自身启动子调控miR-7真核表达载体的构建及其意义

目的 构建带有miR-7自身启动子的miR-7重组真核表达载体,研究其对人肺癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响.方法 预测miR-7启动子序列,设计含有该序列和miR-7前体序列目的片段的引物,PCR扩增后亚克隆入pGL3.0-Basic载体以构建miR-7自身启动子调控的真核表达载体pGL3.0-Basic-miR-7-promoter(命名为p-miR-7-pro);将所构建载体转染人肺癌95D细胞,Real-time PCR探针法检测95D细胞中miR-7的表达水平;MTT和克隆形成实验分别检测95D细胞的增殖和克隆形成能力;划痕法观察95D细胞体外迁移能力的变化;FACS检测95D细胞的凋亡情况.结果 酶切和测序结果证明成功构建p-miR-7-pro真核表达载体,转染95D细胞后可有效表达miR-7;与对照组相比,p-miR-7-pro转染组95D细胞的体外增殖能力受到明显的抑制(0.60 ±0.03 vs 0.19 ±0.05,P＜0.05);同时其迁移能力也显著降低(473 ±7 vs 99 ±2,P＜0.05);而细胞凋亡则显著增加(9.233 ±0.586％vs 12.967 ±0.643％,P＜0.05).结论 成功构建由自身启动子调控的miR-7真核表达载体,为后续研究miR-7在肺癌基因治疗中的作用提供重要实验基础.     

miR-155对人肺癌95D细胞生物学行为的影响

目的：构建携microRNA-155（miR-155）的真核表达载体并观察其转染高转移性人巨细胞肺癌95D细胞后细胞的生物学行为变化。方法：以95D细胞基因组RNA为模板,经PCR法扩增miR-155的前体序列,由 Bam HⅠ和 Hin dⅢ双酶切后将其亚克隆入真核表达载体pcDNA 3.1(-),并进行双酶切及测序鉴定;将构建成功的pcDNA3.1(-)-pri-miR-155载体（命名为p-miR-155）体外瞬时转染人肺癌95D细胞,利用 Real-time PCR探针法检测miR-155成熟体的表达水平,并利用CCK-8法、克隆形成实验和划痕法检测95D细胞的增殖、克隆形成以及体外迁移能力。 结果： 成功构建携miR-155的真核表达载体;与空白（Mock）和对照组（p-Ctrl）相比,转染后的95D细胞过表达miR-155\[（2.04±0.62) vs (0.76±0.62)、(1.00±0.45),均 P <0.01\]、p-miR-155载体转染组95D细胞的增殖抑制明显增加\[(46.70±6.89)% vs （3.70±1.40）%、（1.11±0.75）%, P <0.01\]、克隆形成能力（在100和1 000个细胞/孔接种条件下）明显下降\[（12±3) s (34±3)、(35±3)个, P <0.01;(78±4) vs (159±4)、(165±4)个, P <0.01）\],此外,细胞的迁移细胞数也明显减少\[(110±5) vs (295±5)、(325±5)个, P <001\]。 结论： 通过miR-155真核表达载体转染产生的过表达miR-155可显著抑制人肺癌95D细胞的增殖和迁移能力。     

MicroRNA-7基因敲减小鼠模型的鉴定

目的鉴定miR-7基因敲减小鼠模型,为进一步研究miR-7的生物学功能奠定基础。方法常规剪取7只miR-7基因敲减（miR-7 knock down,miR-7KD）小鼠的脚趾和尾巴,分别用来提取基因组DNA和总RNA;剪取1只WT（wild-type,WT）小鼠的尾巴,提取其总RNA;将提取的两组小鼠的总RNA逆转录成c DNA;分别以基因组DNA和c DNA为模板,用特异性引物PCR技术扩增目的基因增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）片段;提取WT和miR-7KD小鼠7个不同组织器官的总RNA,利用Real-time PCR探针法检测各组织器官中miR-7成熟体的表达水平;HE染色观察miR-7KD小鼠心脏、肺脏以及结肠的形态学结构改变。结果 PCR结果显示,模型小鼠的脚趾基因组DNA和尾巴c DNA中均能扩增出载体目的基因EGFP片段;Real-time PCR结果显示,miR-7KD小鼠心脏、肝脏和脾脏等组织器官miR-7成熟体的表达水平较WT小鼠均显著下调（P〈0.05）;HE染色结果显示,miR-7KD小鼠心脏、肺脏以及结肠形态学结构发生了明显的病理性改变。结论成功鉴定了miR-7基因敲减小鼠模型,为后续深入探讨该分子的生物学功能提供重要实验基础。     

miR-126基因敲减对小鼠胸腺淋巴细胞发育的影响

目的研究miR-126基因敲减对小鼠胸腺细胞发育的影响,并初步探讨其意义。方法观察miR-126基因敲减(KD)小鼠胸腺的体积、重量和细胞总数;Real-time PCR检测小鼠胸腺miR-126表达水平;HE染色观察小鼠胸腺形态学结构;FACS检测胸腺中淋巴细胞比例、核抗原Ki-67的表达以及细胞凋亡的变化;最后,Western blot检测胸腺中磷酸化AKT(p-AKT)和磷酸化ERK1/2(p-ERK)的表达。结果 WT和miR-126KD小鼠胸腺体积大小、重量以及细胞总数均无明显差异,但miR-126KD小鼠胸腺miRNA-126表达水平显著下调(P0.05)。miR-126KD小鼠胸腺组织结构出现形态学异常。与WT小鼠相比,miR-126KD小鼠胸腺CD4~+SP细胞比例及细胞绝对数明显增加(P0.05),而CD4~+CD8~+(DP)细胞比例及绝对数则显著减少(P0.05),miR-126KD小鼠胸腺CD4~+SP细胞核抗原Ki-67表达显著增加(P0.05),且细胞凋亡明显减少(P0.05),而DP细胞Ki-67表达则明显减少(P0.05)。最后,miR-126KD小鼠胸腺淋巴细胞中磷酸化AKT和磷酸化ERK1/2的表达水平明显下调(P0.05)。结论 miR-126基因敲减可显著影响胸腺细胞特别是CD4~+SP细胞的发育,为后续进一步深入探讨miR-126对T淋巴细胞发育以及功能的影响提供重要的实验基础。     

MicroRNA-7 在CD4+ T 细胞体外活化中的表达及意义

目的:观察microRNA-(miR-)在体外活化CD4+ T 细胞中表达的变化,初步探讨其意义。方法:采用免疫磁珠分选法(MACS)获得FVB 小鼠脾脏中CD4+ CD62L+ T 细胞,经抗CD3/ CD28 抗体刺激后,Real-ime PCR 检测miR- 7达水平,FACS 检测活化膜分子CD69 的表达变化;进一步观察刺激不同时间点CD4+ T 细胞中miR-7表达的变化;观察ERK 抑制剂PD98059 处理后,CD4+ T 细胞活化下miR-7表达的变化,同时CCK8 法检测细胞增殖变化,FACS 检测CD69 和CD62L 分子的表达变化;最后, Real-time C 检测各组细胞中IL-7、IL-10 和IFN鄄酌等细胞因子表达水平变化。结果:与对照组相比,抗CD3/ CD28 抗体刺激后,CD4+ CD62L+ T 细胞中miR-7 表达水平显著上调,CD69 分子的表达明显增加(P<0.05);与刺激0 h 组和24 h 组相比,48 h 组和72 h 组miR-7 的表达水平显著上调(P<0.05);PD98059 处理组中,CD4+ T 细胞的miR-7 表达水平显著下降(P<0.05),同时,活化膜分子CD69 的表达比例明显降低(P<0.05);最后,细胞表达IL-6、IL-10 和IFN 的水平均显著减弱(P<0.05)。结论:miR-7 在活化的CD4+ T 细胞中明显上调,并与ERK 信号相关,为后续探讨miR-7 在CD4+ T 细胞功能中的作用提供了前期实验基础。     

microRNA-7 敲减对内毒素诱导小鼠急性肺损伤的影响

目的:观察microRNA-7(miR-7)敲减对内毒素诱导小鼠急性肺损伤的影响并探讨其意义。方法:利用脂多糖(LPS)腹腔注射(10 mg/ kg 体重)野生型(Wild type,WT)小鼠和miR-7 基因敲减(Knockdown,KD)小鼠建立急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)模型;HE 染色观察肺组织病理学变化;计算肺泡灌洗液(BAL)中的细胞总数;Real-time PCR 检测肺组织炎症相关因子表达变化;流式细胞术(FACS)进一步检测BAL 中固有免疫细胞酌啄T 细胞、F4/80 巨噬细胞(Macrophages,M渍)和适应性免疫细胞CD4+ T 细胞和CD8+ T 细胞的比例和绝对数变化;FACS 检测CD4+ T 细胞活化相关分子CD62L 和CD69 的表达水平。结果:相对野生型(Wild type,WT)小鼠,HE 染色显示miR-7KD 小鼠的肺组织小血管充血和炎性细胞浸润明显减少,病理性损伤明显减轻;Real-time PCR 结果显示促炎性细胞因子IL-6 的表达水平显著降低(P<0.01),而抗炎性细胞因子IL鄄4、TGF 的表达水平明显增加(P<0.05);同时,BAL 中总细胞数显著减少(P<0.05);FACS 检测进一步显示miR-7KD 小鼠的BAL 中F4/80+ M渍细胞的比例及绝对数均明显下调(P<0.05),而 T 细胞的比例上(P<0.05),但其细胞绝对数无差异(P>0.05);BAL 中CD4+ T 细胞和CD8+ T 细胞的比例及其绝对数均显著降低(P<0.05);最后CD4+ T 细胞活化膜分子CD62L的表达水平明显上调(P<0.05),而CD69 的表达水平显著下调(P<0.05)。结论:miR-7 敲减可减轻ALI 模型小鼠的肺部损伤,提示其可能在ALI 发生中发挥了重要调控作用。