甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌对喹红霉素敏感性分析及其分子分型特点

目的了解酮内酯类抗生素喹红霉素对临床分离甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)的体外药物敏感性,以及MSSA不同分子分型型别与喹红霉素最低抑菌浓度(MIC)值的关系。方法收集深圳市南山医院2011—2015年不同临床标本分离的MSSA118株,用微量肉汤稀释法及K-B纸片法测定MSSA菌株对喹红霉素及其他9种临床常用抗金黄色葡萄球菌药物的MIC值。采用多位点序列分型(MLST)技术将其分为不同基因型,观察MSSA型别与喹红霉素对MSSA MIC值的关系。结果 MSSA对常用抗革兰阳性菌药物利奈唑胺、万古霉素、呋喃妥因、替考拉宁及阿莫西林/克拉维酸均敏感;对喹红霉素中介2株,耐药21株,耐药率19.5%,对红霉素耐药率则高达60.2%。该院MSSA分为32个ST型,20株属于新的ST型,前三的ST型分别为:ST7型15株(12.7%),ST188型12株(10.2%),ST59型12株(10.2%)。结论 MSSA对大环内酯类抗生素耐药形势严峻,喹红霉素较红霉素对MSSA更为强效。ST7、ST188、ST59和ST398是该院临床分离MSSA的主要MLST型别。     

肠致病性大肠杆菌的生物膜形成对致病岛基因的影响

目的研究不同p H值条件对肠致病性大肠埃希菌生物膜形成能力及对致病岛基因的影响。方法将2株EPEC菌株(E11313和E11435)分别接种于p H值为7、9和11的LB培养基,用结晶紫染色半定量法检测2株菌株产生物膜能力,观察产生物膜菌株及非产生物膜菌株生物膜形成的差异,将2株菌株产生的生物膜溶解,提取总RNA,定量PCR检测不同p H浓度的生物膜与致病岛基因Esp A表达水平的关系。结果 E11435为生物膜阳性菌株,E11313为生物膜阴性菌株,p H为7~9之间,生物膜的形成变化不大,当p H值=11时,菌株形成生物膜更容易,E11435菌株形成的生物膜可影响EPEC致病岛Esp A基因的表达,且当p H=11时,Esp A表达水平明显提高(P<0.05)。结论碱性环境可促进肠致病性大肠杆菌生物膜的形成。生物膜阳性肠致病性大肠杆菌可显著提高致病岛Esp A基因的表达水平。     

屎肠球菌临床分离株生物膜形成与毒力基因及ST分型之间的关系

目的 研究临床分离屎肠球菌株生物膜形成与ST分型和毒力基因之间的关系。方法 收集深圳市南山医院2011—2017年临床分离的不重复屎肠球菌共122株,采用结晶紫染色法检测细菌生物膜形成能力,对分离株进行多位点序列分型(MLST)分析, PCR方法检测屎肠球菌临床株毒力基因表面蛋白(esp )、透明质酸酶(hyl )、表面聚集蛋白(asa1 )、明胶酶(gelE )、溶细胞素(cylA )等的分布。结果 122株屎肠球菌生物膜形成阳性率为49.2%,其生物膜形成能力主要表现为弱阳性。屎肠球菌毒力基因检测提示esp 和hyl 检出率分别为39.3%(48/122)和15.6%(19/122),所有菌株未检测到asa1 、gelE 、cylA ;其中esp 阳性与生物膜形成能力相关(P <0.05),而hyl 阳性与生物膜形成能力无相关性(P >0.05)。MLST分型提示屎肠球菌临床株主要为ST78及ST18型,分别为26株及18株,其中ST78与ST18之间生物膜形成能力差异无统计学意义(P >0.05),esp 更常见于ST78分离株。结论 临床分离屎肠球菌生物膜形成能力较弱,其毒力基因esp 阳性更容易形成生物膜,而hyl 与生物膜形成能力无明显相关性,ST78与ST18之间生物膜形成能力无明显差异,esp 更常见于ST78分离株。     

双歧杆菌肠道内调控表达肠道病毒71型VP1蛋白的实验研究

目的构建重组肠道病毒71VP1基因双歧杆菌,制成口服疫苗,用于EV71感染预防。方法扩增EV71病毒VP1基因并将其插入到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pBBAD/Xs中,构建VP1表达载体(pBBADs-VP1),通过Western blot检测VP1蛋白在pBBADs-VP1转化菌中的表达。选取BALB/c小鼠,分为B-VP1组、VP1组、GFP组和生理盐水组,B-VP1组口服pBBADs-VP1-转化双岐杆菌,VP1组腹腔注射大肠埃希菌表达纯化的重组VP1蛋白,GFP组口服pBBADs-GFP转化双岐杆菌,生理盐水组口服生理盐水,观察pBBADs-VP1-转化双岐杆菌口服免疫对EV71感染的免疫反应:包括病毒的中和抗体滴度、抗EV71-VP1抗体以及诱导脾脏和淋巴集结中Th1免疫反应。结果与GFP组及生理盐水组比较,B-VP1组及VP1组中和抗体滴度及抗EV71-VP1抗体水平,均显著增加;口服表达VP1蛋白长双歧杆菌和注射VP1蛋白都会诱导Th1细胞因子免疫反应(P<0.05),表达VP1蛋白长双歧杆菌较易诱导局部肠道的Th1模式,而注射VP1蛋白较易诱导全身性免疫。攻毒试验显示,VPI和B-VP1组新生鼠攻击后第15d(剂量1 000LD50)存活率分别为20.00%和16.67%,对照组无小鼠存活。结论利用长双歧杆菌表达VP1蛋白的口服疫苗可能成功激发针对EV71病毒感染的特异性免疫应答。用表达VP1的重组双歧杆菌免疫母鼠,可以赋予新生小鼠以保护。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌的临床分离及耐药机制分析

目的：了解我院耐亚胺培南铜绿假单胞菌（IRPA）的临床分布情况,并探讨其耐药机制。方法：对2009年1月～2010年12月我院住院患者临床分离的非重复性IRPA的数据资料进行统计分析,采用PCR方法检测金属酶基因和外膜通道蛋白基因。结果：从404株铜绿假单胞菌中共分离出100株IRPA,分离率为24.75%。其中90株（90.0%）IRPA来源于下呼吸道痰液标本;IRPA主要来源于重症医学科（ICU）;IRPA对阿米卡星最敏感率为73.0%（耐药率为27.0%）,其次是哌拉西林/他唑巴坦（敏感率为63.0%）,哌拉西林（敏感率为59.0%）,庆大霉素（敏感率为58.0%）,头孢他啶（敏感率为57.0%）,其余药物的敏感率均〈50.0%。仅1株IRPA检测出IMP基因阳性（1.0%）,测序为IMP-9型金属酶基因,其余金属酶基因均未检出;oprD2基因缺失的IRPA有65株（65.0%）。结论：我院IRPA主要是由于外膜通道蛋白oprD2缺失引起,且已有IMP-9型IRPA在我院流行,需引起重视。     

乙型肝炎病毒拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系的建立

目的构建1.3拷贝乙型肝炎病毒(HBV)拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系。方法在野毒株1.3拷贝HBV载体的基础上采用定点突变的方法将rtL180M,rtM204V位点突变,构建拉米夫定耐药病毒株,并通过PCR、限制性内切酶酶切,分别以正向和反向将野毒株和耐药株分别连接于逆转录病毒载体pLNCX2的相应酶切位点,构建成重组逆转录病毒载体,经双酶切及PCR扩增鉴定。重组载体转染包装细胞,筛选培养细胞克隆并进行病毒滴定。结果通过双酶切、PCR扩增、测序鉴定证实成功构建了1.3拷贝HBV拉米夫定耐药株的逆转录病毒载体。成功建立包装细胞系并测得病毒滴度均为1×105cuf/ml。结论含正向及反向1.3拷贝HBV拉米夫定耐药的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系构建成功,可以用于拉米夫定耐药细胞模型研究。     

659例金黄色葡萄球菌耐药性分析

目的了解我院临床分离的金黄色球菌对常用抗菌药物的耐药性,为临床治疗提供依据。方法采用全自动细菌鉴定仪及配套鉴定与药物敏感试验试剂,检测2010年至2011年临床分离的金黄色葡萄球菌,统计金葡菌感染的标本来源、科室分布及耐药率,并用WHONET5.4软件进行统计分析。结果 2010年至2011年临床共分离到659株金黄色葡萄球菌,其中上呼吸道(包括痰和咽拭子)分离的标本544株(82.5%),临床分布前三位分别是儿科、新生儿科及呼吸内科,以上三个科室分离的金黄色葡萄球菌占60.8%,金黄色葡萄球对青霉素耐药率最高(98%),未发现耐万古霉素、替考拉宁及利奈唑胺的金黄色葡萄球菌。结论金葡菌的感染部位以呼吸道、皮肤软组织及血流感染为主,在治疗时,我们需根据药物敏感试验及耐药特点,合理选择抗菌药物治疗,防止出现万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺耐药的菌株。     

肠球菌属血流感染的临床特征和预后分析

目的 分析肠球菌属血流感染的临床特征和入院后30 d死亡相关的危险因素。方法 回顾分析本院2008—2015年由肠球菌属细菌所致血流感染患者的临床和微生物学资料。结果 共59例肠球菌属血流感染患者,其中粪肠球菌33例,屎肠球菌24例,铅黄肠球菌和鹑鸡肠球菌各1例。屎肠球菌组Charlson合并症评分≥5、接受糖皮质激素治疗和静脉导管来源感染的患者多于粪肠球菌组,分别为(62.5%vs 30.3%、33.3%vs 9.1%、83.3%vs 45.5%,P0.05)。未发现耐万古霉素肠球菌(VRE),屎肠球菌血流感染对氨苄西林、环丙沙星和高浓度庆大霉素的耐药率明显高于粪肠球菌血流感染患者,分别为(79.2%vs 3.0%、75.0%vs 42.4%、54.2%vs 21.2%,P0.05)。通过单因素和多因素回归分析示仅糖皮质激素治疗(OR=7.644,P0.05),静脉导管感染(OR=9.727,P0.05)和环丙沙星耐药(OR=15.060,P0.05)是患者入院后30 d死亡的独立危险因素。结论 粪肠球菌和屎肠球菌是两种差别较大的病原体,所导致的血流感染有其不同特征,应更加积极的进行经验性抗感染治疗以改善预后。     

肠致病性大肠埃希菌EPEC Deng致病岛基因进化特点

目的分析肠致病性大肠埃希菌（EPEC）致病岛（PAIs）基因进化特点。方法EPEC Deng分离自我国婴幼儿腹泻患者粪便标本,鉴定该菌株血清型并进行药敏试验;采用Illumina 2000仪器对菌株进行全基因序列测序,PHAST软件定位菌株原噬菌体(prophages,PPs)在染色体中的位置,MUMmer软件进行共线性分析,构建系统发育树,了解同源基因进化规律。应用PAI_finder软件对基因组进行PAIs预测,了解PAIs核心区域（LEE）和核心基因同源进化规律,并进行遗传多态性分析。结果EPEC Deng菌株归属O119∶H6,药敏结果显示该菌株对环丙沙星、左氧氟沙星及氨苄西林耐药,对其余的抗菌药物均敏感。基因组（染色体）序列大小为5 025 482 bp（GC含量为50.52%）,质粒序列大小为207 564 bp（GC含量为49.50%）。共找到17个PPs,系统发育树分析发现,EPEC Deng株基因组与O26∶H11、O111∶H同源性较高;EPEC Deng株PAIs和核心基因均与RDEC 1和O26∶H413/89 1株具有高同源性;遗传多样性分析结果显示,紧密素（eae）及其受体（tir）多态性丰富,π值均＞0.10,Ⅲ型分泌系统（TTSS）分泌蛋白相对稳定。结论此研究明确了EPEC Deng株基因组及PAIs的进化特点,有助于了解了本土分离的EPEC基因特点。     

慢性重型乙型肝炎患者隐孢子虫感染的研究

目的探讨慢性重型肝炎与隐孢子虫感染的关系，为防治该病提供依据。方法用金胺-酚染色法(AA—P)和改良抗酸染色法(MAF)检测218例慢性重型乙型肝炎(慢重肝)患者和140例腹泻儿童粪便标本隐孢子虫卵囊，用PCR技术检测其DNA，并进行内切酶分析；对隐孢子虫感染影响因素进行分析。结果经AA-p、MAF和PCR检测，慢重肝患者隐孢子虫感染率分别为4．1％、3．2％和6．0％；腹泻儿童感染率为0．7％、0．7％和1．4％、PCR结果显示，慢重肝患者隐孢子虫感染率高于腹泻儿童；阳性患者腹泻史、动物接触史明显高于阴性患者，农村患者感染率高于城市患者结论慢性重型肝炎患者对隐孢子虫的易感性增加，隐孢子虫感染是引起慢性重型肝炎患者腹泻和可能加重其病情的因素之一。