱能M和N型受体激动剂乙酰胆碱(ACh)、氨甲酰胆碱(CCh)均可引起离体VHC内[Ca2+]i的升高;N型受体激动剂溴化乙酰胆碱(Ach-Br)仅在高浓度（10 mmol/L）时引起部分（4/5）离体VHC内[Ca2+]i升高,在低浓度(1mmol/L)时影响不明显;②ACh、CCh 引起 VHC内[Ca2+]i升高在同一细胞不能重复出现,存在脱敏现象;而不同类型的受体激动剂先后作用时无脱敏现象;③阿托品对ACh、CCh引起的VHC内[Ca2+]i的升高有抑制作用;加入 0.1 mmol/L 阿托品可使 1 mmol/L ACh 或 CCh 引起的 VHC 内[Ca2+]i升高的峰值明显减小(t检验均有极显著差异,P<0.01)。结论：豚鼠前庭毛细胞膜上存在 M 型和 N 型两种受体,M 型受体激动剂引起 VHC 内[Ca2+]i的升高较 N 型明显。阿托品对 M 型受体激动剂引起的[Ca2+]i 升高有抑制作用;前庭毛细胞膜上的胆碱能受体对同一类型的激动剂有脱敏现象,而不同类型的激动剂     

庆大霉素耳中毒后鸡前庭感觉上皮细胞再生的实验研究

为探讨氨基糖甙类药物损伤后，鸡前庭感觉上皮细胞是否与听觉毛细胞一样具有再生能力，按每ｄ６０ｍｇ／ｋｇ剂量给鸡肌注庆大霉素，共１０ｄ。然后，分别于庆大霉素注射结束后第１、７ｄ，经腹腔注射细胞增殖标记物５－溴脱氧尿核苷（５－ｂｒｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ，ＢｒｄＵ），６ｈ后处死动物，取颞骨制备石蜡切片，应用免疫细胞化学染色技术，观察损伤后前庭感觉上皮中的细胞增殖活动。结果发现：椭圆囊斑、球囊斑及壶腹嵴上均可见标记阳性细胞。从标记细胞核的解剖位置来看，标记支持细胞及标记毛细胞均可见。显示鸟纲动物前庭感觉上皮细胞具有较强的对抗病理损伤的再生修复能力     

庆大霉素对豚鼠前庭上皮IGF-1及其受体表达的影响

目的：研究庆大霉素对豚鼠前庭上皮胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）及其受体（insulin-like growth factor-1 receptor，EGF-1R）表达的影响，并探讨其生物学特性。方法：采用免疫组织细胞化学方法，以抗IGF-1及IGF-1R抗体为标记物，检测庆大霉素损伤后豚鼠前庭上皮自发修复期IGF-1及IGF-1R的表达变化和分布特点；采用Brdu体内标记和抗Brdu抗体免疫组化染色，检测庆大霉素损伤后豚鼠前庭上皮增殖的变化。结果：IGF-1及IGF-1R在正常成年豚鼠前庭上皮细胞中有低水平表达，庆大霉素损伤后，其表达增多。在1d组IGF-1及IGF-1R表达最强，其后逐渐减少。在正常对照组中无Brdu阳性细胞。各实验组均观察到Brdu阳性细胞，7d组最多。结论：庆大霉素损伤后，豚鼠前庭上皮IGF-1及IGF-1R表达增强，其时程变化与细胞增殖活动密切相关。IGF-1在豚鼠前庭上皮损伤后的细胞增殖中可能起重要信号转导作用。     

Muscarinic acetylcholine receptor subtype expression in type vestibular hair cells of guinea pigs

Recent studies have demonstrated that five subtypes (M1-M5) of muscarinic acetylcholine receptor (mAChR) are expressed in the vestibular periphery.However,the exact cellular location of the mAChRs is n...     

耳蜗毛细胞分离方法的改良

目的探讨耳蜗毛细胞的分离方法。方法选出生３周的ＳＤ大白鼠，雌雄兼用，在自制的外淋巴液中取出耳蜗基底膜，置于０．２５ｍｇ／ｍｌ木瓜蛋白酶中，３７℃３０ｍｉｎ消化后，洗去酶液，用钢针在普通解剖镜下剥离毛细胞并置倒置相差显微镜下观察，记录成活时间。结果每侧耳蜗可获２００左右成活的毛细胞，５ｈ后仍有７０％的毛细胞成活。结论用自制改良外淋巴液，并简化了操作过程，可以满意地获得形态、功能完好的毛细胞     

庆大霉素中毒后雏鸡耳蜗毛细胞再生和表皮生长因子的促再生作用

目的:观察雏鸡庆大霉素(GM)中毒后耳蜗毛细胞的再生及表皮生长因子(EGF)对其再生的影响.方法:给雏鸡注射GM10d,其后再注射EGF5d,分别用光镜、扫描电镜及透射电镜观察耳蜗基底乳头(BP)形态学变化;用增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色观察BP细胞增殖.结果:停用GM后1d,BP毛细胞损失平均约51%,毛细胞形态不规则,线粒体和表皮板肿胀,细胞自溶破坏.停用GM后5d,支持细胞表面增宽,中间出现小的表皮板和短的听毛,此为新的毛细胞.14d新生毛细胞形态规则,21d发育成熟,BP形态接近正常.PCNA阳性细胞主要是支持细胞和透明细胞.EGF组毛细胞再生活跃,PCNA阳性细胞核明显增多.停用GM后10d,毛细胞数明显比GM组多,14dBP形态接近正常.结论:GM耳中毒的雏鸡耳蜗毛细胞可以再生;再生的毛细胞可能来源于支持细胞和透明细胞;EGF可促进这一过程.     

不同分子量八珍汤水溶多糖的分离和活性研究

目的：提取并分离不同分子量八珍汤水溶多糖,并研究其活性。方法水提醇沉法提取八珍汤水溶性粗多糖,采用滤膜离心法将多糖按分子量分为3段,低、中和高分子量分别标记为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ段,其分子量分别为≤3×104,3×104～105和≥105。采用流式细胞术分析多糖对细胞活力、活性氧（ ROS）及细胞周期的影响。结果3种不同分子量多糖对K562细胞活力无影响,但Ⅰ和Ⅲ段多糖可增加K562和THP-1细胞内活性氧,并促进THP-1细胞增殖。结论不同分子量的八珍汤多糖对白血病细胞活力无显著影响,但低和高分子量多糖可增加髓系来源细胞（ K562和THP-1） ROS水平,并促进THP-1细胞增殖。