GCN5调控sublytic C5b⁃9诱导大鼠肾小球系膜细胞表达Cyclin D1及致SOX9的乙酰化修饰

目的：探讨GCN5调控sublytic C5b?9刺激大鼠肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell,GMC）诱导Cyclin D1基因表达以及GCN5乙酰化修饰SOX9转录因子的作用。方法：先用Western blot检测Thy?1肾炎（Thy?1 nephritis,Thy?1N）大鼠的肾组织和sublytic C5b?9 刺激的GMC中GCN5、SOX9和Cyclin D1的表达。然后分别将pIRES2?GCN5过表达和shGCN5小干扰质粒或将这些质粒与Cyclin D1启动子质粒行不同组合转染GMC,用荧光素酶报告基因实验和real?time PCR、Western blot检测过表达或沉默GCN5后对Cyclin D1表达的影响。同时用免疫共沉淀（Co?IP）和Western blot检测sublytic C5b?9刺激或分别转染GCN5过表达和酶活性突变质粒（ΔGCN5）的GMC中SOX9的乙酰化修饰。结果：Thy?1N大鼠肾组织和sublytic C5b?9刺激的GMC中GCN5、SOX9、Cyclin D1蛋白水平均明显上调,而过表达GCN5基因能上调Cyclin D1的启动子活性、mRNA和蛋白表达;敲低GCN5表达则得到了相反的结果。此外,sublytic C5b?9刺激和过表达GCN5基因促进了SOX9的乙酰化修饰,而沉默GCN5后则降低了SOX9的乙酰化水平。结论：GCN5可上调GMC中Cyclin D1的表达,并促进SOX9的乙酰化修饰。     

白细胞介素17通过上调肌细胞增强因子2C促进PC9细胞程序性死亡配体1表达

目的 研究白细胞介素17(IL-17)促进PC9细胞表达程序性死亡配体1(PD-L1)的分子调控机制。方法 用IL-17 50μg·L^-1刺激PC9细胞0(细胞对照),1,2,3,6和12 h,用逆转录PCR(RT-PCR)和Western印迹法分别检测PC9细胞肌细胞增强因子2C(MEF2C)和PD-L1 mRNA及蛋白表达。构建pIRES2-MEF2C及其对照质粒pIRES2-EGFP和MEF2C短发夹RNA(shMEF2C)及其对照质粒shCTR,分别转染PC9细胞48 h(shRNA质粒转染后加IL-17刺激3 h),即分pIRES2-EGFP和pIRES2-MEF2C组或shCTR,shCTR+IL-17和shMEF2C-4+IL-17组,同上检测MEF2C和PD-L1 mRNA及蛋白表达。另构建PD-L1启动子全长(pGL3-PD-L1-FL)和不同截短的pGL3-PD-L1-1～pGL3-PD-L1-4质粒。先将pGL3-PD-L1-FL与pIRES2-MEF2C共转染PC9细胞48 h或与shMEF2C-4共转染48 h加IL-17刺激3 h,用双...     

不同诊断标准对心电图诊断低血钾与生化符合率的影响

目的 探讨应用几种不同的诊断标准对于心电图诊断低血钾的价值.方法 选取生化确诊为低血钾的100例患者为研究组,25例血钾及心电图正常者为对照组,分析不同诊断标准下血钾的诊断情况.结果 当U>0.5 T或者T-U融合诊断低血钾的敏感度为72.9%、特异性为97%,这一组合最为合理且同生化检查的符合率高.结论 在对低血钾的诊断上,以U>0.5T或者T-U融合标准诊断敏感性及特异性高,但U波易受多种因素的影响,为此诊断的时候需排除心绞痛、高血压等意外情况所致U波增高的因素,确保诊断效果.     

NF⁃κB p65调控IRF⁃8基因启动子活性及其启动子结合元件的初步鉴定

目的：探讨大鼠核因子?κB（nuclear factor?κB,NF?κB）p65亚基在细胞内过表达和其活性变化对干扰素调节因子?8（interferon regulatory factor?8,IRF?8）基因启动的影响,并初步筛查IRF?8启动子上可能的p65结合元件。方法：采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术扩增大鼠p65基因蛋白编码区（complete sequence coding,CDS）序列,将其插入到空载pIRES2?EGFP质粒中,构建大鼠野生型（wild type,WT）p65过表达质粒（pIRES2?p65 WT）。在此基础上,将p65第535位丝氨酸（serine,S）突变为天冬氨酸（aspartic,D）或丙氨酸（alanine,A）,分别构建p65持续活化突变型质粒（pIRES2?p65 S535D）和p65显性负性突变型质粒（pIRES2?p65 S535A）。之后应用生物信息学软件预测IRF?8基因启动子区p65的结合元件,并据此构建IRF?8启动子全长（full?length,FL）和3个截短的荧光素酶报告质粒,即pGL3?IRF?8?FL（-1 892 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?1（-1 360 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?2（-752 ~ +174 nt）和pGL3?IRF?8?3（-68 ~ +174 nt）。将上述质粒行不同组合共转染人胚肾293T（human embryonic kidney 293T,HEK?293T）细胞,Western blot和荧光素酶实验分别检查p65的表达和IRF?8的启动子活性,并分析IRF?8启动子区可能的p65结合元件。结果：菌液PCR及测序证实上述质粒构建成功。分别将pIRES2?p65 WT、pIRES2?p65 S535D、pIRES2?p65 S535A和pGL3?IRF?8?FL共转染HEK?293T,发现过表达pIRES2?p65 WT或pIRES2?p65 S535D均可明显增加IRF?8启动子活性,且以pIRES2?p65 S535D更为显著;而过表达pIRES2?p65 S535A后,IRF?8启动子活性无明显变化。将pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1~3和pIRES2?p65 S535D共转染HEK?293T后发现,pGL3?IRF?8?3的启动子活性显著低于pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1和pGL3?IRF?8?2,提示大鼠IRF?8启动子-752~68 nt区域可能存在p65结合元件。结论：在HEK?293T细胞内过表达野生型或持续活化突变型p65可显著促进IRF?8基因的启动,且p65与IRF?8启动子的结合元件可能位于-752~-68 nt部位。     

甲状腺功能减退症妇女子代的甲状腺功能、智力和身体发育的研究

目的探讨甲状腺功能减退症妇女对其子代甲状腺功能、智力发育和身体发育情况的影响。方法将2004年7月-2006年1月在笔者所在医院就诊的60例甲状腺功能减退症（甲减）妇女及30例健康妇女的子代分别作为研究组及对照组。甲减妇女确诊后均给予甲状腺激素（优甲乐或甲状腺片）替代治疗。动态测定（至少每月1次）60例甲减母亲妊娠期间的甲功三项（FT3、FT4、TSH）,根据母亲的甲功三项水平将婴儿分为甲减控制良好组（甲功三项控制在正常水平、TPOAb阴性）、甲减控制不佳组（妊娠期间甲功三项有任何异常或TPOAb阳性）。测定三组母亲的婴儿在0、12、24、36个月时的甲状腺功能（FT3、FT4、TSH）、发育商、语言和功能构成、身高及体重等指标。比较三组的甲状腺功能和智力、身体发育有无差异。结果新生儿期甲减控制不佳组的TSH显著高于甲减控制良好组及对照组,血清FT4、FT3、水平显著低于甲减控制良好组及对照组（P〈0．05）。12个月、24个月、36个月三组的TSH、FT4、FT3水平差异无统计学意义（P〉0．05）。甲减控制不佳组的发育商在新生儿期、12个月、24个月、36个月均明显低于甲减控制良好组及对照组（P〈0．05）。甲减控制不佳组的体格发育在新生儿期、12个月、24个月、36个月均滞后于甲减控制良好组及对照组（P〈0．05）。结论甲状腺功能减退症妇女经合理、规范治疗后,在妊娠期间维持甲状腺功能在正常水平（TSH〈2．5mlU／L,TPOAb阴性）,其子代的甲状腺功能、智力及体格发育与健康妇女的子代差异无统计学意义。仍存在甲减或亚临床甲减的妇女其子代可出现短暂的甲状腺功能异常,并较长时间表现有智力和运动、体格发育滞后。提示筛查和积极治疗妊娠早、中期甲状腺功能异常,对优生优育十分必要,加强对患甲状腺疾病母亲及其孩子的管理有重要意义。     

不同来源白念珠菌感染小鼠前后胞外水解酶活力差异

目的 了解白念珠菌进入小鼠宿主前后其分泌胞外水解酶能力是否改变。方法 挑选分泌型天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶、脂肪酶活力无差异的艾滋病、外阴阴道念珠病病患来源和健康人来源白念珠菌,尾静脉注射感染小鼠,分离发病死亡小鼠肾脏菌株,比较感染小鼠前后菌株胞外水解酶活力差异。结果 不同来源菌株感染的小鼠28 d内死亡速率差异显著(χ²=82.5,P<0.05),从高到低依次为艾滋病、外阴阴道念珠病、健康人来源组;各来源菌株感染小鼠后肾脏分离株分泌型天冬氨酸蛋白酶表达水平皆高于感染小鼠前(F=7.89,P<0.05),不同来源区别显著(F=4.96,P<0.05),从高到低依次为艾滋病、外阴阴道念珠病、健康人来源;感染小鼠前均未曾测得磷脂酶活力的各来源菌株中,在感染小鼠后仅艾滋病、外阴阴道念珠病来源组小鼠肾脏分离株可测得磷脂酶活力,但艾滋病、外阴阴道念珠病来源两组间感染小鼠后肾脏分离株磷脂酶活力无显著差异(F=2.54,P>0.05);各来源白念珠菌感染小鼠前后均未测得脂肪酶活力。结论 在宿主体内白念珠菌表达天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶能力相较于体外有增强;在不同宿主环境状态下,白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶和磷脂酶的潜在表达能力有差异,即宿主免疫状态越弱时,白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶潜在表达能力越强。     

Sublytic C5b-9诱导肾小球系膜细胞产生的TSP-1和TGF-β1对其合成FN和collagen Ⅳ的影响

目的:探讨亚溶解型(sublytic)C5b-9复合物刺激大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)后,诱生的血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)与转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对其促进细胞外基质(extracellular matrix,ECM),如纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和 Ⅳ 型胶原蛋白(collagen Ⅳ)合成的影响?方法:体外培养大鼠GMC,进行不同分组处理并给予sublytic C5b-9刺激,然后分别检查受刺激的GMC合成TSP-1和TGF-β1因子水平,同时检测GMC分泌FN和collagen Ⅳ的水平?此外,应用人工合成的TSP-1封闭肽段(GGWSHW)和TGF-β1中和抗体处理培养的大鼠GMC,研究TSP-1和TGF-β1在sublytic C5b-9诱导的GMC分泌上述ECM中的作用及其相互关系?结果:培养的大鼠GMC在sublytic C5b-9刺激后18 h,其FN和collagen Ⅳ表达水平均明显升高?同时,TSP-1蛋白表达和TGF-β1分泌(包括活化的TGF-β1含量)也显著增多?用TSP-1封闭肽段(GGWSHW)处理大鼠GMC后亦能显著抑制由sublytic C5b-9诱导的TGF-β1活化,并减少FN?collagen Ⅳ的产生?同样用TGF-β1中和抗体处理GMC后也能明显抑制由sublytic C5b-9导致的FN?collagen Ⅳ的分泌?结论:体外用sublytic C5b-9刺激大鼠GMC,能诱导其ECM分泌与TSP-1和TGF-β1的合成及活化,而sublytic C5b-9促进GMC分泌ECM的机制可能与其诱导TSP-1合成及活化的TGF-β1存在一定的关系?     

大鼠野生型TRAF6基因和TRAF6 shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠野生型肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)基因及其特异性短发卡状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察其在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达和沉默TRAF6基因的情况?方法:用DNA重组技术将针对大鼠TRAF6基因的CDS区序列(加HA标签)和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGenesil-1/GFP真核表达质粒中?在酶切鉴定及序列测定正确后,用NeonTM电转仪,将上述质粒分别转染入培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查HA-TRAF6融合蛋白的表达情况,同时筛选最有效的TRAF6 shRNA?结果:限制性酶切及核酸序列分析确证,上述TRAF6基因过表达和shRNA表达质粒均构建成功?Western blot显示,构建的pcDNA3.1-HA-TRAF6质粒能在大鼠GMC中表达,且TRAF6 shRNA-1具有最佳的沉默效率?结论:本实验成功构建了大鼠野生型TRAF6真核表达质粒及其特异性的shRNA表达载体,这为今后进一步研究TRAF6基因的生物学功能提供了实验基础?