单基因遗传病植入前基因分析的研究进展

开展并完善单基因遗传病植入前基因分析对杜绝患儿出生、减少流产带来的伦理学争议和孕妇所面临的身心创伤都具有十分重要的意义。本文就植入前单细胞基因分析技术和策略作一综述。     

Profiler体系用于异基因造血干细胞移植植活测定

目的探讨应用Profiler体系进行短串联重复序列（STR）基因位点检查在异基因造血干细胞移植中的作用。方法采用荧光标记STR-PCR复合扩增、毛细管电泳基因分型技术，对11例异基因造血干细胞移植的供者和受者移植前、后STR基因进行检测，了解造血干细胞的植入情况。结果11例异基因造血干细胞移植受者移植后STR基因型与受者移植前STR基因型不同，与供者STR基因型完全相同，提示供者造血干细胞的植入。结论应用Profiler体系进行STR基因位点检查可用于判断异基因造血干细胞移植的植入情况。     

印迹基因Snrpn在人类卵母细胞及植入前胚胎mRNA表达

目的了解印迹基因Snrpn在人类卵母细胞和植入前胚胎的表达,以分析Snrpn基因表达对人类卵母细胞和早期胚胎发育的影响。方法采用单细胞巢式逆转录多聚酶链式反应(Single Cell Nested RT-PCR)方法,检测人类卵子和植入前各个阶段胚胎的印迹基因Snrpn mRNA表达情况。结果Snrpn在人类卵母细胞GV、MI、MII和植入前胚胎2、4、6、8细胞期都有表达,单卵母细胞扩增成功率为87.5%,单个胚胎为75.8%,平均扩增成功率为79.1%。单个卵母细胞和单个卵裂球扩增成功率无显著性差异(P>0.05),但单卵母细胞较单个卵裂球高。结论建立了比较稳定、可靠的单细胞巢式RT-PCR技术检测基因表达。印迹基因Snrpn在人类卵细胞和植入前胚胎的表达对卵子生长和胚胎发育有着重要意义,为早期胚胎阶段该基因表达正常图谱提供实验依据     

短串联重复序列基因位点检测对移植早期GVHD的诊断价值

目的 探讨短串联重复序列(STR)基因位点检测对移植早期GHVD的诊断价值.方法 10名白血病患者在移植前和移植后1、3、5、7、9、11、14、30 d采用STR检测的方法,并分析其检测结果.结果 其中7名患者STR基因位点检测,从最初的供者基因嵌合状态到30d最后1次检测,都是完全独立植入.另外3名患者嵌合状态从最初为零到无法检出,均有GVHD的发生.结论 STR基因位点检测反应供者基因植入的情况,提示患者复发和GVHD的发生,对临床早期诊断和治疗有一定的指导意义.     

PCR-STR用于异基因造血干细胞移植后的骨髓和外周血嵌合状态的监测及作用

目的用PCR-STR检测观察比较异基因造血干细胞移植术后,骨髓和外周血嵌合状态和植入状态。方法提取17例异基因造血干细胞移植术中的供者外周血及受者移植前后各阶段外周血和骨髓的DNA,PCR PCR-STR检测扩增15个基因位点,和1个性别位点AMEL。用遗传分析仪进行毛细管电泳,确定基因位点,根据基因型的差异选择嵌合率计算公式,分析植入情况和嵌合状态。结果12名患者完全植入,骨髓和外周血的PCR-STR结果一致;1名患者骨髓PCR-STR显示为持续未植入,外周血PCR-STR显示为短期混合植入;4名患者骨髓和外周血PCR-STR显示嵌合状态时间不一致,骨髓PCR-STR显示嵌合状态时间明显早于外周血(P<0.05)。结论PCR-STR是分析异基因造血干细胞移植后供体是否植入的灵敏、准确度高的方法,骨髓嵌合状态的变化的出现早于外周血,混合嵌合状态对白血病复发有预警作用,骨髓嵌合状态的早期变化对实施临床干预治疗尤为重要。     

植入辅助细胞与异基因造血干细胞移植

植入辅助细胞是近来发现的一组独特的细胞群,其在异基因造血干细胞移植中有辅助促进异基因造血干细胞植入,减少移植物抗宿主病的发生及提高移植成功率的作用,具有潜在而广泛的临床应用价值。本文主要介绍植入辅助细胞的特性及最新研究进展。     

ABO血型对异基因造血干细胞移植患者植入的影响探讨

目的探讨ABO同型及3种ABO血型不合对异基因造血干细胞移植患者各系植入的影响,为患者优化移植方案提供依据。方法回顾性分析本院2014年1月~2018年6月期间进行异基因造血干细胞移植患者70例,ABO同型18例,ABO血型不合52例,在确保对比组患者年龄;性别;供/受者亲缘关系;疾病诊断;移植前骨髓造血功能状况;HLA相合情况无差异的情况下,对比分析患者粒系、红系、巨核系植入时间,移植后3个月内红细胞及血小板输注量,ABO血型不合的血型开始转化时间、转化完成时间等指标。研究以上指标在ABO同型及3种ABO血型不合移植中有无差异。结果 70例患者中,ABO同型18例,粒系植入时间12.0(11.0~16.3)d,红系植入时间41.5(35.0~49.0)d,巨核系植入时间19.0(16.0~22.5)d。ABO血型不合52例,移植后血型开始转化时间28.0(22.5~44.0)d,转化完成时间105.5(85.0~141.8)d,粒系植入时间14.5(12.0~16.0)d,红系植入时间61.0(39.5~85.0)d,巨核系植入时间23.0(18.0~31.0)d。ABO同型相较ABO血型不合(主要/主次要双向不合)异基因造血干细胞移植红系植入时间缩短(P<0.05),红细胞及血小板输注量减少(P<0.05),粒系、巨核系植入时间无显著性差异(P>0.05)。ABO血型主要不相合、次要不相合、主次要双向不合异基因造血干细胞移植中的血型转化时间,粒系、红系、巨核系植入时间,红细胞、血小板输注量均无差异(P>0.05)。结论异基因造血干细胞移植优先选择ABO同型供者,在缺乏同型供者情况下,优先选择次要不相合,其次主要不相合、主次要双向不合供者。     

台湾型缺失β地中海贫血的基因诊断、产前诊断和植入前遗传学诊断

目的:对1个罕见缺失型β地中海贫血家系进行基因诊断、产前诊断和胚胎植入前遗传学诊断及分析。方法:采用血常规和血红蛋白电泳分析家系中所有成员外周血的血液学指标,采用聚合酶链反应结合反向点杂交(PCR-RDB)、多重连接探针扩增技术(MLPA)及裂隙聚合酶链反应(gap-PCR)方法进行β地中海贫血基因诊断,采集脐带血或者绒毛膜组织进行产前诊断。囊胚活检滋养外胚层细胞经过全基因组扩增后利用第二代测序技术单体型构建进行胚胎植入前遗传学诊断。结果:基因诊断检测出该家系的先证者为罕见的台湾型缺失β地中海贫血携带者。2次产前诊断结果显示,2个胎儿均为重型β地中海贫血患者。植入前遗传学诊断发现在11个胚胎中检测出6个可供移植胚胎。结论:台湾型缺失是罕见的β地中海贫血缺失类型,当复合β珠蛋白基因其他突变时可导致中重型β地中海贫血。胚胎植入前遗传学诊断是可供地中海贫血高风险家庭选择的一种优生方式。     

植入辅助细胞与异基因造血干细胞移植

植入辅助细胞是近来发现的一组独特的细胞群，其在异基因造血干细胞移植中有辅助促进异基因造血干细胞植入，减少移植物抗宿主病的发生及提高移植成功率的作用，具有潜在而广泛的临床应用价值。本文主要介绍植入辅助细胞的特性及最新研究进展。     

非清髓异基因干细胞移植治疗难治性白血病的临床护理

目的探讨非清髓异基因造血干细胞移植治疗复发难治性白血病的临床护理特点。方法对13例复发难治性白血病患者行非清髓异基因造血干细胞移植的护理进行回顾性分析和总结。结果13例难治性白血病在非清髓异基因造血干细胞移植的过程中（除3例植入失败外），加强预处理相关毒性的预防和护理，重视ABO血型不合引起的造血重建延缓和溶血的现象，定时检测供者造血细胞的植入状况，可以及早发现疾病的复发和移植物被排斥，及时采取措施，从而提高患者的生存率。结论定时检测供者细胞的植入状态，做好预处理相关毒性的预防，重视造血重建，加强移植护理人员的临床观察是极为重要的。     

采用二代测序对α/β复合型地中海贫血夫妇进行胚胎植入前遗传学诊断

目的:探讨二代测序在α/β复合型地中海贫血夫妇胚胎植入前遗传学诊断的应用价值。方法:选择α-珠蛋白基因(HBA1、HBA2)和β-珠蛋白基因(HBB)编码区为目标区域,在基因上下游2M区域内选择高密度紧密连锁的单核苷酸多态位点作为遗传连锁标记,二代测序后选择有效单核苷酸多态位点构建夫妇单体型,确定夫妇携带致病基因的风险染色体。采用二代测序技术对胚胎HBA1、HBA2和HBB直接测序和构建单体型连锁分析进行植入前遗传学诊断。结果:胚胎HBA1、HBA2和HBB直接测序和构建单体型连锁分析结果显示,活检的6个囊胚中2个为α/β复合型地中海贫血,1个为β地中海贫血杂合携带,2个为α地中海贫血杂合携带,1个为中间型α地中海贫血。选择发育良好且植入前遗传学诊断结果提示可以移植的胚胎植入母体子宫后,足月分娩一健康婴儿。结论:采用二代测序技术可对α/β复合型地中海贫血夫妇进行胚胎植入前遗传学诊断,同时可以避免选择非整倍体胚胎而导致的流产问题。     

异基因造血干细胞移植后复发慢性髓系白血病患者嵌合体和融合基因的动态观察

本研究利用STR—PCR结合RT—PCR定量和定性检测异基因造血干细胞移植（allo—HSCT）后患者嵌合体和融合基因的表达，分析其植入和微小残留病变情况，评价其对复发的预测价值。采用STR—PCR结合毛细管电泳进行定量检测嵌合体供体细胞嵌合率，采用RT—PCR方法检测融合基因转录本bcr／abl mRNA。结果表明：4例患者在移植后28天均为100％供者型嵌合，融合基因bcr／abl mRNA均为阴性。但在以后的随访过程中发现4例患者在不同时间出现不稳定混合嵌合（MC）状态（DC为0％-80．4％），融合基因bcr／abl mRNA阳性；其中2例复发后一直处于混合嵌合状态，另外2例在临床干预治疗后又转变为完全嵌合状态，目前处于分子生物学缓解状态。上述4例复发患者均在出现临床症状前发生供体细胞嵌合率（DC）下降；融合基因表达阳性。结论：STR—PCR在敏感范围内，其结果与RT—PCR的结果符合率高，两种技术的结合是一种检测异基因造血干细胞移植后供体是否植入的有效手段，对判断疾病复发及GVHD均有预警作用，对实施临床干预治疗有重要指导价值。     

DNA小卫星多态性用于异基因骨髓移植植入状态分析

近年来异基因骨髓移植已成为治疗顽固性血液疾病和血液恶性肿瘤的有效措施.提供移植后异基因植入状态的有效和客观的实验室分析指标,直接影响着患者的预后和临床的诊治.笔者选用人类基因组具有高度多态性DNA小卫星D1S80、P33.6、ApoB'位点对异基因骨髓移植进行扩增片段长度多态性分析(amplyfication fragment length polymorphism,Amp-FLP),现将结果报道如下.     

微卫星DNA在异基因干细胞移植植入监测中的应用

目的探讨微卫星DNA多态性分析技术在异基因干细胞移植植入监测中的应用。方法对68例异基因干细胞移植的受者进行移植监测。采用荧光标记引物复合扩增15个微卫星DNA多态性进行基因分型，比较受者移植前后的基因型变化。结果经移植后检测微卫星DNA多态性，9例移植后DNA多态性为受者型；55例表现出单一供者型；1例检测出2个供者的混合供者型；3例检测出受者和供者基因型的混合嵌合型。结论复合扩增微卫星DNA技术在异基因干细胞移植植入监测中十分有效，检测方法灵敏、可靠、快速、简便，具有重要的应用价值。     

基因重组人骨形成蛋白2生物学活性及其复合异种骨体内异位植入的成骨活性

目的:观察复合基因重组人骨形成蛋白2异种骨的成骨活性及其量效关系。方法:实验于2001-07/2002-05在安徽医科大学完成。以基因重组人骨形成蛋白-2与去抗原部分脱钙牛松质骨载体复合,制成复合基因重组人骨形成蛋白2的异种骨(基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨)植入小鼠右股部肌袋内。将6周龄雄性BALB/C小鼠144只,随机分成4组,植入含0.4m g基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组;植入含0.1mg基因重组人骨形成蛋白-2/脱钙牛松质骨骨粒组,单纯植入脱钙牛松质骨载体骨粒组,单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组,每组36只。术后7,14,21d取材,通过大体观察、X射线影像学、组织学和骨计量学方法检测各组的诱导成骨活性。结果:144只实验动物在实验过程中无死亡,全部进入结果分析。①单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组于光镜下见大量间充质细胞增殖,局部软骨组织生成,软骨细胞成熟。②脱钙牛松质骨与基因重组人骨形成蛋白2复合后,小牛骨松质结合基因重组人骨形成蛋白2呈实体性疏松绒毛结构,骨松质孔洞内填充云絮状基因重组人骨形成蛋白2物质,两者结合良好。③各组术后不同时间组织学检查结果为:植入含0.4mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组术后7d出现软骨分化的小鼠有5只,苏木精-伊红染色观察,标本大量间充质细胞被诱导分化为软骨细胞,14d有4只出现新骨诱导的现象,出现多处分散的骨软骨组织,多发生于植骨周围,21d见散在软骨岛和稀疏退变小软骨岛,部分小鼠有新骨形成,但无骨髓及板层骨形成。植入含0.1m g基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组术后7d出现软骨分化的小鼠有3只,见少量间充质细胞被诱导分化为软骨细胞,有零星的间充质细胞分化、过渡为软骨细胞;14d有部分标本可见骨及软骨组织,有的可见稀疏小软骨岛存在,21d有4只出现新骨诱导。单纯植入脱钙牛松质骨载体骨粒组主要表现为纤维结缔组织包绕植骨,植骨周围见组织细胞增生。单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组以肌纤维为主,无典型软骨细胞出现。表现为正常横纹肌切面和肌间隔结构。④术后不同时间植入含0.4m g基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组和植入含0.1m g基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组的碱性磷酸酶活性和钙含量均高于对照组,前者高于后者,具有统计学意义(P<0.05)。结论:①基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨是高效诱导成骨材料,经处理的小牛松质骨是良好的缓释载体,提高了基因重组人骨形成蛋白2的骨诱导能力。②复合基因重组人骨形成蛋白2异种骨的成骨活性与基因重组人骨形成蛋白2的含量成正比。     

异基因造血干细胞移植治疗继发性白血病1例及文献复习

目的：探索继发性白血病的治疗。方法：对1例继发性白血病行异基因造血干细胞移植的患者进行病例分析,并复习相关文献。结果：1例继发性白血病患者接受异基因造血干细胞移植后获稳定植入,已随访1年。结论：异基因干细胞移植是治愈继发性白血病的有效方法。     

异基因造血干细胞移植植入失败的危险因素分析

异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)目前已广泛应用于急性白血病(AL)、再生障碍性贫血(AA)等多种血液病的治疗。植入失败是allo-HSCT后的严重并发症。原发性植入失败是指造血未能重建,常需要二次移植;继发性植入失败是指供者细胞成功植入后再次丢失,少数患者可逐步恢复自身造血[1]。恶性血液病中,清髓性预处理(MAC)移植后植入失败的发生率为1%~5%,减低剂量预处理(RIC)移植后植入失败的发生率可达5%~20%[1-2]。目前已报道的植入失败的危险因素包括HLA配型不合、ABO血型不合、RIC、干细胞输注数量较少、供者年龄较大等[3-7]。本研究对298例接受allo-HSCT的血液病患者进行回顾性分析,探讨发生植入失败的危险因素。     

CYP2C19*2、*3基因多态性与氯吡格雷临床疗效相关性的系统评价

目的系统评价心血管疾病患者中植入支架后服用氯吡格雷抗血小板作用效果受CYP2C19*2、*3基因多态性的影响程度,以期为其安全使用提供证据。方法计算机检索EMbase、PubMed、e Cochrane Library、Clinical Trial、CBM以及CNKI数据库,查找有关心血管疾病患者携带CYP2C19*2、*3基因与氯吡格雷疗效关系的观察性研究和临床试验,检索时限均从建库截至2011年11月。对符合条件的研究,由2位研究者按照纳入和排除标准,独立筛选文献、提取资料、评价质量,并交叉核对后,采用RevMan 5.1软件进行Meta分析。结果共纳入13篇文献,包含14个研究(n=36 855)。Meta分析结果显示:植入支架后服用氯吡格雷,CYP2C19*2、*3和CYP2C19*1基因携带者的心血管事件及出血事件发生率差异均无统计学意义,但CYP2C19*2、*3基因携带者植入支架后发生血栓的危险较CYP2C19*1基因携带者明显增加(P<0.000 1),其在1个月内发生支架植入后血栓的相对危险度较CYP2C19*1基因携带者增加了92%(P<0.000 1)。结论在植入支架后使用氯吡格雷的心血管疾病患者中,CYP2C19*2、*3基因携带者比CYP2C19*1基因携带者更易发生支架后血栓,但心血管事件和出血事件发生率相当。鉴于CYP2C19*2、*3基因携带者在植入支架后1个月内形成血栓的风险更大,因此,对拟行PCI手术并用氯吡格雷的患者,我们建议先测CYP2C19基因型,再考虑是否应用氯吡格雷抗血小板预防血栓。     

基因重组人骨形成蛋白2生物学活性及其复合异种骨体内异位植入的成骨活性

目的：观察复合基因重组人骨形成蛋白2异种骨的成骨活性及其量效关系.方法：实验于2001-07/2002-05在安徽医科大学完成.以基因重组人骨形成蛋白-2与去抗原部分脱钙牛松质骨载体复合,制成复合基因重组人骨形成蛋白2的异种骨（基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨）植入小鼠右股部肌袋内.将6周龄雄性BALB/C小鼠144只,随机分成4组,植入含0.4 mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组;植入含0.1 mg基因重组人骨形成蛋白-2/脱钙牛松质骨骨粒组,单纯植入脱钙牛松质骨载体骨粒组,单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组,每组36只.术后7,14,21 d取材,通过大体观察、X射线影像学、组织学和骨计量学方法检测各组的诱导成骨活性.结果：144只实验动物在实验过程中无死亡,全部进入结果分析.①单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组于光镜下见大量间充质细胞增殖,局部软骨组织生成,软骨细胞成熟.②脱钙牛松质骨与基因重组人骨形成蛋白2复合后,小牛骨松质结合基因重组人骨形成蛋白2呈实体性疏松绒毛结构,骨松质孔洞内填充云絮状基因重组人骨形成蛋白2物质,两者结合良好.③各组术后不同时间组织学检查结果为：植入含0.4 mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组术后7 d出现软骨分化的小鼠有5只,苏木精-伊红染色观察,标本大量间充质细胞被诱导分化为软骨细胞,14 d有4只出现新骨诱导的现象,出现多处分散的骨软骨组织,多发生于植骨周围,21 d见散在软骨岛和稀疏退变小软骨岛,部分小鼠有新骨形成,但无骨髓及板层骨形成.植入含0.1 mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组术后7 d出现软骨分化的小鼠有3只,见少量间充质细胞被诱导分化为软骨细胞,有零星的间充质细胞分化、过渡为软骨细胞;14 d有部分标本可见骨及软骨组织,有的可见稀疏小软骨岛存在,21 d有4只出现新骨诱导.单纯植入脱钙牛松质骨载体骨粒组主要表现为纤维结缔组织包绕植骨,植骨周围见组织细胞增生.单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组以肌纤维为主,无典型软骨细胞出现.表现为正常横纹肌切面和肌间隔结构.④术后不同时间植入含0.4 mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组和植入含0.1 mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组的碱性磷酸酶活性和钙含量均高于对照组,前者高于后者,具有统计学意义（P＜0.05）.结论：①基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨是高效诱导成骨材料,经处理的小牛松质骨是良好的缓释载体,提高了基因重组人骨形成蛋白2的骨诱导能力.②复合基因重组人骨形成蛋白2异种骨的成骨活性与基因重组人骨形成蛋白2的含量成正比.     

1例白血病合并截瘫行异基因造血干细胞移植患者的护理

目的探讨急性淋巴细胞白血病合并截瘫患者行异基因造血干细胞移植的可行性和护理措施。方法通过术前认真护理讨论和入仓前准备,制订个性化护理方案,实施全程全环境保护,给予精心细致的基础护理,加强心理护理,防止并发症发生等措施,以确保造血干细胞移植的成功。结果造血干细胞于植入后15d后成活。在造血干细胞移植期间,无压疮和外源性感染发生。结论急性淋巴细胞白血病合并截瘫患者行异基因造血干细胞移植是可行的。