杭州市富阳区住院腹泻患者艰难梭菌感染及菌株分子特征分析

目的了解浙江省杭州市富阳地区住院腹泻患者艰难梭菌感染情况,研究感染患者临床危险因素及分离菌株的分子特征。方法收集2017年5月至2018年2月就诊于第一人民医院的228例腹泻患者的粪便标本,通过厌氧培养进行艰难梭菌菌株分离和鉴定,进行多位点序列基因分型,以琼脂稀释法测定菌株耐药性,对患者临床资料进行统计分析。结果228份标本共检测出产毒型艰难梭菌41株,其中31株为医院获得性腹泻;阳性患者平均年龄67.8岁,主要来自消化内科（34.1%）和肾内科（19.5%）。 ST2、ST3和ST54为主要基因型。 所有菌株对万古霉素、甲硝唑、四环素、哌拉西林敏感。 临床资料统计分析显示,＞60周岁、患基础性疾病和有抗生素用药史的阳性患者数量远高于阴性患者比例（χ2＝4.229、9.022、5.767,P＝0.023、0.001、0.009）。结论杭州市富阳区住院腹泻患者艰难梭菌感染患者主要来源于院内感染。 患有基础性疾病、8周内有抗生素用药史的老年患者为感染的危险因素;在院内感染防控中需进一步加强监测。     

多重荧光定量PCR甄别3种霍乱弧菌相关毒素基因

目的为了判定霍乱弧菌是否携带相关毒力因子,研发一种快速、准确、特异检测霍乱弧菌3种毒素基因的多重荧光定量PCR方法。方法针对霍乱弧菌ctxA、ace、zot基因设计引物和探针,建立PCR体系,对70株霍乱弧菌分离株进行鉴定,采用直接测序方法对鉴定结果进行验证。结果建立的多重实时荧光定量PCR方法可同时准确、特异地鉴定霍乱弧菌菌体携带的3种毒素基因,不携带毒素基因的菌株均未出现阳性检测结果。菌体检测的最低检出限度ctxA基因：102 CFU/mL,ace基因和zot基因：10CFU/mL。构建了3种毒素相关基因阳性质粒,ace基因和zot基因的最低检出限度为10copies/μL,ctxA基因的最低检出限度为102 copies/μL,定量检测批间和批内的变异系数均小于5%;对70株霍乱弧菌分离株进行评价,结果显示其中40株（57.2%）携带ctxA毒素基因、31株（44.3%）携带ace毒素基因、46株（65.7%）携带zot毒素基因,通过测序方法验证,符合率达到100%。结论本文建立的多重实时荧光定量PCR方法操作简便、特异性好、灵敏度高,为霍乱弧菌的现场流行病学调查和疫情监测提供了快速、可靠的鉴定工具。     

艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的表达及抗原性分析

目的：构建艰难梭菌（CD）谷氨酸脱氢酶（GDH）的原核表达载体,表达重组蛋白并鉴定其抗原活性。方法以 CD 的 ATCC43255菌株基因组 DNA 为模板,通过 PCR 法扩增 GDH 全长基因片段,构建原核表达载体并转化到大肠杆菌中,IPTG 诱导表达 GDH 蛋白,并用 Ni 柱进行纯化。利用 CD 抗原检测试剂盒对 GDH 抗原区段的抗原性进行鉴定。结果构建的原核表达载体 pET-28a／GDH 可在大肠杆菌中成功表达,获得的 GDH 抗原能与相应抗体产生特异性反应。结论原核表达的 CD 的 GDH 抗原具有很好的抗原活性,为进一步制备相应抗体并建立CD 的 GDH 抗原的免疫检测方法奠定了基础。     

一种用于艰难梭菌分离培养的新型显色培养基的性能评价

目的评价自主研发的艰难梭菌显色培养基(CDCA)性能。方法选用艰难梭菌及其他细菌的标准株进行CDCA显色的特异性评价;将艰难梭菌标准菌株梯度稀释后测定BD公司CDSA、生物梅里埃公司CDIF和CDCA的灵敏度。收集临床120份粪便样本分别采用3种培养基进行艰难梭菌分离培养,并对生长菌落进行质谱鉴定和tpi基因检测,以3种平板中任1种能培养出艰难梭菌的样本定义为真阳性。结果在CDCA平板上除了梭形梭菌、双酶梭菌、第三梭菌、脆弱拟杆菌等菌种能够少量生长并显色外,对其他实验菌种均有抑制作用。CDSA、CDIF和CDCA检测艰难梭菌的灵敏度分别为2.0×10~5 CFU/mL、8.0×10~1 CFU/mL和4.0×10~2 CFU/mL。120份标本中检出艰难梭菌31份(25.8%),CDSA、CDIF和CDCA培养阳性标本分别为25份(20.8%)、28份(23.3%)和26份(21.7%),3种显色培养基对临床腹泻标本检测阳性率差异无统计学意义(χ~2=0.418,P=0.811)。3种显色培养基的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为:CDCA 83.8%、100%、100%、94.7%;CDIF 90.3%、98.9%、96.6%、96.7%;CDSA 80.6%、100%、100%、93.7%。结论本实验室研发的CDCA的特异性和灵敏度较高,可用于临床艰难梭菌的初步分离。     

熔解曲线分析方法甄别肠出血性大肠杆菌O157:H7

目的:采用熔解曲线分析技术,建立一种快速、简便、准确地甄别肠出血性大肠杆菌O157:H7方法。方法:选取肠出血性大肠杆菌O157:H7编码脂多糖基因(rfbE)和编码鞭毛抗原基因(fliC)作为检测靶基因,建立荧光PCR反应体系。结果:通过多种标准菌株试验,结果显示所建立的熔解曲线分析法可特异性地甄别肠出血性大肠杆菌O157:H7;纯培养的灵敏度达到2.8×101cfu/ml;检测108例临床样本,其中18例肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性,3例为肠出血性大肠杆菌O157:非H7阳性,与常规培养方法的符合率达到100%。结论:本方法可简便、准确地甄别肠出血性大肠杆菌O157:H7,结果可靠,通过进一步增加反应体系中引物的数量可同时对肠出血性大肠杆菌其他血清型进行鉴定。     

人博卡病毒外壳蛋白(VP3)的重组表达及间接ELISA检测方法的建立

人博卡病毒（Human Bocavims）是2005年Tobias Allander等从小儿下呼吸道感染分泌物中分离到的新细小病毒，我们曾报道中国分离的人博卡病毒（WLL-1株）的全基因组序列。为了进一步检测分析人博卡病毒感染情况，我们重组表达了人博卡病毒WLL-1株的外壳蛋白（VP3）并建立了间接ELISA检测方法。     

多重荧光定量PCR甄别霍乱弧菌方法的建立

目的 利用多重荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异甄别霍乱弧菌的定量方法.方法 分别根据霍乱弧菌霍乱毒素A亚单位基因(ctxA)和糖基转移酶基因(LPSgt)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan-MGB探针,探针的5'端分别用FAM和VIC进行荧光标记,3'端标记MGB.优化PCR扩增体系,对多重实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性评价,同时进行一定数量临床样本考核鉴定,与常规方法进行比较.结果 该方法可准确、特异地鉴定霍乱弧菌,同时能够甄别O139群霍乱弧菌.全部的霍乱弧菌用ctxA基因对应引物和探针检测均为阳性,其中只有O139群霍乱弧菌出现LPSgt基因阳性,其他菌株均无阳性结果.检测的灵敏度为2×102 cfu/ml.同时对收集的45例临床样本进行鉴定,结果显示10例为霍乱弧菌,其中O139群有4例,其余均为阴性结果,与常规鉴定方法一致.结论 研究建立的多重荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,可有效鉴定产毒霍乱弧菌及甄别O139群霍乱弧菌,可用于霍乱监测和防制工作中的实验室诊断.     

实时荧光定量PCR检测O139群霍乱弧菌研究

目的：利用荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测O139群霍乱弧菌的定量方法。方法：选取O139群霍乱弧菌糖基转移酶基因（LPSgt）作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan探针,探针的两端均进行荧光标记。对PCR扩增体系进行优化,进一步评价实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性后,对收集的临床样本进行鉴定。结果：本文所建立的实时荧光定量PCR方法可准确、特异的检测和鉴定O139群霍乱弧菌,其他菌株均无阳性结果产生;该方法的灵敏度可达到10 cfu/ml;定量检测的批间和批内的变异系数均小于5%;对85例临床样本进行评价,结果获得9例O139群霍乱弧菌阳性,与常规培养法结果完全一致。结论：本文建立的检测O139群霍乱弧菌实时荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,实用性强,可对结果进行定量分析,为O139群霍乱弧菌的实验室诊断和现场流行病学调查提供了较好的分析手段。     

实时荧光定量PCR检测0139群霍乱弧菌研究

目的:利用荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测0139群霍乱弧菌的定量方法.方法:选取0139群霍乱弧菌糖基转移酶基因(LPSgt)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan探针,探针的两端均进行荧光标记.对PcR扩增体系进行优化,进一步评价实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性后,对收集的临床样本进行鉴定.结果:本文所建立的实时荧光定量PCR方法可准确、特异的检测和鉴定0139群霍乱弧菌,其他菌株均无阳性结果产生;该方法的灵敏度可达到10 cfu/ml;定量检测的批间和批内的变异系数均小于5%;对85例临床样本进行评价,结果获得9例0139群霍乱弧菌阳性,与常规培养法结果完全一致.结论:本文建立的检测0139群霍乱弧菌实时荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,实用性强,可对结果进行定量分析,为0139群霍乱弧菌的实验室诊断和现场流行病学调查提供了较好的分析手段.     

小儿人博卡病毒感染临床与实验研究

目的 研究人博卡病毒检测方法与小儿感染的临床特征,以提高对小儿人博卡病毒感染的诊治技术。方法 采用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测患者鼻咽部抽取物、咽拭子和血清标本中的人博卡病毒DNA及特异性抗体,并全面分析感染患儿的各种临床症状、体征及常规实验室检测,同时做远期随访。结果 240例急性下呼吸道感染患者的标本中检出人博卡病毒DNA阳性7例,阳性率为2．92％,其临床表现以高热、阵咳为主,实验室检查外周血白细胞、C-反应蛋白、血沉和血生化指标大多正常。X线胸片表现无特异性,远期随访心肺功能良好。结论 人博卡病毒是引起小儿急性呼吸道感染的重要病原之一,荧光定量PCR和蛋白免疫印迹是灵敏、特异的检测技术。