电针对缺血性脑卒中大鼠记忆功能及脑内突触囊泡蛋白的影响

观察电针对缺血性脑卒中大鼠记忆功能及脑内突触囊泡蛋白（synaptic vesicular protein，SYN）的影响，探讨其可能的作用机制。方法 选取90 只SD大鼠随机分为模型组、电针组、假手术组，每组各30只。线拴法制作急性大脑中动脉缺血大鼠模型。电针组取“百会”“水沟”“内关”“三阴交”穴位，应用“醒脑开窍”法进行电针，每天电针30 min，连续电针6 d休1 d，7 d为一个疗程，首次电针干预在造模成功24 h后进行。模型组和假手术组不进行电针干预。大鼠分别按7、14、21 d 3个亚组进行运动及记忆功能评分，TTC染色测定脑梗死体积、Western blot检测脑内SYN的蛋白表达。结果 电针组运动功能评分较模型组显著降低（P<0.01），电针组进入隐藏区潜伏期时间较模型组显著缩短（P<0.01），电针组脑梗死率较模型组显著缩小（P<0.01），SYN的蛋白表达电针组较模型组明显增强（P<0.01）。假手术组无神经功能缺损及脑梗死灶，SYN表达最弱。结论 电针干预能减小脑梗死体积，上调脑内SYN的表达，进而促进缺血性脑卒中大鼠的记忆及运动等神经功能的恢复。     

肝豆汤改良方对Wilson''s病模型TX乳鼠神经元内Cyt C/Caspase信号通路的分子调控机制

目的:探讨肝豆汤改良方调控TX乳鼠神经元内细胞色素C(Cyt C)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)信号通路的分子靶点并观察其相应的调控机制。方法:本实验乳鼠神经元通过原代方法分离培养所得,分为正常组、模型组、肝豆汤改良方组、丁苯酞组,正常组为正常DL乳鼠神经元,用完全培养基培养,模型组为TX乳鼠神经元,用10%空白兔血清培养,肝豆汤改良方组为TX乳鼠神经元,加入含体积浓度(5%,10%,15%,20%)肝豆汤改良方兔血清的培养基继续培养,丁苯酞组为TX乳鼠神经元,用10%含丁苯酞兔血清培养。采用原子吸收分光光度法检测不同浓度含肝豆汤改良方兔血清作用24 h后,对TX乳鼠神经元内微量元素的影响;流式细胞仪检测经肝豆汤改良方兔血清作用后活性氧(ROS)释放量的变化;蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测经含肝豆汤改良方兔血清作用后Cyt C,Caspase-9,Caspase-3蛋白的表达。结果:与模型组比较,含肝豆汤改良方兔血清可显著降低TX乳鼠神经元内铜、铁含量,增加锌含量(P0.01)。流式细胞仪检测发现,含肝豆汤改良方兔血清较模型组可显著降低TX乳鼠神经元内ROS的释放量(P0.01)。Western blot检测结果显示与模型组比较,含肝豆汤改良方兔血清可显著降低TX乳鼠神经元内Cyt C,Caspase-9,Caspase-3蛋白表达(P0.01)。结论:肝豆汤改良方可能是通过促进过量铜排出而抑制神经元内Cyt C,Caspase-9,Caspase-3表达,从而减轻高铜对神经元的损伤作用。肝豆汤改良方可通过减少脑内铜含量,进而调控Cyt C/Caspase信号通路达到减轻高铜诱导的神经元损伤的治疗效果。     

肝豆汤对Wilson病模型TX小鼠肝细胞内铜代谢通路的分子调控机制

目的:探讨肝豆汤调控毒牛奶(TX)小鼠肝细胞内铜转运通路的分子靶点并观察其相应的调控机制。方法:20只家兔适应性喂养3 d后,随机分为空白组(生理盐水)和肝豆汤组(4.5 g·kg-1·d~(-1)),每日2次ig,连续10 d,制得含药血清;采用2步灌注法分离提取DL,TX小鼠肝细胞,采用原子吸收法检测加含不同百分含量(5%,10%,15%,20%)含肝豆汤兔血清作用24 h后,对TX小鼠肝细胞内微量元素的影响,另设空白组;蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测经含肝豆汤兔血清作用后腺嘌呤核苷三磷酸7b(adenosine triphosphate7b,ATP7b),抗氧化蛋白1(anti-oxidant1,ATOX1),铜转运体1(copper transporter1,CTR1),金属巯蛋白(metallothionein,MT),超氧化剂物歧化酶铜伴侣蛋白(copper chaperone of superoxide dismutase,CCS),细胞色素氧化酶17(cytochrome-coxidase17,COX17)蛋白的表达。结果:与空白组比较,模型组TX小鼠肝细胞内铜含量升高,锌含量降低,铁含量升高,ATP7b,ATOX1,CCS,COX17蛋白表达明显降低,CTR1,MT蛋白表达显著升高(P0.01);与模型组比较,含肝豆汤兔血清可显著降低TX小鼠肝细胞内铜含量,增加锌含量,降低铁含量(P0.05,P0.01);Western blot检测结果显示,含肝豆汤兔血清可明显增加ATP7b,ATOX1,CCS,COX17蛋白表达(P0.05,P0.01),降低CTR1,MT蛋白表达(P0.01)。结论:肝豆汤可能是通过调控细胞内铜代谢相关蛋白,上调ATP7b,ATOX1,CCS,COX17蛋白表达,抑制CTR1,MT表达,从而发挥细胞内排铜作用。肝豆汤可通过多靶点、多途径调控铜代谢通路达到降低肝细胞内铜含量的治疗效果。     

肝豆汤对Wilson病模型铜负荷大鼠肝脏Wnt/β-catenin信号通路的调控作用

目的：探讨肝豆汤对铜负荷大鼠肝脏中分泌型糖蛋白（Wnt）/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路的调控作用及机制。方法：SD大鼠115只随机分为正常组（20只）、造模组。造模组予以1 g·kg^-1·d^-1的硫酸铜饲料及0.02 mL·g^-1·d^-1的0.185%硫酸铜溶液连续喂养12周;造模成功大鼠随机分为模型组（45只）,肝豆汤组（25只）和青霉胺（PCA）组（25只）;模型组、肝豆汤组和PCA组分别予以0.02 mL·g^-1·d^-1生理盐水,0.4 g·kg^-1·d^-1的中药肝豆汤和0.09 g·kg^-1·d^-1青霉胺灌胃,连续4周,末次灌胃后取各组大鼠肝脏组织检测：电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）检测各组大鼠肝铜含量;苏木素-伊红（HE）染色观察各组大鼠肝脏组织病理改变,免疫组织化学法检测肝脏组织氧化应激相关蛋白的表达,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肝组织中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达水平。结果：ICP-AES法结果显示,与正常组比较,模型组大鼠肝脏铜含量显著升高（P<0.01）;肝豆汤可降低铜负荷大鼠肝脏铜含量（P<0.05）,PCA可显著降低模型组大鼠肝脏铜含量（P<0.01）;HE染色结果显示,与正常组比较,模型组大鼠肝脏组织镜下可见肝细胞大小不一、排列紊乱,部分肝索丧失;肝豆汤组和PCA组细胞损伤程度较模型组明显降低;免疫组化结果显示：肝豆汤和PCA可显著降低模型组8-羟基脱氧鸟苷（8-Hydroxyguanosine）,硝基酪氨酸（Nitrotyrosine）蛋白表达量（P<0.01）;Western blot结果显示,肝豆汤和PCA可使铜负荷大鼠肝脏内Wnt通路相关蛋白β-连环蛋白（β-catenin）,磷酸化糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase-3,p-GSK3β）,原癌基因（cellular myelocytomatosis oncogene,c-Myc）蛋白表达量显著增加（P<0.01）。结论：肝豆汤可通过促进过量铜排出减轻高铜诱导的肝脏损伤,并通过激活肝脏Wnt/β-catenin信号通路促进损伤的肝组织代偿性自愈以达到减轻高铜诱导氧化应激损伤的治疗效果。     

肝豆汤联合青霉胺对Wilson病模型肝脏铜死亡抑制作用

目的 观察肝豆汤联合青霉胺对Wilson病（WD）模型肝脏铜死亡的抑制作用。方法 以淡化致死基因（DL）小鼠为正常组,将毒牛奶（TX）小鼠随机分为模型组、肝豆汤组、青霉胺组和肝豆汤联合青霉胺组,每组8只。正常组及模型组予以0.9%氯化钠溶液0.2 mL/（10 g·d）,肝豆汤组、青霉胺组和肝豆汤联合青霉胺组分别予以肝豆汤浓缩液0.2 mL/（10 g·d）,青霉胺0.1 g/（kg·d）,肝豆汤浓缩液 0.2 mL/（10 g·d）联合青霉胺0.1 g/（kg·d）,连续灌胃30天。采用生化法、电感耦合等离子体-质谱法（ICP-MS）、HE染色、透射电镜、实时荧光定量PCR、Western Blot法和免疫组织化学法检测各组小鼠血清学指标和肝脏铜含量、病理改变、线粒体超微结构、铜死亡相关基因和蛋白以及硫辛酸（LA）的表达水平。结果 与正常组比较,模型组血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平,乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和肝组织铜含量升高（P＜0.05）,肝脏局部碎片状坏死,炎性细胞数升高（P＜0.01）,线粒体损伤显著,铜死亡相关基因mRNA,铁硫簇蛋白、硫辛酰化蛋白、LA表达水平下降（P＜0.05）,二氢硫辛酸转乙酰基酶（DLAT）二聚体和热休克蛋白70（HSP70）表达水平升高（P＜0.01）。与模型组比较,各治疗组血清ALT、AST水平,LDH、SOD活性及肝组织铜含量下降（P＜0.05）,肝脏病理损伤减轻,炎性细胞数降低（P＜0.01）,线粒体结构恢复,铜死亡相关基因mRNA、铁硫簇蛋白、lipDLAT、 lipDBT、 lipDLST、LA表达水平升高（P＜0.05）,DLAT二聚体下降（P＜0.05）。与青霉胺组比较,肝豆汤联合青霉胺组 ALT、 AST 水平下降（P＜0.05）,肝组织铜含量降低（P＜0.01）,PDHB mRNA 表达、铁硫簇蛋白、硫辛酰化蛋白表达升高（P＜0.01,P＜0.05）,DLAT二聚体、HSP70 表达下降（P＜0.01）。结论 肝豆汤联合青霉胺可促进铜排出并上调LA途径相关蛋白的表达,减轻WD模型肝脏铜死亡。肝豆汤对青霉胺治疗WD具有辅助增效作用。     

外翻肠囊法研究肝豆汤醇提物主要成分的肠吸收特征

为了探究复方肝豆汤醇提物中主要化学成分的肠吸收特性,该文采用大鼠外翻肠囊模型,选择肝豆汤醇提物中盐酸小檗碱、槲皮素、山柰素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素6种主要成分作为考察对象,评价各成分在不同肠段的吸收特征。结果表明,肝豆汤醇提物中6种成分均可进入肠囊,在高、中、低3种不同质量浓度的肝豆汤醇提物中,盐酸小檗碱、槲皮素、山柰素3种成分在不同肠段的吸收均为线性吸收,符合零级吸收速率,且在空肠与回肠中吸收速率常数K_a随着剂量增加均增加(P0.05),符合被动吸收;而大黄酸在空肠和回肠中的K_a随着剂量增加并无显著性差异,符合主动转运。大黄酚和芦荟大黄素2种成分在肠段中吸收均较差。提示肠囊对肝豆汤醇提物中药物成分吸收具有选择性,各成分在肠囊中的吸收特征并不完全相同。     

电针对脑缺血大鼠神经血管单元及Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的:观察电针对脑缺血大鼠神经血管单元主要标志蛋白——血管内皮生长因子(VEGF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元核抗原(NeuN)和Wnt/β-catenin信号通路关键成分β-连环蛋白(β-catenin)、支架蛋白(Axin2)蛋白及mRNA表达的影响,探讨电针治疗缺血性脑卒中的机制。方法:将108只健康雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、电针组,每组36只,并按照术后7、14、21 d分为3个时相组,每组12只。电凝大鼠大脑中动脉建立永久性大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。电针组大鼠予以电针刺激"百会""水沟"及双侧"三阴交""内关"(2 Hz/100 Hz,2~4 V,30 min)。第1次电针在造模后2 h内进行,此后每天上午电针1次,7 d为1个疗程,最多3个疗程。用Zea Longa评分法评价各组大鼠神经功能缺损情况;用磁共振影像系统检测各组大鼠脑梗死情况;分别用免疫组织化学法和荧光定量PCR法检测各组大鼠缺血区脑组织VEGF、GFAP、NeuN、β-catenin及Axin2蛋白和mRNA的表达。结果:与对照组比较,造模后模型组大鼠神经功能评分和脑梗死体积均明显升高(P<0.01);电针组在术后第7、14、21天神经功能评分和脑梗死体积均显著低于模型组(P<0.01)。与对照组比较,模型组各时点缺血脑组织中VEGF、GFAP、β-catenin蛋白和mRNA表达显著升高(P<0.01),NeuN、Axin2蛋白和mRNA表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较,电针组各时点VEGF、GFAP、NeuN、β-catenin蛋白和mRNA表达显著增多(P<0.01),且随着时间延长,表达均逐渐增加,在第21天达到峰值;Axin2蛋白和mRNA表达明显下降(P<0.01)。结论:电针可以有效保护脑缺血大鼠神经血管单元,减少脑梗死体积,改善MCAO大鼠神经功能缺损症状,其机制可能与上调β-catenin及下调Axin2的表达,激活经典Wnt/β-catenin信号通路有关。     

百里醌调控NLRP3炎症小体对帕金森病模型神经炎症的抑制作用研究

目的：探究百里醌（thymoquinone, TQ）抑制NLRP3炎症小体对帕金森病（parkinson’s disease,PD）模型神经炎性损伤的干预机制。方法：体内实验建立1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱导的PD小鼠模型，随机分为对照组、对照+TQ组、模型组、模型+TQ组；采用旷场、转棒实验评估TQ对PD小鼠运动缺陷的影响；Western blot法检测TQ对PD小鼠中脑组织酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）、α-突触核蛋白（α-Synuclein, α-Syn）和NLRP3炎症小体表达的影响。体外实验用脂多糖和1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+）先后诱导小胶质细胞（BV-2），收集细胞上清作为条件培养液，作用于人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞，构建PD神经炎性损伤模型。采用MTT法测定TQ和MPP+干预的最适浓度，以及各干预组细胞的存活率；TUNEL染色检测细胞凋亡情况；Western blot法检测TQ处理后SH-SY5Y细胞Bax、 Bcl-2、 Caspase-3蛋...     

电针大脑中动脉闭塞模型大鼠血清减轻体外新生乳鼠神经细胞的缺糖低氧损伤的作用研究

目的 观察“电针血清”对新生乳鼠皮质神经细胞糖氧剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation and reoxygenation,OGD/R）损伤的作用。方法 将成年SD大鼠随机分为对照组、模型组、电针组,采用电凝法复制大脑中动脉闭塞模型;7 d后对各组大鼠进行腹主动脉取血,离心,抽取上清,分离新生24 h内SD大鼠乳鼠皮质神经细胞,随机分为对照组、模型组、“电针血清”组。对照组以含正常大鼠血清的培养基培养,模型组进行OGD 2 h后复糖复氧24 h处理,“电针血清”组先以含“电针血清”的培养基培养24 h,其余操作同模型组。MTT法检测各组神经细胞的存活率;TUNEL法检测各组神经细胞凋亡情况;乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）释放实验检测各组神经细胞培养液中LDH漏出水平;检测各组神经细胞内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平。Western blot法检测各组神经细胞Wnt蛋白1（Wnt-1）、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）、β-连环蛋白（β-catenin）、神经细胞核抗原（neuronal nuclear protein,NeuN）蛋白的表达情况。结果 与对照组比较,模型组神经细胞存活率显著降低（P＜0.05）,神经细胞凋亡率显著增多（P＜0.05）;与模型组比较,“电针血清”组神经细胞存活率显著升高（P＜0.05）,神经细胞凋亡率显著减少（P＜0.05）。与对照组比较,模型组SOD活性显著降低（P＜0.05）,MDA含量、LDH漏出量显著增多（P＜0.05）;与模型组比较,“电针血清”组SOD活性显著增加（P＜0.05）,MDA含量、LDH漏出量显著减少（P＜0.05）。与对照组比较,模型组Wnt-1、GSK-3β、β-catenin、NeuN蛋白表达水平显著降低（P<0.05）;与模型组比较,“电针血清”组Wnt-1、β-catenin、NeuN蛋白表达水平显著升高（P<0.05）,GSK-3β表达水平显著降低（P<0.05）。结论 “电针血清”可以减轻缺糖低氧诱导的皮质神经细胞损伤,减少神经细胞的凋亡,其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路相关。