当归多糖对D-半乳糖致小鼠胰腺损伤的保护作用

目的 探讨当归多糖（ASP）对D-半乳糖（D-gal）致小鼠胰腺损伤的保护作用。 方法 雄性C57BL/6 J 小鼠随机分为3组,每组10只。D-gal组: 小鼠皮下注射- gal (120 mg/kg, qd×42 d）; ASP+D-gal组: D-gal注射时间与剂量同D-gal模型组,从模型复制第16天起,腹腔注射ASP(40 mg/kg,qd×27 d）;正常对照组: 小鼠皮下注射等量与等时的生理盐水。各组给药完成后第2天检测相关指标,取外周血检测空腹血糖含量并行口服葡萄糖耐量测定（OGTT）;取胰腺称湿重计算脏器指数;制备石蜡切片,HE染色观察胰腺组织病理结构,图像分析法计数胰岛内有核细胞数和相关面积;制备胰腺组织匀浆,检测丙二醛(MDA)含量和总抗氧化能力（T-AOC）。 结果 从注射D-gal第16天开始,腹腔注射ASP共27 d（ASP+D-gal组）,小鼠胰腺湿重与脏器指数明显降低,组织病理损伤减轻;空腹血糖显著下降;在30 min和120 min的OGTT水平差别不明显;OGTT曲线下面积（AUC）降低;胰岛内有核细胞数减少,单个细胞面积减小;T-AOC活性上升,MDA含量下降。 结论 D-gal可致胰腺结构损伤和功能衰退,ASP能拮抗D-gal从而减轻对胰腺的损伤,其机制可能与减轻氧化损伤有关。     

多能干细胞核心调控基因Nanog介导生殖母细胞减数分裂的作用研究

目的 探讨多能干细胞核心调控基因Nanog在原始生殖纽胞(PGCs)向生殖母细胞方向分化过程中的作用.方法 取11.0d胎鼠PGCs,按胚胎干细胞(ES)培养标准进行体外胚胎生殖细胞(EG细胞)培养.采用脂质体方法将Nanog靶向特异性小干扰RNA(siRNA)转染人EG细胞.RT-PCR、免疫荧光法检测siRNA的沉默效率;在倒置相差显微镜下进行体外克隆计数,检测EG细胞增殖未分化状态;TUNEL法和透射电镜检测EG细胞凋亡情况;半定量RT-PCR检测与生殖母细胞减数分裂相关的标志基因(Mvh、Stra8、Sycp3)的mRNA表达.结果 转染siRNA后48h EG细胞Nanog mRNA和蛋白表达明显受抑,典型未分化EG细胞克隆数量显著下降,呈现分化现象,悬浮细胞增多.TUNEL法、透射电镜检测悬浮EG细胞呈现凋亡征象.伴随Nanog表达下调,Mvh、Stra8、Sycp基因mRNA表达上调.结论 到达生殖腺后,多能性PGCs发生生殖母细胞化,开始减数分裂,该过程可能与多能干细胞核心调控基因Nanog的表达下调有关.     

不可逆性电穿孔致山羊肝脏组织凋亡与坏死的实验研究

目的 评价不可逆性电穿孔(IRE)消融山羊肝脏组织的效果,以及消融区域肝细胞坏死、凋亡与电场分布的关系.方法 取4～6月龄山羊作为研究对象,对其给予IRE处理:经彩色超声探头引导电极针经皮定位肝脏,施加120个脉冲电场(固定电压2000V、脉宽100<,μs>、频率lH<,z>).24h后处死动物,取电极针周围肝脏组织...     

人参总皂苷诱导红系血细胞增殖的信号转导

背景: 研究证实多数造血生长因子通过JAKs-STATs途径转导信号,调节血细胞的增殖与分化。人参总皂苷能够促进早期的造血干/祖细胞向红系细胞分化,具有类似造血生长因子的功效,在红系血细胞发生中造血细胞膜表面红细胞生成素受体起着关键性的作用。 目的：通过红细胞生成素及其受体介导的JAK2/STAT5 信号转导途径,分析人参总皂苷定向诱导红系血细胞发生的分子机制。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006-05/2008-10在在重庆医科大学基础医学研究所、组织胚胎学教研室完成。 材料：脐血细胞来源于正常足月妊娠产妇分娩脐带血,由重庆医科大学第一附属医院提供。人参总皂苷由重庆中药研究所惠赠,纯度95%以上,添加MI-1640培养液配成1 g/L的工作液。 方法：①集落形成实验：取5×106 L-1脐血单个核细胞,添加含马血清的RPMI-1640培养液,10,25,50,75,100 mg/L人参总皂苷组分别加入对应终浓度的人参总皂苷,并设立空白对照组。在96孔板上培养,0.2 mL/孔,14 d计数早期红系祖细胞,6 d计数晚期红系祖细胞。②取脐血单个核细胞悬液100 μL(5×108 L-1),进行MTT检测。③分别将0,25,50,100 mg/L人参总皂苷与脐血造血细胞1×109 L-1共培养24 h,进行Western blot检测。④取脐血造血细胞 1×109 L-1,对照组加入含体积分数为10%马血清的RPMI-1640培养液,人参总皂苷组在常规培养体系中加入终浓度25 mg/L人参总皂苷。分别用5 U/mL红细胞生成素诱导0,2,5,30 min后终止反应,进行免疫沉淀检测。 主要观察指标：人参总皂苷刺激红系造血祖细胞增殖的能力,红细胞生成素对脐血细胞增殖的影响,人参总皂苷对造血细胞红细胞生成素受体表达的影响,JAK2、STAT5蛋白酪氨酸磷酸化情况。 结果：10~75 mg/L人参总皂苷均能提高脐血细胞形成早期红系祖细胞、晚期红系祖细胞的集落产率,以25 mg/L提高幅度最为明显。2~50 U/mL红细胞生成素均能促进脐血细胞的增殖,以5 U/mL促进增殖效果最为明显。0~100 mg/L人参总皂苷作用脐血细胞24 h后,红细胞生成素受体的表达无明显变化。人参总皂苷作用造血细胞24 h后,加入红细胞生成素继续刺激0~30 min,JAK2和STAT5的酪氨酸磷酸化程度均明显增强。 结论：人参总皂苷在促进造血细胞增殖的过程中,尽管对造血细胞红细胞生成素受体的表达无明显影响,但可能通过在红细胞生成素受体介导的信号转导过程中增强JAK2和STAT5的酪氨酸磷酸化程度发挥作用。     

慢病毒介导p38MAPK基因沉默对高糖诱导成骨细胞凋亡的影响

目的 观察p38丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)在高糖诱导的MC3T3-E1成骨细胞凋亡中的作用,并探讨其对凋亡相关信号分子caspase-3、bax及bcl-2表达的影响.方法 构建靶向p38MAPK的shRNA慢病毒载体,将体外培养的MC3T3-E1成骨细胞分为正常对照组(A组)、高糖组(B组)、p38MAPK-shRNA慢病毒转染组(C组)、信号转导阻断剂组(D组)和无关shRNA转染组(E组).RT-PCR检测细胞p38MAPK mRNA的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹检测p38MAPK、p-p38 MAPK、caspase-3、bax、bcl-2蛋白水平,透射电镜观察细胞超微结构.结果 构建靶向p38MAPK的shRNA慢病毒载体,并成功导入MC3T3-E1成骨细胞.与高糖组和无关转染组相比,p38MAPK-shRNA转染能显著抑制高糖诱导的MC3T3-E1细胞p38MAPK过度活化,明显减少细胞的凋亡(P＜0.01);同时,p38MAPK-shRNA转染及p38MAPK阻断剂明显降低MC3T3-E1细胞中p38MAPK、p-p38MAPK、caspase-3及促凋亡基因bax蛋白表达,上调凋亡抑制基因bcl-2,与高糖组和无关转染组相比,差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05).结论 慢病毒介导p38MAPK靶向RNA干扰可通过抑制p38MAPK 信号通路的活化,降低p-p38MAPK、caspase-3、bax表达,上调bcl-2表达,最终抑制高糖所诱导的MC3T3-E1成骨细胞的凋亡.

Abstract：

Objective To examine the role of p38MAPK in high glucose-induced apoptosis of osteoblast MC3T3-E1 cell line, and to investigate its effect on the expressions of apoptosis-related molecules including caspase3, bax, and bcl-2. Methods The lentiviral vector containing short hairpin RNA targeting p38MAPK was constructed. The cultured osteoblast MC3T3-E1 cell were divided into 5 groups:normal control group(A group), high glucose group(B group), p38MAPK-shRNA transfection group(C group), signal transduction inhibitor group(D group), and transfection with negative control siRNA group(E group). RT-PCR was used to determine the p38MAPK mRNA expression levels in MC3T3-E1 cells. Flow cytometry(FCM)was employed to detect the cell apoptotic percentage. The protein levels of apoptosis-related molecules p38MAPK, p-p38MAPK, caspase-3, bax, and bcl-2 were assayed by Western blot. Ultrastructural alternation of MC3T3-E1 cell was observed under transmission electron microscopy(TEM). Results The lentiviral vector containing short hairp in RNA targeting p38MAPK was successfully constructed and transfected into MC3T3-E1 cells. RT-PCR result suggested that the siRNA targeting p38MAPK could effectively reduce the p38MAPK mRNA expression level induced by high glucose in MC3T3-E1 cell line. FCM showed siRNA significantly decreased high glucose-induced apoptosis percentage of MC3T3-E1 cells(P＜0.01). Meanwhile, we also found the siRNA significantly attenuated the proteins levels of p38MAPK, p-p38MAPK, caspase-3, and gene bax induced by high glucose in MC3T3-E1 cells, whereas the protein level of gene bcl-2 was enhanced remarkably when compared with high glucose group and negative control siRNA group(P＜0.01, P＜0.05).Conclusion The iRNA targeting p38MAPK suppressed high glucose-induced MC3T3-E1 cell apoptosis via inhibiting the activation of p38MAPK signaling pathway, thereby reducing the expressions levels of p-p38MAPK, caspase-3 and gene bax, and up-regulating the level of gene bcl-2.     

慢性阻塞性肺疾病相关性肺动脉高压的血流动力学和肺功能相关性研究

目的：观察 COPD 相关性肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)患者的血流动力学和肺功能的相关性。方法共入选右心导管确诊的 COPD 相关 PH 患者64例。根据平均肺动脉压和心指数分为2组：36例严重 COPD 相关 PH 和28例非严重 COPD 相关 PH。比较2组患者各项肺功能参数的差异,与血流动力学指标进行相关性分析。结果 COPD 相关 PH 患者的 FVC% pred[(55.03±22.2)%]、FEV1%pred 降低[(31.4±13.1)%];残气量%pred[(184.7±63.4)%]以及气道阻力%pred [(450.9±296.8)%]增高;并伴弥散量%pred[(58.5±31.1)%]降低。无论是肺容量通气指标、气道阻力指标还是弥散功能,严重 COPD 相关 PH 和非严重 PH 2组间差异均无统计学意义。严重 COPD 相关PH 低氧血症明显,PaO 2和 SaO 2较非严重 PH 组分别低10.6 mmHg 及6.3%(95% CI ,-16.1~-5.0;-9.1~-3.5;P <0.01)。COPD 相关 PH 的 PaO 2和 SaO 2和肺动脉平均压负相关。结论COPD 相关 PH 患者存在严重阻塞性通气功能障碍以及中度弥散功能障碍,血流动力学受损程度和两者无明显相关性。但严重 COPD 相关 PH 低氧血症更为显著,提示除了通气弥散功能外,肺血管因素有可能参与其中。     

乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes对内皮细胞增殖的影响及MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路的作用

目的研究人乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的促增殖作用,并初步探讨MAPK/ERK和PI3K/Akt信号转导通路在此过程中的作用。方法低温超速离心及密度梯度离心法提取乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes。采用MTT法分别检测50、100、200、400μg/ml Exosomes对HUVECs促增殖作用的影响,流式细胞仪测定200μg/ml Exosomes对HUVECs细胞周期的影响,Western blotting检测200μg/ml Exosomes诱导下HUVECs细胞内细胞外调节蛋白激酶(ERK)和蛋白激酶B(Akt)蛋白的表达水平。结果乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes可促进HUVECs细胞增殖,且呈时间和剂量依赖性。200μg/ml Exosomes作用HUVECs细胞24h后,S期细胞比例(27.8%±3.37%)较对照组(15.34%±0.71%)增加(P<0.05),G1/S期细胞比例(2.22%±0.37%)与对照组(4.67%±0.47%)比较下降(P<0.05)。Western blotting结果显示,200μg/ml Exosomes作用HUVECs细胞24、48、72h后,磷酸化ERK表达(0.3378±0.0415,0.4967±0.0511,0.9205±0.0462)与磷酸化Akt蛋白表达(0.4091±0.0361,0.5484±0.0382,0.7496±0.0481)与对照组(磷酸化ERK 0.1836±0.0324,磷酸化Akt 0.2582±0.0215)相比有所增加(P<0.05)。结论乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes能促进HUVECs的增殖,其机制可能与细胞周期改变,以及MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路的持续活化有关。     

兔肋软骨膜和肋软骨来源的间充质干细胞的比较

目的 探讨从兔肋软骨膜和肋软骨中分别提取间充质干细胞的方法以及两者间的比较. 方法 取3～4周新西兰大白兔,共20只.酶消化及贴壁培养法分别获取软骨膜细胞和软骨细胞,体外培养观察其生长、形态、表型特征及其诱导成骨、成脂的分化潜能. 结果 从肋软骨膜中分离的原代细胞聚集成团,多为圆形和多边形;从第2代开始细胞以梭形为主,呈漩涡状排列,已传至第15代.从肋软骨中分离的原代细胞连接成片,以铺路石形态为主,第2代和第3代细胞逐渐转变成梭形;但第5代出现细胞老化,只传至第6代.免疫细胞化学染色发现,两种原代细胞均不表达CD29、CD90和CD34,从第2代开始均表达CD29、CD90,仍不表达CD34.原代软骨细胞表达Ⅱ型胶原,第2代细胞弱表达,第3代细胞开始不表达Ⅱ型胶原;而软骨膜细胞不表达Ⅱ型胶原.两种来源的第3代细胞经诱导均可分化为成骨细胞或者脂肪细胞. 结论 从兔肋软骨膜和软骨中均可获得干细胞.软骨细胞在体外可去分化成为干细胞.但软骨膜来源的干细胞的生长明显优于软骨来源的干细胞.