血流感染O139群霍乱弧菌的耐药性及基因组特征分析

目的分析1株从菌血症患者血液中分离到的O139群霍乱弧菌产毒株的耐药性及基因组特征。方法使用肉汤稀释法和全自动药敏分析仪测定菌株的抗生素敏感性, 使用二代基因测序和纳米孔测序获得菌株的完整基因组序列, 使用BLAST在线比对与CARD、Resfinder、ISfinder、VFDB等数据库进行比对分析, 明确菌株携带的耐药基因、插入序列和毒力基因等, 使用MEGA 5.1软件构建基于核心基因组单核苷酸多态性的遗传系统发生树。结果霍乱弧菌SH400为O139群产霍乱毒素的菌株, 携带了多个毒力相关基因和4个毒力岛。该菌株对链霉素、四环素、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶耐药并携带了相应的耐药基因。该菌株携带了大小为172 914 bp并且含有10种耐药基因的IncA/C型质粒。结合基因组进化关系发现, 菌株间携带耐药基因和耐药质粒的情况呈现出一定聚集性。菌株SH400的传统ST型为ST69, cgMLST型为与cgST-252高度相似的新型别。结论该株O139群霍乱弧菌携带ctxAB毒力基因、多种耐药基因和IncA/C型质粒, 且存在多重耐药岛。     

肠致病性大肠杆菌分离株的脉冲场凝胶电泳分析

摘要:目的　对我国人源与牛源的肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC）分离株进行脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis,PFGE）分析,了解我国EPEC分离株的分子流行病学特征并初步建立我国EPEC菌株的PFGE基础数据库。方法　参照PulseNet中非O157大肠杆菌的PFGE分型方法,对实验室保存的74株EPEC代表性菌株进行PFGE分型,并用BioNumerics软件进行聚类分析。结果　在PulseNet推荐的参数条件下,菌株基因组限制性内切酶XbaI酶切片段分布均匀,条带易于识别。74株EPEC菌株共产生66种PFGE带型（EPEC0001-EPEC0066）,其中5株典型EPEC（tEPEC）分为3种PFGE带型,69株非典型EPEC（aEPEC）分为63种带型。PFGE聚类分析显示人源菌株与牛源菌株虽各自存在一定程度的集中分布趋势,但二者也相互散在分布,人源菌株EP120与牛源菌株EP125聚类相似性达90%。结论　我国EPEC分离株呈现高度多态性,分离自牛的菌株与分离自人的菌株在PFGE聚类中呈现一定的相互散在分布,提示牛作为EPEC的重要宿主,可能在人类感染EPEC中发挥一定作用。     

生鲜肉中肠炎沙门菌分子生物学特征分析

目的了解生鲜肉类中肠炎沙门菌耐药性及基因变异情况。方法药敏试验采用K-B法,用碱裂解法提取细菌的质粒DNA,采用肠杆菌重复基因间隔重复共有序列（ERIC-PCR）技术对10株肠炎沙门菌进行基因分析,运用NTSYS-PC2.0软件进行同源性比较,聚类分析。结果药敏呈现出多重耐药;基因谱系与聚类分析可将菌株分为3大类,扩增片段长度为250bp～2000bp,在85%的同源度上可分为A、B、C等3个型,其中A型2株,B型6株,C型2株。结论生鲜肉中肠炎沙门菌耐药情况比较普遍,10株肠炎沙门菌基因变异较小,ERIC-PCR技术是分析、鉴定肠炎沙门菌,追溯食物中肠炎沙门菌的有用和可行的工具。     

1997-2010年宁夏回族自治区小肠结肠炎耶尔森菌致病性的基因特征

目的 了解宁夏回族自治区小肠结肠炎耶尔森菌主要毒力基因分布情况和致病性小肠结肠炎耶尔森菌分子分型特征。方法 于1997-2010年在宁夏回族自治区共分离得到283株小肠结肠炎耶尔森菌,用PCR法分析其黏附侵袭位点基因(ail)、耐热肠毒素A基因（ystA）、ystB、黏附素基因（yadA）、毒力活化因子基因（virF）;应用限制性内切酶Not Ⅰ酶切致病性小肠结肠炎耶尔森菌染色体DNA进行脉冲场凝胶电泳(PFGE),利用BioNumerics软件进行聚类分析。结果 209株O∶3、O∶9血清型小肠结肠炎耶尔森菌中ail、ystA、yadA、virF毒力基因阳性,ystB为阴性的占97.6％( 204/209);O∶8血清型和未开展血清分型的菌株5种毒力基因全部阴性;11株O∶5血清型有9株5种毒力基因全部阴性。将致病性菌株进行PFGE分型,根据染色体DNA的Not Ⅰ酶切图谱,将29株O∶3血清型分成12个PFGE带型,包含5株以上的优势PFGE带型有2种。180株O∶9血清型菌株分成13个PFGE带型,包含10株以上的优势PFGE带型有4种,各自是从同一地区猪与家鼠、猪与犬、猪与野兔分离。结论 宁夏地区O∶3、O∶9血清型小肠结肠炎耶尔森菌具有致病性,O∶3逐步成为如今的优势血清型;O∶5、O∶8与血清未分型的菌株无致病性。     

一株红霉素耐药百日咳鲍特菌的完整基因组分析

目的明确国内一株红霉素耐药百日咳鲍特菌P2013109的全基因组序列,了解其基因特征。方法对一株抗原基因型为ptxA1/ptxC1/ptxP1/prn1/fim2-1/fim3-1/tcfA2的临床分离红霉素耐药百日咳鲍特菌P2013109采用了二代和三代高通量测序技术进行了全基因组测序,对基因组进行组装、基因预测和功能注释,并与包含我国疫苗株CS、国外疫苗株Tohama I,以及国外发表临床分离的共15株菌的完整基因组序列进行全基因组比较分析。结果 P2013109的完整基因组序列总长度4 126 010 bp,GC含量为67.72%,预测基因有4 085个。该基因组的所有拷贝23s r RNA基因均显示A2047G突变。相比P2013109,其他15株菌主要存在3个比较大的缺失区域。另外,将P2013109与其他16株进行系统发育树分析,显示全部菌株分成3个遗传分支。Tohama I和CS这两个疫苗株归类为Ⅰ型,它们与其他2个型别相比较呈现76个SNPs。P2013109独立为Ⅱ型,与其他菌株的进化关系相对较远,相比较其他菌株呈现25个SNPs。国外菌株为Ⅲ型,与其他菌株相比呈现21个SNPs。结论国内当前流行的红霉素耐药百日咳鲍特菌具有独特的系统发育分支,其遗传进化与疫苗株和国外流行菌株不同。     

肠致病性大肠埃希菌分离株血清型多样性分析

目的了解不同来源肠致病性大肠埃希菌(EPEC)分离株的血清型。方法采用特异性PCR方法检测大肠埃希菌不同O抗原编码基因,并以全套O抗血清复核确定O血清群;以PCR扩增和测序H抗原编码基因,经序列比对后确定H型。结果 331株EPEC分离株中,共检测到81种O血清型,其中优势O血清群为O51,占6.0%(20/331),O145占4.5%(15/331);共检测到25种H型,其中优势H型为H11(8.2%)、H2(7.9%)和H19(7.9%)。最常见的血清型为O51∶H7和O26∶H11。来自腹泻患者、健康从业人员、动物和生肉类的EPEC分离株中,分别检测到63种、22种、25种和17种O血清群。腹泻患者、动物和生肉类中的优势血清群/型分别为O51(8.7%)、O145(15.7%)和O76∶H7(21.2%),而健康人员的分离株无明显优势血清群。结论我国EPEC菌株的血清型呈现极大的多样性,无明显的优势血清群(型),传统上依靠血清群(型)对EPEC进行判断的方法存在局限性。     

致病性大肠埃希菌高致病性毒力岛irp2基因序列的扩增与分析

目的探讨致病性大肠埃希菌（EPEC）中高致病性毒力岛（HPI）irp2基因与致病性的关系。方法根据Genebank中irp2基因设计特异性引物，应用聚合酶链反应（PCR）技术扩增基因全长，克隆入pUCm-T载体，并通过酶切和测序鉴定。结果160株EPEC中有16株（10．00％）扩增出278bp基因片段，该基因片段与GeneBank中公布的耶尔森菌HPI irp2基因的同源性高达97％以上。结论部分EPEC具有耶尔森菌毒力岛HPI基因序列，该毒力岛可能与EPEC的致病性有一定相关性。     

全基因测序法分析肺炎克雷伯菌JM45株对喹诺酮类药物耐药基因

目的分析泛耐药肺炎克雷伯菌JM45株携带的喹诺酮类药物耐药基因,研究其对喹诺酮类药物的耐药机制。方法采用Roche454高通量测序技术对肺炎克雷伯菌JM45株做全基因组测序(完成图),分析喹诺酮类耐药基因携带状况,再将gyrA与parC全长基因与其他6株肺炎克雷伯菌做分子进化分析。结果最终得到JM45株一条完整的基因组(染色体)序列及两条质粒序列;基因组(染色体)序列大小为5 273 812bp(GC含量65.8%),质粒1序列大小为317 156bp(GC含量53.0%),质粒2序列大小为12 209bp(GC含量55.3%);在基因组(染色体)序列中携带了gyrA基因(全基因组Feature ID:KPN_1614),parC基因(Feature ID:KPN_0743);与肺炎克雷伯菌喹诺酮类药物敏感株相比较,gyrA基因第83位密码子由TCC→ATC,翻译成氨基酸序列后丝氨酸(Ser)→异亮氨酸(Ile),parC基因第80位密码子由AGC→ATC,翻译成氨基酸序列后丝氨酸(Ser)→异亮氨酸(Ile)。结论肺炎克雷伯菌JM45株喹诺酮类药物耐药是gyrA基因和parC基因喹诺酮耐药决定区(QRDR)突变所致;gyrA与parC全长基因的分子进化分析提示JM45株与肺炎克雷伯菌HS11286关系最为接近(序列相同),与肺炎克雷伯菌342关系最远。     

PCR检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的研究快速、特异、灵敏的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法,并比较单一PCR和多重PCR对检测灵敏度的影响.方法选择O157∶H7的O抗原、H鞭毛抗原及SLT1和SLT2毒素基因特异的4对引物,分别或共同进行PCR扩增,检测40株O157∶H7和非O157∶H7菌株,将细菌按10+1～10+6稀释后比较PCR的检测灵敏度.结果所有O157∶H7菌株均在497 bp和625 bp处出现O157抗原基因和H7抗原基因产物,其产毒株在484 bp和(或)210 bp处出现SLT2和(或)SLT1基因产物,非O157∶H7菌株PCR结果均为阴性;单一PCR检测灵敏度为150 CFU/PCR反应,多重PCR为＞1 500 CFU/PCR反应.结论在经过增菌后,多重PCR比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便,为产毒和非产毒O157∶H7的诊断提供了新的手段.     

浙江省腹泻患者致泻性大肠埃希菌血清型分布及其鉴定效率的评价

目的 了解浙江省致泻性大肠埃希菌（DEC）血清型分布并探讨其血清学鉴定分类方法的鉴定效率。方法 对2009年7月至2013年6月浙江省腹泻症候群病原谱监测网络菌株库中的696株DEC菌株（通过毒力基因鉴定）开展血清学凝集试验,比较毒力基因和血清学鉴定分类的结果。结果 696株DEC中288株（41.4%）能明确O抗原型别,分属于35种O血清群。171株（24.6%）H血清凝集,分属于21种H型。肠集聚性大肠埃希菌（EAEC）、产肠毒素性大肠埃希菌（ETEC）、肠致病性大肠埃希菌（EPEC）和肠出血性大肠埃希菌（EHEC）凝集率分别为31.9%（130/408）、70.6%（127/180）、31.5%（29/92）和14.3%（2/14）,分属于30、18和15种O血清群,1株EHEC为O157∶H7。EAEC和EPEC血清群相对较多样化,而ETEC则相对集中,不同类型DEC可具有同一血清群/型。根据血清学结果可分类的75株DEC中,42株毒力基因和血清学分类结果一致,33株不一致。结论 浙江省DEC血清群/型种类多样,单纯采用血清学筛查可造成极大的漏检或误分,建议采用毒力基因鉴定分类。     

Association of plasmid-mediated quinolone resistance and virulence markers in Escherichia coli isolated from water

This work aimed to investigate the association of the carriage of plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) genes, the virulence potential encoded in pathogenicity islands (PAIs) and the phylogenetic background in Escherichia coli strains isolated from waters of diverse origin. Antimicrobial susceptibilities were determined by the disc diffusion method. Screening for PMQR (qnr, aac(6')-Ib-variant and qepA) genes, PAIs and the determination of phylogroup was performed by PCR. Nineteen percent of strains were resistant to nalidixic acid, 11% to ciprofloxacin and 5% to gentamicin. qnrA was the only PMQR detected in 16% of strains, susceptible to quinolones and grouped in phylogenetic lineage B1. Sixty-seven percent of the isolates were assigned to the less-virulent groups A and B1. PAIs IV(536) and II(CFT073) were detected in 16 and 3% of the isolates, respectively. All PAIs were detected in the phylogroups D and B1. The presence of PAIs in isolates from waters may represent an increased risk for public health, as they were isolated from samples collected from surface and drinking waters. As E. coli is an important indicator of microbiological water quality, and also a potential pathogen, routine analysis for its detection could be complemented by screening for virulence factors and antimicrobial genes.     

甲型H1N1流感(2009)病毒福州株全基因组序列分析

目的:分析福州地区甲型H1N1流感病毒株的全基因序列和遗传特征。方法:采用MDCK细胞培养法和Real-time RT-PCR法对A/Fuzhou/721/2009(H1N1)进行病毒分离、鉴定。测定该株的全基因组序列,并进行基因进化树分析。结果:分离株的8个基因片段核苷酸和推导氨基酸序列与其他地区新甲型H1N1参考株的同源性都在99%以上;与参考株A/California/04/2009相比,HA蛋白有4个氨基酸发生了突变,分别位于83、1972、03和321位点上,HA1蛋白都有6个潜在糖基化位点;对耐药性位点分析发现,对金刚烷胺类药物耐药,但仍然对神经氨酸酶抑制剂类药物敏感。结论:该毒株与2009年大流行株高度同源;相对于以往古典型猪流感代表株出现了HA蛋白抗原性漂移,但HA蛋白保留了古典猪H1的特点。对福州地区甲型H1N1(2009)流感病毒全基因序列和分子遗传特征的详细研究,为监测病原变异、致病性及流行规律提供科学依据。     

2株皮肤软组织感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌全基因组测序分析

目的 对2株(1株ST59型,命名为QY01;1株ST338型,命名为QY02)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)进行全基因组测序分析,了解2株菌携带的耐药基因和毒力基因及其差异,为后续对MRSA的耐药机制、群体进化研究提供模板比对序列。方法 使用二代测序平台Illumina Hiseq 2000,PE150测序策略对2株MRSA进行全基因组测序分析;使用FastQC进行测序质控;使用SPAdes进行序列拼接;使用RAST(http://rast.nmpdr.org)进行基因预测及功能注释;使用毒力基因数据库(http://www.mgc.ac.cn/VFs/search_V Fs.html)对携带的毒力基因进行筛查;使用抗生素耐药基因数据库(CARD;http://card.mcmast er.ca/)对携带的耐药基因进行筛查。结果 QY01菌株基因组大小为2 760 018 bp,GC占比32.7%,其基因组草图序列已提交至NCBI GenBank数据库(BioSample:SAMN09711465),QY01菌株携带6个耐药基因,分别是blaZ、mecA、aph(3’)-III、ant(6)-Ia、erm(B)、tet(K);QY02菌株基因组大小为2 776 622 bp,GC占比32.7%,其基因组草图序列已提交至NCBI GenBank数据库(BioSample:SAMN09711466),QY02菌株携带7个耐药基因,分别blaZ、mecA、aph(3’)-III、ant(6)-Ia、erm(B)、tet(K)、cat(pC233)。QY01和QY02菌株均携带11个相同的毒力基因,分别是aur、scn、lukS-PV、lukF-PV、seb、sek、seq、hlb、hlgA、hlgB、hlgC。结论 QY02(ST338型)菌株较QY01(ST59型)菌株携带更多的耐药基因,QY01和QY02菌株携带的毒力基因无差异,2株菌均可产生潘顿-瓦伦丁杀白细胞素(PVL)、金属蛋白酶(AUR)、葡萄球菌补体抑制剂(SCN)等致病物质。     

Cytolethal distending toxin producing Escherichia coli O157:H43 strain T22 represents a novel evolutionary lineage within the O157 serogroup

Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157:H7/NM strains are significant foodborne pathogens intensively studied, while other sero- and pathotypes of the O157 serogroup only began to receive more attention. Here we report the first genome sequence of a cytolethal distending toxin (CDT-V) producing E. coli O157:H43 strain (T22) isolated from cattle. The genome consists of a 4.9 Mb chromosome assembled into three contigs and one plasmid of 82.4 kb. Comparative genomic investigations conducted with the core genomes of representative E. coli strains in GenBank (n = 62) confirmed the separation of T22 from the EHEC and enteropathogenic (EPEC) O157 lineages. Gene content based pangenome analysis revealed as many as 261 T22-specific coding sequences without orthologs in EDL933 EHEC O157 prototypic and two phylogenetically related commensal E. coli strains. The genome sequence revealed 10 prophage-like regions which harbor several virulence-associated genes including cdt and heat-labile enterotoxin (LT-II) encoding operons. Our results indicate that the evolutionary path of T22 is largely independent from that of EHEC and EPEC O157:H7/NM strains. Thus, the CDT-producing T22 E. coli O157:H43 strain represents a unique lineage of E. coli O157.     

Comparative genomic and phylogenetic analysis of a toxigenic clinical isolate of Corynebacterium diphtheriae strain B-D-16-78 from Malaysia

In this study, we report the comparative genomics and phylogenetic analysis of Corynebacterium diphtheriae strain B-D-16-78 that was isolated from a clinical specimen in 2016. The complete genome of C. diphtheriae strain B-D-16-78 was sequenced using PacBio Single Molecule, Real-Time sequencing technology and consists of a 2,474,151-bp circular chromosome with an average GC content of 53.56%. The core genome of C. diphtheriae was also deduced from a total of 74 strains with complete or draft genome sequences and the core genome-based phylogenetic analysis revealed close genetic relationship among strains that shared the same MLST allelic profile. In the context of CRISPR-Cas system, which confers adaptive immunity against re-invading DNA, 73 out of 86 spacer sequences were found to be unique to Malaysian strains which harboured only type-II-C and/or type-I-E-a systems. A total of 48 tox genes which code for the diphtheria toxin were retrieved from the 74 genomes and with the exception of one truncated gene, only nucleotide substitutions were detected when compared to the tox gene sequence of PW8. More than half were synonymous substitution and only two were nonsynonymous substitutions whereby H24Y was predicted to have a damaging effect on the protein function whilst T262V was predicted to be tolerated. Both toxigenic and non-toxigenic toxin-gene bearing strains have been isolated in Malaysia but the repeated isolation of toxigenic strains with the same MLST profile suggests the possibility of some of these strains may be circulating in the population. Hence, efforts to increase herd immunity should be continued and supported by an effective monitoring and surveillance system to track, manage and control outbreak of cases.     

上海市医疗机构工作人员手污染金黄色葡萄球菌的分子生物学特征及耐药性

目的 分析上海市医疗机构工作人员手分离金黄色葡萄球菌的分子生物学特征及其耐药性.方法 选取2018—2020年上海市16所不同级别医院工作人员为研究对象,对医疗机构重点科室工作人员的手进行采样、分离、鉴定金黄色葡萄球菌,对金黄色葡萄球菌进行药敏试验、脉冲肠凝胶电泳(PFGE)和全基因组测序,利用BioNumerics软...     

一株H5N1亚型禽流感病毒全基因组克隆及HA基因分子进化分析

目的对禽流感H5N1亚型病毒株A/Chicken/Hubei/489/2004的全基因组进行克隆和测序,并分析血凝素基因HA的遗传突变特点及其与1996年以来其他病毒株的亲缘关系。方法通过RT-PCR扩增病毒株A/Chicken/Hubei/489/2004的8个基因,并将其克隆到测序载体;在对病毒株全基因组序列测定基础上,利用生物信息学软件对HA基因进行遗传进化分析。结果病毒株A/Chicken/Hubei/489/2004的全基因组克隆到PMD18-T;遗传进化分析显示该毒株HA蛋白具有与致病性有关的切割位点"PQRERRRKKR",并且与2000～2006年在香港从人和禽体内分离的H5N1亲缘关系相近,也与2003～2004年在东南亚从人和禽体内分离的H5N1极其相关。结论 A/Chicken/Hubei/489/2004病毒分离株具有与A/Chicken/HongKong/YU777/2002更相似的遗传特性,极可能是2002年禽流感病毒家系的再次出现。     

Comparative genome analysis of Lactobacillus plantarum GB-LP3 provides candidates of survival-related genetic factors

Lactobacillus plantarum is found in various environmental niches such as in the gastrointestinal tract of an animal host or a fermented food. This species isolated from a certain environment is known to possess a variety of properties according to inhabited environment's adaptation. However, a causal relationship of a genetic factor and phenotype affected by a specific environment has not been systematically comprehended. L. plantarum GB-LP3 strain was isolated from Korean traditional fermented vegetable and the whole genome of GB-LP3 was sequenced. Comparative genome analysis of GB-LP3, with other 14 L. plantarum strains, was conducted. In addition, genomic island regions were investigated. The assembled whole GB-LP3 genome contained a single circular chromosome of 3,206,111bp with the GC content of 44.7%. In the phylogenetic tree analysis, GB-LP3 was in the closest distance from ZJ316. The genomes of GB-LP3 and ZJ316 have the high level of synteny. Functional genes that are related to prophage, bacteriocin, and quorum sensing were found through comparative genomic analysis with ZJ316 and investigation of genomic islands. dN/dS analysis identified that the gene coding for phosphonate ABC transporter ATP-binding protein is evolutionarily accelerated in GB-LP3. Our study found that potential candidate genes that are affected by environmental adaptation in Korea traditional fermented vegetable.     

深圳地区麻疹病毒核蛋白N基因序列分析

目的探讨深圳市麻疹病毒的基因型别和特征.方法采用B95a细胞分离培养麻疹病毒,通过RT-PCR方法扩增麻疹病毒核蛋白N基因C末端450bp片段并测序,分析和基因库Genebank中麻疹病毒的各基因型代表株序列的同源性.结果分离到1株麻疹病毒,与H1基因型代表株相比同源性为98.4%.结论深圳市麻疹流行株属于H1基因型.     

H5N6人禽流感病毒分离株序列分析及其生物学特性研究

目的 分析研究H5N6人禽流感病毒基因组序列特征,明确该病毒的分子进化及生物学特性.方法 从GenBank和GISAI中获取人H5N6分离株全序列,通过软件BioEdit7.0.9对各节段基因与其他相关毒株序列进行比对.用软件Mega 5.0,Neighbor-Joining法绘制血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因进化树,并全面分析病毒株的基因组序列特征、病毒进化及来源、传染性、致病性和药物敏感等.结果 H5N6病毒的基因组完全属于禽源特征,根据病毒进化及来源可分为两大类.HA基因都属于H5亚型的2.3.4.4进化支,NA基因都来源于H6N6亚型毒株,属于欧亚谱系.其余6段内部基因分别来自于H9N2亚型或H5亚型2.3.2.1进化支毒株.该病毒尚不能在人与人之间有效传播,呈现高致病性病毒特征,对奥斯他韦敏感,但部分毒株对金刚烷胺类药物耐药.结论 H5N6人禽流感分离株并不属于同一毒株,是由H5N1、H5N2、H6N6、H9N2等亚型毒株通过不同组合而重配产生,需加强对这类病毒及其宿主的监控.