SARS冠状病毒多抗原表位融合蛋白的表达及其诊断应用

目的 制备SARS冠状病毒(SARS-CoV)多抗原表位融合蛋白,建立一种可特异性诊断SARS的血清学方法,用于SARS的明确诊断和流行病学调查研究.方法 设计含有SARS冠状病毒S、M和N蛋白优势抗原表位区的多表位融合蛋白SMN,利用大肠杆菌表达SMN蛋白,并作为包被抗原建立ELISA方法,用于SARS患者血清检测.结果 设计出包含S603-635 M2-31、N362-412表位区的多表位融合蛋白SMN,并在大肠杆菌中成功表达.以SMN蛋白为包被抗原,ELISA检测74份SARS患者血清全部为阳性,另44份非SARS-CoV感染的发热病人血清和62份健康人血清均为阴性.结论 SARS-CoV多抗原表位融合蛋白SMN在大肠杆菌中成功表达,以SMN为检测抗原建立的ELISA方法为SARS血清学诊断奠定了基础.     

三种不同原理的间接酶联免疫吸附试验方法在严重急性呼吸道综合征诊断中的比较研究

目的比较不同原理的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法在严重急性呼吸道综合征(Severeacuterespirato-rysyndrome,SARS)诊断中的应用,以便研制开发更先进的诊断试剂,应对可能发生的SARS再次流行。方法对山西省疾病预防控制中心(CDC)送检的正常成年人血清标本44份,首都医科大学附属宣武医院住院SARS患者血清标本62份,宁夏回族自治区CDC送检SARS患者及疑似患者血清28份,分别采用三种不同原理的间接ELISA试剂进行抗体检测:①美国CDC采用全病毒灭活抗原包被,检测血清IgA、IgM、IgG抗体的试剂;②国内某公司采用全病毒灭活抗原包被,检测血清IgG及IgM抗体试剂;③基因工程表达并纯化刺突蛋白(spikeprotein,S蛋白)和核衣壳蛋白(nucleocapsidprotein,N蛋白)抗原包被,检测血清中IgM及IgG抗体的试剂。结果通过比较研究显示:试剂①与试剂③的特异性较高,3种试剂的敏感性有较高的一致性。结论由于全病毒裂解抽提液作包被抗原其生产过程存在生物安全隐患,要求条件高,所以基因工程表达并纯化的蛋白来制备SARS冠状病毒抗体检测试剂有自身的优越性。由于N蛋白具有较强的免疫原性,在各毒株之间的变异又很小,因此以体外基因重组N蛋白代替全病毒裂解液蛋白,是SARS抗体检测试剂的发展方向。     

小儿血清SARS冠状病毒交叉抗体的筛查

目的：在非SARS小儿血清中筛查SARS冠状病毒交叉抗体。方法：用ELISA和RT-PCR方法对无SARS临床表现的住院小儿患者进行SARS冠状病毒RNA及抗SARS冠状病毒多克隆抗体IgG的检测。再对SARS IgG可疑阳性血清利用蛋白芯片方法进行SARS冠状病毒成份蛋白3CL、N、M、S1、S2、S3抗体的分析。结果：在190例非SARS患儿血清中，检出IgG多克隆抗体可疑阳性20例。SARS冠状病毒成分蛋白抗体分析发现N蛋白抗1例，抗M蛋白抗体阳性1例，抗N、M抗体同时阳性1例。结论：在部分非SARS小儿体内可能存在有抗SARS冠状病毒的交叉抗体。     

应用ELISA检测SARS冠状病毒特异性抗体

陕西省自2003年4月21日发现首例临床诊断SARS病例。到6月2日累计发现SARS临床诊断病例12例(其中包括1例本地医务人员)，疑似病例67例(最终被排除)。同期还有数10例进行医学留验的发热病人。为了探索SARS特异性诊断方法，了解SARS抗体在人体内的消长规律。我们开展了SARS血清学的诊断研究。现将结果报告如下。     

SARS患者7年随访血清抗体变化规律及胃肠道免疫组化研究

目的 连续7年随访严重急性呼吸综合征(SARS)患者血清特异性IgM、IgG及N蛋白抗体滴度变化,应用胃肠镜观察胃肠道的病理改变并进行免疫组织化学研究.方法 应用免疫荧光(IFA)和双抗原夹心ELISA方法,对SARS患者发病1年后采用每隔1年检测一次血清SARS病毒(SARS-CoV)特异性IgM、IgG及N蛋白抗体滴度;用抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体对SARS恢复期患者胃肠道组织进行免疫组化研究.结果 14例SARS患者特异性IgG抗体1年后平均滴度为1/71(95%CI:1/58～1/85),连续追踪7年呈下降趋势,7年后大部分患者IgG抗体滴度消失,特异性IgM抗体1年后消失,N蛋白抗体1年后平均滴度为1/146(95%CI:1/122～1/171),与IgG抗体变化同时呈下降趋势.7年后其中9例患者检测N蛋白抗体全部为阴性,另5例临床症状较重的患者,N蛋白抗体仍检测阳性,其中3例N蛋白抗体滴度维持在1/156～1/210之间,2例N蛋白抗体滴度接近正常.该5例患者行胃肠镜检测和细胞免疫组化试验,血中N蛋白抗体检测阳性的3例患者胃组织黏液腺上皮细胞免疫组化呈阳性表达,大部呈胞浆着色.其中1例患者在肠组织浆液柱状上皮及间质细胞亦有表达,另2例血清N蛋白抗体检测接近正常的患者,细胞免疫组化为阴性.5例患者病理活检:1例明确诊断为"胃印戒细胞癌并直肠多发转移"、1例"胃息肉"、1例"浅表性胃窦炎",其余2例正常.结论 SARS患者血清特异性IgM、IgG、N蛋白抗体在恢复期呈下降趋势,7年后大部分消失;N蛋白抗体变化规律与病情轻重程度有关.     

对上海首例传染性非典型肺炎患者的流行病学调查

2003年，传染性非典型肺炎(WHO称SARS)肆虐全国乃至全球，由于该病无特殊治疗和预防方法，传播途径简单，危及患生命，对社会造成严重威胁。如何早期发现、早期诊断、早期报告、早期隔离、早期治疗，对防止二代SARS的发生和控制爆发流行有着极其重要作用。本对上海第一例SARS确诊病例的临床资料进行回顾性分析，旨在通过流行病学调查，从中更多地吸取经验教训。     

SARS患者7年随访血清抗体变化规律及胃肠道免疫组化研究

目的 连续7年随访严重急性呼吸综合征(SARS)患者血清特异性IgM、IgG及N蛋白抗体滴度变化,应用胃肠镜观察胃肠道的病理改变并进行免疫组织化学研究.方法 应用免疫荧光(IFA)和双抗原夹心ELISA方法,对SARS患者发病1年后采用每隔1年检测一次血清SARS病毒(SARS-CoV)特异性IgM、IgG及N蛋白抗体滴度;用抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体对SARS恢复期患者胃肠道组织进行免疫组化研究.结果 14例SARS患者特异性IgG抗体1年后平均滴度为1/71(95%CI:1/58～1/85),连续追踪7年呈下降趋势,7年后大部分患者IgG抗体滴度消失,特异性IgM抗体1年后消失,N蛋白抗体1年后平均滴度为1/146(95%CI:1/122～1/171),与IgG抗体变化同时呈下降趋势.7年后其中9例患者检测N蛋白抗体全部为阴性,另5例临床症状较重的患者,N蛋白抗体仍检测阳性,其中3例N蛋白抗体滴度维持在1/156～1/210之间,2例N蛋白抗体滴度接近正常.该5例患者行胃肠镜检测和细胞免疫组化试验,血中N蛋白抗体检测阳性的3例患者胃组织黏液腺上皮细胞免疫组化呈阳性表达,大部呈胞浆着色.其中1例患者在肠组织浆液柱状上皮及间质细胞亦有表达,另2例血清N蛋白抗体检测接近正常的患者,细胞免疫组化为阴性.5例患者病理活检:1例明确诊断为"胃印戒细胞癌并直肠多发转移"、1例"胃息肉"、1例"浅表性胃窦炎",其余2例正常.结论 SARS患者血清特异性IgM、IgG、N蛋白抗体在恢复期呈下降趋势,7年后大部分消失;N蛋白抗体变化规律与病情轻重程度有关.     

SARS患者7年随访血清抗体变化规律及胃肠道免疫组化研究

目的 连续7年随访严重急性呼吸综合征(SARS)患者血清特异性IgM、IgG及N蛋白抗体滴度变化,应用胃肠镜观察胃肠道的病理改变并进行免疫组织化学研究.方法 应用免疫荧光(IFA)和双抗原夹心ELISA方法,对SARS患者发病1年后采用每隔1年检测一次血清SARS病毒(SARS-CoV)特异性IgM、IgG及N蛋白抗体滴度;用抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体对SARS恢复期患者胃肠道组织进行免疫组化研究.结果 14例SARS患者特异性IgG抗体1年后平均滴度为1/71(95%CI:1/58～1/85),连续追踪7年呈下降趋势,7年后大部分患者IgG抗体滴度消失,特异性IgM抗体1年后消失,N蛋白抗体1年后平均滴度为1/146(95%CI:1/122～1/171),与IgG抗体变化同时呈下降趋势.7年后其中9例患者检测N蛋白抗体全部为阴性,另5例临床症状较重的患者,N蛋白抗体仍检测阳性,其中3例N蛋白抗体滴度维持在1/156～1/210之间,2例N蛋白抗体滴度接近正常.该5例患者行胃肠镜检测和细胞免疫组化试验,血中N蛋白抗体检测阳性的3例患者胃组织黏液腺上皮细胞免疫组化呈阳性表达,大部呈胞浆着色.其中1例患者在肠组织浆液柱状上皮及间质细胞亦有表达,另2例血清N蛋白抗体检测接近正常的患者,细胞免疫组化为阴性.5例患者病理活检:1例明确诊断为"胃印戒细胞癌并直肠多发转移"、1例"胃息肉"、1例"浅表性胃窦炎",其余2例正常.结论 SARS患者血清特异性IgM、IgG、N蛋白抗体在恢复期呈下降趋势,7年后大部分消失;N蛋白抗体变化规律与病情轻重程度有关.     

北京友谊医院2004年SARS科学防控的思考

2004年首都医科大学附属北京友谊医院SARS防控经验表明，领导高度重视，及时启动应急预案，加强发热门诊和发热筛查门诊工作，实行SARS密切接触者的医学观察，加强实验室人体样品和医用垃圾的管理是有效防控SARS的手段。而提高早期诊断水平、建立SARS初筛实验室、加强信息沟通、集中进行医学观察等将进一步提高SARS的防控水平。     

Emerg Infect Dis简讯

N蛋白可作为SARS早期诊断的指标广州第一军医大学、广州疾病预防和控制中心和香港大学等研究者报道该项研究。他们对317例患者的420份血清(出现症状后1～90d的血清进行了N蛋白的检测),结果发现在患者发病后的初始5d检出率是94%,6～10d的检出率是78%,特异性为99.9%。N蛋白在发病后1～18d可检出,21d则完全不能检出,因而研究者认为N蛋白可作为SARS早期诊断的标志。该研究还表明,发病后的初始10d内血清样本的N蛋白检出率高于RT_PCR的检测,提示用捕获ELISA检测血清病毒抗原与核酸扩增检测相比,前者敏感、特异、简便、可靠。2004.10(11)…     

酶联免疫吸附试验间接抗体夹心检测SARS-CoV抗原方法的建立和应用

目的制备和鉴定严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳(N)蛋白单克隆抗体(rnAb)和多克隆抗体建立SARS—CoVN抗原捕获抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)方法用于SARS-CoV感染的早期诊断。方法用基因重组SARS-CoV N蛋白免疫BALB/c小鼠和新西兰大白兔制备mAb和多克隆抗体，采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定，用单克隆抗体与兔多克隆抗体进行配对试验，建立抗原捕获抗体夹心ELISA法测定SARS-CoV N抗原。结果获得9株特异性针对SARS-CoV N蛋白的mAb和高效价的兔多克隆抗体，通过高亲和力的mAb与兔多抗的配对试验，筛选出3株单抗N1E8、N8E1和N10E4混合作为捕获抗体，与兔多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG组合作为测定抗体，建立了抗体夹心ELISA法，测定重组SARS-CoV N蛋白最高灵敏度为50pg／ml，特异性达99．86％，测定420份血清学确诊的SARS患者血清，其中发病1—10天阳性检出率为90.1％，11—20天检出率为23％，21天以上均为阴性，与其他呼吸道病毒和冠状病毒无交叉反应。结论获得特异性好、亲和力高的单克隆抗体和高效价的兔多克隆抗体，经过抗体的配对和优化，建立了一种灵敏度高、特异性强的SARS-CoV抗原的ELISA捕捉法．可应用于SARS早期诊断、溯源及流行病学研究。     

四种试剂盒在SARS实验室早期诊断中的作用分析

目的 比较4种检测严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)基因、抗原和抗体的试剂盒在SARS患者早期实验室诊断的可能作用。方法 用3种酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测SARS-CoV IgG、SARS-CoV IgM和SARS-CoV N蛋白，用荧光定量聚合酶链反应(F-PCR)检测SARS-CoV核酸。结果 根据162份血清的检测结果，发病15天，N抗原的阳性率可达90．2％(55／61)；发病后的第1518天IgG和IgM阳性率为92．8％(13／14)；根据82份咽拭子的检测结果，F-PCR法在发病后15天的阳性率可达56．3％(14／24)，69天可达71．4％(10／14)。结论 除了检测SARS-CoV病毒基因的F-PCR方法以外，对疑似患者血清标本进行N蛋白的检测，具有早期预报意义。     

北京小汤山医院SARS病人早期临床特点及治疗分析

目的 总结北京小汤山医院SARS患者早期临床特点和诊断与治疗的体会。方法对2003年5月收治112例SARS患者．其中医护人员患者11例进行回顾性分析。结果北京小汤山医院接收的部分SARS患者具有明显的医院和家庭聚集的发病特点，有93．75％(105／112)的患者有SARS感染接触史，初期接触地点主要在医院，占79．46％(89／112)，在家中有接触史占9．82％(11／112)，有外出史占4．46％(5／112)，无明显接触史7例，占6．25(7／112)。初期应用糖皮质激素加利巴韦林抗病毒治疗及其他的综合治疗4～7天，均具有较好的治疗效果。除1例患者转中日友好医院外，其余的患者于6月20日前全部康复出院。结论SARS是一种急性自限性传染病，SARS在传播过程中存在着医院与家庭聚集性，主要为呼吸道飞沫传播和密切接触传播?，临床早期以发热为主，胸片表现为斑片状渗出性影，CT检查比胸片更敏感，胸部影像学异常是SARS诊断的必要指标，系列X线平片与CT即可随时观察SARS的病情变化，并可指导治疗，提示预后。约有1／3的患者出现白细胞减少，约1／2患者肝功异常?重型患者有明显的呼吸困难，需无创呼吸机支持。早期糖皮质激素治疗效果好，但用药剂量、时间要根据胸片情况而定。     

SARS冠状病毒S蛋白部分序列的克隆与表达

〔目的〕表达SARS冠状病毒S蛋白部分序列S1。〔方法〕采用逆转录 -多聚酶链反应 (RT -PCR)技术从SARS冠状病毒RNA中扩增出编码S1蛋白的基因片段 ,鉴定后将目的片段与原核表达载体pQE3 0连接 ,构建重组表达质粒pQE3 0 -S1,IPTG诱导该重组质粒转化的大肠杆菌产生S1重组蛋白。〔结果〕(1)RT -PCR扩增获得长约 115 0bp的S1基因片段。 (2 )SDS -PAGE证明 ,S1重组蛋白的分子量约为 40kDa。 (3 )表达的蛋白能与SARS病人血清反应。〔结论〕成功构建了SARS冠状病毒S1蛋白的重组表达质粒 ,该质粒在大肠杆菌中表达了S1蛋白     

抗重组SARS病毒N蛋白单克隆抗体制备及性质初步研究

目的：制备抗重组SARS病毒N蛋白单克隆抗体。方法：重组SARS病毒N蛋白免疫BALB／c雌性小鼠获得免疫脾细胞，利用杂交瘤技术将免疫脾细胞同骨髓瘤Sp2／0细胞融合，间接ELISA方法筛选阳性克隆并扩增。结果：获得了能稳定分泌抗重组SARS病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株，经鉴定分泌的抗体IgG亚类为IgM。结论：制备了鼠源性单克隆抗体并初步研究了该抗体性质。     

SARS-CoV基因编码的主要蛋白研究进展

SARS病毒(SAP6-CoV)是今年SAPS爆发流行的病因,引起全球关注。目前,许多学者对SARS-CoV进行了广泛的研究,本文综述了SARS-CoV基因编码的主要蛋白及其功能的研究进展。     

发热患者SARS冠状病毒抗体分析

目的了解临床发热患者中是否存在严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒（SARS-CoV）隐性感染或亚临床感染。方法对2003年5月～7月，SARS流行期间湖北地区临床发热患者373例血清进行SARS冠状病毒（SARS-CoV）抗体（IgG、IgM、N蛋白抗体）酶联免疫吸附法（ELISA）检测和分子生物学（RT—PCR）检测。结果373例发热患者中，检出冠状病毒抗体阳性者24例，阳性率6．43％（24／373），其中SARSIgG抗体、IgM抗体、N蛋白抗体阳性率分别为0．54％，1．34％和5．09％，但SARS-CoVRT—PCR检测均为阴性。结论临床发热患者可能存在SARS-CoV隐性或亚临床感染，患者体内产生针对SARS-CoV的保护性抗体，应具有免疫力和抵抗力。     

上海地区1株SARS-Cov N基因序列分析及表达

目的通过基因克隆、序列分析以及在大肠埃希菌中的表达和分离纯化，研究上海地区1株SARS-Cov N蛋白编码基因变异情况，为SARS-Cov N蛋白应用于检测SARS感染作基础。方法用RT-PCR法从患者血清样品中扩增获取SARS-Coy N蛋白编码基因，并重组于质粒pGEX-2T。双脱氧法双向测定N基因序列，与GenBank公布的89株SARS-Cov N基因序列比对分析；重组N蛋白编码基因在E.coli中表达，亲和层析法分离纯化表达产物。结果RT-PCR扩增获取SARS-Cov N基因1269bp，测定的核酸序列与GenBank中公布SARS-Cov N基因序列比对，变异位点数1～4bp，其中导致1～3个编码氨基酸突变。重组N基因的表达质粒pGEX-2T／SARS-Cov N转化大肠埃希菌JM109，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，N基因在大肠埃希菌中高效表达，经亲和层析，得纯度〉90％的表达产物，表达的融合蛋白分子量为74000Da。结论上海地区1株SARS-Cov N蛋白编码基因与已公布的89株毒株核酸同源性为99．92％～99．68％，编码氨基酸同源性为99．8％～99．3％；该基因在E．coli中表达，经分离纯化得到高纯度表达产物，为进一步应用于SARS-Coy感染检测打下基础。     

严重急性呼吸综合征患者抗病毒结构蛋白抗体和总抗体的变化规律

严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory svndrome，SARS）的病原体是一种新型的冠状病毒（SARS-CoV），目前已确定有6种主要蛋白。本研究对恢复期SARS患者不同时间段体内抗体进行随访测定，以观察不同时期特异性抗体的动态变化规律，同时还分别检测了SARS-CoV N抗体和SARS-CoV S抗体，并与SARS-CoV IgG总抗体进行比较研究。     

SARS实验室诊断技术

SARS的实验室诊断技术分为常规的临床检验、病原学诊断和血清学诊断。临床检验是SARS诊断的辅助手段，血清学诊断和病原学诊断为临床提供早期或确诊SARS的依据。血清学诊断是检测SARS感染后病人血清中抗SARS冠状病毒抗体反应的情况，病原学诊断是检测SARS病人体内感染病毒的情况。目前应用于检测SARS抗体的血清学方法主要有间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、中和试验、胶体金技术和斑点酶免疫技术等；用于检测SARS的病原学方法主要有组织培养技术分离SARS冠状病毒、分子生物学技术检测SARS冠状病毒核酸、电镜和间接免疫荧光技术检测病人组织或细胞培养物中的病毒等。