阿尼昂尼昂病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的 建立阿尼昂尼昂病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法。方法 针对阿尼昂尼昂病毒nsP1基因设计特异性引物和探针,以珠海国际旅行卫生保健中心之前构建的MS2病毒样颗粒为标准品,采用一步法建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的检测下限、特异性、精密度、抗干扰能力、符合率进行评价。结果 建立的阿尼昂尼昂病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法线性良好（线性方程Y=-3.746X+46.174,R²=0.988）,检测下限为10³ copies/mL,低于之前文献报道的检测下限;能特异性地扩增阿尼昂尼昂病毒基因片段,而对其他相关病原体,包括同属于甲病毒属的基孔肯雅病毒、引起类似症状的登革病毒和马雅罗病毒、共用同一媒介宿主的疟原虫等无非特异性扩增;精密度良好,批内精密度测试时Ct值为32.92~35.40,变异系数CV 为2.10%;批间精密度测试时Ct值为31.89~35.49,变异系数CV为3.41%;在存在溶血、脂血等干扰因素时Ct值与正常样本的Ct值差值分别为0.37、0.71,表明其能有效对抗溶血、脂血等干扰因素的影响;盲样检测时能检出4例阳性和12例阴性,同预期结果完全一致,阴阳性符合率可达100%。结论 本研究建立的检测方法,灵敏度高、特异性好、精密度高、抗干扰能力强,可为阿尼昂尼昂病毒检测提供可行的方法。     

2009—2010年珠海口岸入境人员中发热病例流感病毒分子流行病学研究

目的研究2009甲型H1N1流感疫情全球大流行期间珠海口岸入境发热旅客流感病毒的分子流行病学特征。方法选择2009年5月至2010年4月经珠海各口岸入境的976例发热旅客(体温≥37.5℃)为研究对象,采集咽拭子样本并提取病毒核酸,采用3个多重RT-PCR实验进行甲型、乙型和2009新甲型H1N1流感病毒的筛查以及甲型流感病毒的分子分型检测。此外,随机选择8株2009甲型H1N1流感病毒进行HA和NA基因全长RT-PCR扩增和序列分析。采用SPSS17.0软件对流行病学和实验数据进行统计学分析。结果976例发热旅客中检出流感病毒阳性病例331例,其中甲型流感占96.98%(321/331),乙型流感占3.02%(10/331);321例甲型流感病毒分子分型结果为新甲型H1N1流感92例,占28.66%,人季节性H1N1流感65例,占20.25%,人季节性H3N2流感164例,占51.09%。序列分析显示珠海口岸输入性新甲型H1N1流感病毒的HA和NA基因与甲型流感典型毒株A/California/04/2009(H1N1)的同源性分别达到99.86%和99.89%。结论本研究所阐明的珠海口岸流感病毒的分子流行病学特征对于指导国境口岸流感的防控具有重要参考价值。     

珠海口岸出入境人员人间禽流感病毒抗体水平调查

[目的] 调查珠海口岸出入境人员中H5和H92种亚型禽流感病毒血清抗体水平，以了解上述2种禽类甲型流感病毒亚型以往隐性感染情况，为防治人间禽流感提供科学依据。[方法] 采集珠海口岸出入境健康体检人员血清508份，通过血凝抑制试验(HI)进行H5和H9型禽流感病毒抗体检测。[结果] 出入境人员中H9亚型抗体阳性率为9．65％，同时发现有1份血清H5抗体阳性，H5抗体阳性率为0．20％。[结论] H9亚型在出入境健康人群中存在隐性感染；出入境健康人员中H5亚型抗体的存在也应值得注意。     

出口水产养殖场鲜活淡水鱼和塘水中致病性弧菌的调查研究

目的调查出口澳门的水产养殖场的鲜活淡水鱼和塘水中致病性弧菌的分布情况,分析两者间致病性弧菌的检出情况以及与季节的关系,探讨致病性弧菌与人类相关疾患的关系.方法采用增菌分离后生化试验及VITEK全自动生化分析仪,对30份淡水鱼和26份塘水进行致病性弧菌的鉴定.结果在样品中检出15种致病性弧菌,它们是副溶血弧菌、溶藻弧菌、类志贺邻单胞菌、温和气单胞菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、豚鼠气单胞菌、沙鱼弧菌、创伤弧菌等,其中类志贺邻单胞菌、副溶血弧菌、温和气单胞菌、非01群/非O139群霍乱弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌检出率最高.结论鲜活淡水鱼和塘水中普遍存在致病性弧菌,淡水鱼中致病性弧菌的分布与其在塘水中分布是密切相关的,生食或进食未加工熟透的鲜活淡水鱼有可能感染食源性疾病.     

入境船舶饮用水致病性孤菌污染与相关因素

目的：了解珠海口岸入境船舶上饮用水中致病性弧菌污染状况，以及其与船舶卫生管理和卫生处理措施等方面的关系，为检验检疫执法工作和政策的制定提供依据。方法：采集珠海港入境船舶饮用水，对水样进行弧菌科的分离鉴定，并对调查资料进行统计和分析。结果：入境船舶上的饮用水34份，9份检出致病性弧菌，检出率26．47％；检出6种致病性弧菌；船舶卫生状况不同时，其饮用水中致病性弧菌检出率差异有显著性。结论：入境船舶上的饮用水被致病性弧菌污染较严重。有“海水化淡”设备的船舶，可能对降低其饮用水中致病性弧菌检出率有一定作用。建议对入境船舶饮用水的排放加强管理，制定有效的检疫监管措施。     

进出境船舶压舱水致病性弧菌的调查

目的：了解致病性弧菌的存在情况以及其与船舶卫生控制措施和卫生状况间的关系，为传染病监测及制定措施提供科学依据。方法：对珠海港入出境船舶压舱水和饮用水中致病性孤菌进行流行病学调查，采集入出境船舶压舱水、饮用水和珠海港海域海水，对水样进行弧菌的分离鉴定及统计分析。结果：压舱水致病性弧菌检出率为86．20％，海水致病性弧菌检出率为78．13％，入境船舶上的饮用水致病性弧菌检出率为26．47％；入境船舶上饮用水致病性弧菌检出率大大高于管道饮水中检出率；船舶卫生状况不同时，其饮用水中致病性弧菌检出率差异有显著性；在压舱水中检出12种致病性弧菌，其中以深藻弧菌、副溶血弧菌、沙鱼弧菌、创伤弧菌为主要优势菌；分离自压舱水的2株溶血性弧菌中检测到耐热溶血素基因。结论：致病性弧菌广泛分布于压舱水和海水中，制定规范的压舱水卫生管理措施乃当务之急。     

多重PCR与PCR-荧光探针法检测外环境霍乱弧菌的比较研究

目的：对比多重PCR与PCR-荧光探针法从外环境中直接检测霍乱弧菌的效果。方法：收集40份水样和40份水产品样本,再以20份已知特性菌株作对照。将上述样本和菌株进行培养后提取模板,分别进行多重PCR和PCR-荧光探针法检测。结果：两种方法均从40份水样中检出14份非O1非O139群霍乱弧菌,两种方法均能从40份水产品中检出29份O1群霍乱弧菌及3份非O1非O139群霍乱弧菌。以上检出霍乱弧菌均可经血清学试验证实。20份已知特性样本两种方法均鉴定无误,最低检出限均为10^2cfu/ml。结论：两种方法灵敏度和特异度均极高,多重PCR方法因能同时进行致病力的初步判断,检验速度相对较快,成本较为经济而更为实用。     

珠海港进出境船舶压舱水致病性弧菌的流行病学调查结果分析

目的 了解其致病性弧菌的存在情况以及其与船舶卫生控制措施和卫生状况间的关系，为传染病监测及制定防制措施提供科学依据。方法采集珠海港入出境船舶压舱水、饮用水和珠海港海域海水，对水样进行弧菌科的分离鉴定，并对调查资料进行统计和分析。结果压舱水致病性弧菌检出率为86．20％，海水致病性弧菌检出率为78．13％，入境船舶上的饮用水致病性弧菌检出率为26．47％：入境船舶上饮用水致病性弧菌检出率大大高于管道饮用水中检出率；船舶卫生状况不同时，其饮用水中致病性弧菌检出率差异显著。结论致病性弧菌广泛分布于压舱水和海水中，压舱水排放对当地人民身体健康构成更大的威胁，对公共卫生的潜在危害性更大。制定规范的压舱水卫生管理措施乃当务之急。     

一步法多重RT-PCR快速筛查A型、B型和新型甲型H1N1流感病毒

目的 建立能同时筛查A型、B型和新型甲型H1N1流感病毒的多重RT-PCR技术.方法 针对A型流感病毒的M基因、B型流感病毒的NS基因设计通用扩增引物,针对新型甲型H1N1流感病毒的HA基因设计特异性扩增引物,采用一步法建立多重RT-PCR反应体系.通过盲法实验与实时荧光RT-PCR进行比对来评价方法的准确性,并应用于临床评价方法的实用性和有效性.结果 琼脂糖凝胶电泳分析多重RT-PCR产物,结果显示目的扩增片段条带清晰明亮,没有非特异性产物出现,可见该方法扩增效率高,特异性强.50份样本的盲法实验结果显示两种方法检测结果完全一致,符合率为100%.结论 建立的多重RT-PCR方法能通过一次实验快速、准确地同时筛检A型、B型和新型甲型H1N1流感病毒,是一项成本低廉、对流感的疫情监测和早期诊断具有实用价值的筛检技术.

Abstract：

Objective To developed a multiplex RT-PCR assay for simultaneous screening of type A, B and novel A (H1N1)influenza viruses. Methods Two pairs of universal primers in were designed for amplifying the M gene and NS gene of type A and B influenza viruses, respectively. A pair of specific primers of HA gene was designed to detect novel A (H1N1) influenza virus. A one-step method was used to establish the multiplex RT-PCR system. A blinded experiment was carried out to validate the accuracy of this assay in comparison with the results of real-time fluorescence RT-PCR. The clinical practicability and efficacy of this assay was also evaluated. Results The RT-PCR products were analyzed using agarose gel electrophoresis,which yielded distinct bands of the target fragments without non-specific reactions, suggesting the high efficiency and specificity of the multiplex RT-PCR. Blinded study of 50 samples demonstrated a concordance rate of 100%. Conclusion This multiplex RT-PCR assay allows one-step simultaneous detection of type A, B and novel A (H1N1) influenza viruses rapidly and accurately, and provides a valuable low-cost screening technique for influenza epidemic monitoring and early diagnosis.     

食源致病菌96 微孔板DNA 诊断芯片的研制及在一起食物中毒突发事件中的应用

目的研制能同时检测9种常见食源致病菌的96微孔板DNA诊断芯片。方法针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7(Stx1和Stx2)、志贺氏菌、产单核细胞李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌等9种最常见的食源性致病菌,首先选择合适的保守基因,设计种特异性的PCR引物(5'端标记生物素)和检测探针,通过参数优化建立一管多重PCR扩增体系;然后按5×5的阵列格式将探针点制到96微孔板的微孔内,通过条件优化建立稳定的PCR产物与固化探针的微孔杂交体系;采用链霉抗生物素蛋白碱性磷酸酶和化学显色底物NBT/BCIP来检测特异性的PCR杂交产物。结果20株标准菌株验证已建立的食源致病菌微孔板DNA诊断芯片,获得比较特异和稳定的实验结果。在一起食物中毒事件中,该芯片在采样后12h内检出金黄色葡萄球菌,与传统的细菌分离培养和生化鉴定的结果相符。结论本研究建立的新型食源致病菌96微孔板DNA诊断芯片具有快速、准确、自动化和高通量等特点,为快速应对食物中毒等突发公共卫生事件提供了非常有价值的检测技术。