人血小板源性生长因子B基因的体外扩增以及克隆和鉴定

目的：自行构建人血小板源性生长因子B（PDGF-B）真核表达载体，为人血小板源性生长因子B基因转染真核细胞的实验研究及基因治疗奠定基础。方法：实验于2002-01／2005-01在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①根据GeIlbank的人血小板源性生长因子B的全长基因序列，设计合成一对附加BamHⅠ，XhoⅠ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物。②采用反转录聚合酶链反应从人胎盘mRNA中扩增出人血小板源性生长因子B基因片段，将其插入真核表达载体PcDNA4构建成重组真核表达载体PcDNA4／PDGF-B。⑧经测序鉴定后，再用双酶切和聚合酶链反应对插入片段进行分析和验证。结果：反转录-聚合酶链反应产物经琼脂糖电泳结果显示在预期位置有相对分子质量为725bp的特异性扩增带。②序列分析、双酶切和聚合酶链反应结果证实插入片段序列正确。结论：成功扩增出完整的人血小板源性生长因子B基因，构建了基因重组真核表达载体PcDNA4／PDGF-B。为人及动物细胞的转基因研究，在基因水平改变其遗传性状打下基础。     

骨髓基质干细胞片层复合聚乳酸羟基乙酸支架构建组织工程骨

目的 制备骨髓基质干细胞片层,探讨其对组织工程骨成骨的作用.方法 培养骨髓基质干细胞(BMSCs)并向成骨方向诱导,利用温度反应性培养皿制备骨髓基质干细胞片层,光学及电子显微镜下观察其形态.将经过预处理的三维多孔聚乳酸羟基乙酸(PLGA)支架注射BMSCs悬液并复合干细胞片层后植入犬左侧下颌骨缺损,为实验侧;将未复合细胞片层的支架植入右侧,为对照侧.16周后,对新生骨行影像学及组织学观察分析.结果 片层中细胞排列紧密,生长活跃.实验侧吸光度值高于对照侧(P＜0.05),并可见较多哈弗系统及板层骨样结构.结论 经温度反应性培养皿制备的干细胞片层结合PLGA支架可形成具有板层状结构的组织工程骨.     

常染色体隐性遗传性远端肾小管酸中毒患儿ATP6V0A4和ATP6V1B1基因突变分析

目的 分析常染色体隐性遗传性远端肾小管酸中毒(rdRTA)患儿ATP6V0A4和ATP6V1B1基因的突变,进行基因型和表型的相关性研究.方法 PCR扩增基因组DNA,直接测序分析来自3个家系3例患儿的ATP6V0A4和ATP6V1B1基因的突变位点,选取不相关的100例健康人作为对照.结果 1例患儿携带ATP6V0A4基因的1个新的纯合无义突变(p.R194X);1例患儿携带ATP6V1B1基因1个新的杂合无义突变(p.R114X)和1个已经报道过的杂合突变p.I386fsX441;第3例患儿未发现以上2个基因的突变.结论 对中国rdRTA患者基因突变分析有利于了解该类疾病的基因型和表型的相关性,增强临床医生对该类疾病的认识和治疗.     

急性淋巴细胞白血病并EB病毒感染的临床分析

目的 探讨EB病毒(EBV)在急性淋巴细胞白血病(ALL)儿童中的感染及其临床意义.方法采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术检测EBV DNA,ELISA法检测EB病毒衣壳抗原IgM抗体(EBV-CA-IgM),共检测47例.其中新发45例,复发2例;年龄0～14岁[(8.06±3.71)岁].另取14例健康儿童作为健康对照组.男9例,女5例;年龄2～10岁[(7.24±2.54)岁].结合临床表现、诱导治疗骨髓完全缓解(CR)率、形态学CR状态下的微小残留病(MRD)、复发率及无事件生存(EFS)率等分析ALL患儿中EBV感染情况及其临床意义.结果 47例ALL患儿中检出EBV感染15例(31.9%),其中11例(23.40%)检出EBV DNA,EBV DNA水平为(3.28±5.95)×108copy·L-1;14例健康对照组外周血未检测到EBV DNA及EBV-CA-IgM.ALL中EBV感染组与非EBV感染组白细胞数分别为(78.00±58.38)×109 L-1、(27.46±60.10)×109 L-1(t=2.70,P=0.01),诱导治疗CR率分别为 46.7%、87.5%(P<0.01),MRD>10-3分别为90.0%、26.1%(P<0.01),复发率分别为53.8%、13.8%(P<0.01),EFS率分别为 23.1%、82.8%(P<0.01).结论 ALL并EBV感染具有高白细胞数、低诱导治疗CR率、高复发率、低EFS率,提示EBV感染可能参与儿童ALL的发生发展过程,亟待改善EBV感染ALL的治疗方法.     

不同转移潜能人神经母细胞瘤细胞系趋化因子受体CXCR4的表达及对瘤细胞趋化作用的影响

目的 以自建的人神经母细胞瘤转移瘤(QDDQ-NM1)及原位瘤(QDDQ-NM2)细胞系的细胞为研究对象,探讨CXCR4在不同转移潜能人神经母细胞瘤细胞系细胞中的表达情况及其对瘤细胞趋化作用的影响.方法 采用RT-PCR检测两神经母细胞瘤细胞系细胞CXCR4 mRNA的表达;流式细胞仪直接免疫荧光法检测两细胞系细胞膜表面CXCR4蛋白的表达;通过趋化和趋化抑制实验观察CXCR4特异性配体CXCL12对QDDQ-NM1和QDDQ-NM2细胞系瘤细胞的趋化作用.结果 RT-PCR显示QDDQ-NM1细胞系CXCR4mRNA的相对含量为0.57±0.08,QDDQ-NM2细胞系为0.29±0.05,两者比较差异有统计学意义(P=0.005＜0.05),流式细胞仪直接免疫荧光法检测两细胞系细胞膜表面CXCR4蛋白表达的阳性率分别为(64.59±1.57)%和(36.72±0.57)%,两者的差异有统计学意义(P=0.00＜0.05),CXCR4特异性配体CXCL12可在一定范围内呈浓度依赖性的趋化QDDQ-NM1和QDDQ-NM2细胞系细胞的迁移,以100 ng/ml的效果较为明显,两细胞系迁移到聚碳酸酯膜下的细胞数差异有统计学意义(P＜0.05).CXCR4特异性拮抗剂AMD3100能有效抑制这种趋化作用(P＜0.05).结论 QDDQ-NM1细胞系的细胞功能性高表达趋化因子受体CXCR4,可能与人神经母细胞瘤QDDQ-NM1细胞系细胞的体外高转移潜能有关.

Abstract：

Objective To study the expression of functional chemokine receptor CXCR4 and its effects on the metastatic potential of human neuroblastoma.Methods Two human neuroblastoma cell lines were used in this study,including QDDQ-NM1 with high metastatic potential and QDDQ-NM2 with low metastatic potential.The expression of CXCR4 was explored at mRNA level using RT-PCR,and the protein level by flow cytometry.Chemotaxis assay was also performed to study the migratory response of QDDQ-NM1 and QDDQ-NM2 to CXCR4 ligand CXCL12.Results The mRNA of CXCR4 was higher in QDDQ-NM1 group than that in QDDQ-NM2 group (0.57±0.08 vs 0.29±0.05,P =0.005).The expression of CXCR4 on QDDQ-NM1 group was also higher than that in QDDQ-NM2 group [(64.59 ±1.57) % vs (36.72 ± 0.57) %,P＜0.05] The QDDQ-NM1 cells exhibited stronger migratory response to CXCL12 in a concentration dependent manner (P＜0.05),and the response peaked to CXCL12 at 100 ng/ml.AMD3100,a specific CXCR4 antagonist,could reverse the tumor's migratory response to CXCL12.Conclusions The expression of CXCR4 is associated with the metastatic potential of human neuroblastoma.     

缺氧诱导胶质瘤干细胞向血管内皮细胞分化潜能的实验研究

胶质瘤占脑内肿瘤的40％ ～ 45％,具有高侵袭性、高度增殖性,传统手术加放化疗等综合治疗手段主要针对的是肿瘤细胞,疗效不佳[1-3].根据肿瘤的生长、侵袭有赖于肿瘤血管生成的理论产生了抗肿瘤血管生成治疗肿瘤策略,但目前常规的抗肿瘤血管生成治疗效果仍不尽人意[4 ],说明可能存在其他的肿瘤血管生成的机制或其他影响肿瘤血管生成的因素.缺氧可上调人血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体(VEGFR)的表达,而VEGF是刺激肿瘤血管生成最关键的生长因子,本研究在缺氧条件下培养脑胶质瘤干细胞,探讨其与肿瘤血管生成的关系,为改进抗肿瘤血管生成策略提供新的思路.     

转化生长因子β3基因转染兔骨髓间充质干细胞诱导其向软骨表型的分化

背景：内源性诱导软骨分为就是通过一定的载体将目的基因整合入干细胞内,使其自行分泌诱导因子诱导自身进行分化。 目的：观察将转化生长因子β3通过腺相关病毒载体转染诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨表型转化的能力。 方法：取体外培养的第3代骨髓间充质干细胞进行重组腺相关病毒转染,将转染后3,6,9,12 d细胞裂解提取蛋白进行酶联免疫检测目的蛋白转化生长因子β3的体外表达。RT-PCR,免疫印迹western blot分别从基因和蛋白水平上检测1,2周Ⅱ型胶原的表达,甲苯胺蓝染色检测1,2周蛋白多糖的表达。 结果与结论：重组腺相关病毒转染后,骨髓间充质干细胞可以较稳定的表达目的蛋白转化生长因子β3,并且转染成功的骨髓间充质干细胞较阴性对照组能够更好的向软骨表型转化。证实转化生长因子β3可以腺相关病毒为载体转染骨髓间充质干细胞并诱导其向软骨表型分化。     

锁骨下静脉置管162例临床护理

2006年6月～2010年6月,我们对162例中晚期肿瘤患者行锁骨下静脉置管,经精心护理,取得满意效果.现将护理体会报告如下. 1 临床资料 本组中晚期肿瘤患者162例,男97例,女65例;年龄46～99岁,平均61.6岁.162例置管时间15～145 d,平均62.5 d.置管1次155例,置管2次7例;发生导管堵塞3例(均为1次堵塞);导管脱出2例.无导管相关性感染发生.     

p21WAF1与p27KIP1真核双表达载体的构建鉴定及在胃癌细胞中的表达

目的 构建p21WAF1与p27KIP1真核双表达载体,体外转染胃癌7901细胞,观察其在胃癌细胞中的表达及相关特性.方法 提取人全血总RNA,利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增p21WAF1和p27WAF1基因并将其分别克隆到真核双表达载体pIRES中构建重组质粒pIPES-p27KIP1-p21WAF1,经酶切和测序鉴定重组质粒.脂质体介导重组质粒plRES-p27KIP1.p21WAF1"转染胃癌7901细胞,收集并提取转染后12、24、48、72 h和5 d各细胞的总RNA,逆转录成cDNA,荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测各细胞中p21WAF1和p27KIP1在RNA水平的表达.带有绿色荧光蛋白的pIRES-EGFP作为对照.结果 RT-PCR扩增分别获得约500和600 bp大小的产物,重组质粒pIRES-p27KIP1.p21WAF1经酶切和测序鉴定证实为p21WAF1和p27KIP1基因.转染胃癌7901细胞48 h时转染率为68%.与空质粒对照组比较,重组质粒转染胃癌7901细胞12、24、48、72 h和5 d后FQ-PCR证实p27KIP1的Ct值(cycle threshold,Ct)分别减少8.2、10、10、7.4和6.7,p21WAF1的Ct值分别减少7.4、8.2、8.2、6.3和5.70其中24 h和48 h的Ct值减少最大.结论 真核双表达载体pIRES-p27KIP1.p21WAF1构建成功并能在胃癌7901细胞内高效表达.