逆转录-荧光实时定量PCR法快速测定肠道病毒71型病毒滴度

目的 建立一种肠道病毒71型(EV71)病毒滴度快速测定法.方法 以TCID50法测定的EV71病毒样品作为滴度检测参考品,建立EV71病毒滴度的逆转录-荧光实时定量PCR测定方法.通过滴度参考品和待测病毒样品的Ct值计算待测样品中的病毒滴度,并对该检测法进行特异性、重复性验证.结果 所得检测方法可以用于EV71病毒滴度的快速检测.本测定法具有较好的线性,线性范围为lgTCID50 2.61～8.61,相关系数R2为0.9881;特异性和重复性较好,与TCID50法检测之间具有较好的一致性,变异系数(CV)＜5％.结论 所建立的逆转录-荧光实时定量PCR法线性范围广,具有较好的重复性和特异性,可用于EV71样品病毒滴度的快速测定.     

HMGB1对HPV16型重组腺病毒载体疫苗免疫效果的影响及机制研究

目的 探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)分子与人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7重组腺病毒载体疫苗免疫效果的关系及机制。方法 通过TC-1细胞移植诱导建立小鼠肿瘤模型,在接种HPV重组腺病毒载体疫苗的同时,给与HMGB1特异性拮抗剂HMGB1 A box注射,开展肿瘤抑制试验、小鼠免疫状态观察、肿瘤相关信号检测等研究。结果 A box蛋白与疫苗联用,即可显著降低模型小鼠HMGB1血清水平,抑制肿瘤组织中NF-kB的mRNA高表达,提高疫苗的抗肿瘤活性。同时,它还可减少IL-4、促进IFN-g产生,使体内免疫平衡由Th2向Th1偏移。虽然A box对于Bax的影响并不显著,但在接种疫苗并注射A box蛋白后,由肿瘤引起的NF-kB、Bcl-2、c-IAP2、VEGF、MMP-9的表达提高、Bax表达降低均得到显著扭转。结论 HMGB1分子可以削弱HPV重组腺病毒载体疫苗的免疫效果,其机制可能是HMGB1在调节免疫平衡状态及控制肿瘤细胞的凋亡、浸润、转移等多层面均能参与并发挥重要作用。     

重组4-1BB配体对治疗性重组人乳头瘤病毒16型蛋白疫苗的佐剂作用

目的 研究重组4-1BB配体(recombinant 4-1BB ligand,r4-1BBL)作为佐剂对治疗性重组人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus-16,HPV16)蛋白疫苗(HPV16蛋白疫苗)免疫效果的影响.方法 对4-1BBL胞外功能区进行密码子优化,并通过NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点定向插入pET28a表达载体.将获得的重组表达载体转化至大肠埃希菌BL21 (DE3),并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白表达.用蛋白质印迹法对重组蛋白进行鉴定,并用非还原性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和电子显微镜分析重组蛋白结构.用CCK-8试剂盒检测纯化r4-1BBL对小鼠T细胞体外增殖的影响.同时将r4-1BBL与HPV16蛋白疫苗联合免疫C57BL/6小鼠,用酶联免疫斑点试验检测小鼠的细胞免疫应答水平,观察r4-1BBL对HPV16蛋白疫苗抑制肿瘤生长的影响.结果 密码子优化的4-1BBL胞外功能区能在重组表达载体中表达,且表达产物同时以包涵体和可溶性形式存在.可溶性产物的结构主要为二聚体,电子显微镜下可以观察到类似亚单位的结构.纯化r4-1BBL可促进小鼠脾淋巴细胞的体外增殖.与单纯HPV16蛋白疫苗相比,r4-1BBL联合HPV16蛋白疫苗能诱导更强的特异性细胞免疫应答(t=3.525,P=0.024)和产生更明显的肿瘤生长抑制作用(t=2.534,P=0.021).结论 r4-1BBL能在小鼠中提高HPV16蛋白疫苗的免疫效果,具有作为HPV16蛋白疫苗佐剂的潜力.     

细胞生长促进试验筛选新生牛血清

目的建立适合人二倍体细胞培养血清的筛选方法。方法通过测定细胞倍增时间和进行细胞生长促进试验对15批次的新生牛血清作了筛选，并将筛选出的11批次血清用于大规模细胞培养，观察细胞的生长维持情况。结果发现细胞倍增时间与相对生长率无明显相关性（P〉0．05）。在大规模细胞培养中，相对生长率97％以上的血清更适合二倍体细胞生长。结论细胞生长促进试验比细胞倍增时间测定更能客观地反映血清促人二倍体细胞的生长能力。细胞生长促进试验可能是较佳的，筛选适合人二倍体细胞培养的血清的方法。     

太冲穴及常见配伍运用规律的文献研究

目的分析太冲穴及其常见配伍的运用规律。方法对针刺太冲穴现代临床文献进行收集、整理,统计太冲穴的文献频次、文献比例,常用配伍腧穴及这些常用配伍的文献频次,分析太冲穴运用、常见配伍及其运用规律。结果包含太冲穴的针刺处方中周围性面瘫、原发性高血压、抑郁文献频次最高,太冲穴单穴多运用于原发性高血压,太冲穴常见配伍依次为:合谷、足三里、三阴交。结论包含太冲穴的针刺处方中周围性面瘫、原发性高血压、抑郁文献频次最高,太冲穴单穴多运用于原发性高血压,太冲穴常见配伍依次为:合谷、足三里、三阴交。     

冻干甲型肝炎减毒活疫苗(H2株)诱导的人体特异性细胞免疫应答

目的 了解接种冻干甲型肝炎(甲肝)减毒活疫苗[Hepatitis A(Live) Vaccine,Freeze-dried;HepA]后,机体能否产生特异性细胞免疫应答.方法 研究对象经HepA(H2株)1剂次免疫,流式法检测淋巴细胞亚群CD2 、CD4 、CD8 的百分率及表达干扰素(IFN)-γ及白细胞介素(IL)-4的阳性细胞百分率;T淋巴细胞的特异性增殖试验(MTT法)检测T淋巴细胞增殖反应;酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测淋巴细胞的IFN-γ分泌能力.结果 接种后2周,CD4 上升,以4周上升为显著,与接种前相比,差异有显著的统计学意义(t=2.571,P<0.05);接种后4周～3个月,淋巴细胞对特异性刺激物甲肝病毒的反应都有明显增强,与接种前相比,差异均有非常显著的统计学意义(t=3.215～3.959,P均<0.01);接种后2周,表达IL-4和IFN-γ的阳性细胞百分率上升,以IL-4为明显,与接种前相比,差异有显著的统计学意义(t=2.197,P<0.05);接种后3年,用ELISPOT法检测IFN-γ,阳性率为57.1%(8/14).结论 接种HepA(H2株)后,机体能有效地产生特异性细胞免疫应答.     

Vero细胞肠道病毒71型灭活疫苗的纯化及鉴定

目的建立Vero细胞肠道病毒71型(EV71)灭活疫苗的纯化工艺。方法病毒收获液经离心澄清、福尔马林灭活和超滤浓缩后,采用Sephacryl S-400 HR凝胶过滤层析和Source 30Q离子交换层析2步层析法纯化EV71,进行各项检定及分析后除菌过滤。结果经纯化的疫苗各项纯化指标均符合中国药典2010年版的要求,杂蛋白去除率>99.9%;病毒纯化液在电镜下观察到典型的EV71病毒颗粒,经SDS-PAGE及Western blot分析,检测到与文献报道大小相符的EV71 VP1、VP2、VP3及特异性免疫反应;制备成疫苗后免疫大鼠能产生特异性中和抗体。结论本实验建立了Vero细胞的EV71灭活疫苗的纯化工艺,纯化后制备的EV71灭活疫苗具有较好的免疫原性。     

太冲穴治疗痛证临床及机理浅析

为发掘太冲穴临床价值,探讨太冲治痛机理,对其治疗痛证文献进行整理、分析,发现古代、现代临床太冲穴在痛证应用上有所不同,古代以下肢疼痛为主,现代以头面部疼痛为主.其治痛机理中医主要是经穴循经性,西医目前主要集中在神经生化及影像方面.太冲穴治痛体现了循经取穴治痛的规律;古代偏重其近治作用,现代偏重其循经远治作用,其治痛范围有所扩大,可能通过经穴的循经作用、调节神经介质及影响中枢相关脑区活动达到镇痛作用.     

牛血清蛋白含量的高低对细胞生长的影响

许多生物技术科学研究和产品的生产都离不开细胞培养。培养液是进行细胞培养的关键，而培养液的主要成分新生牛血清在细胞生产中使用最为广泛，是目前细胞培养中用量最大的天然培养基，它主要提供维持细胞生长的激素、结合蛋白、粘附蛋白、细胞贴壁因子、蛋白酶抑制剂，对细胞的生长繁殖发挥着至关重要的作用。