汉坦病毒感染BALB／c小鼠组织中特异性抗原及病毒RNA的检测

目的检测汉坦病毒感染BALB／c小鼠组织中特异性抗原及病毒RNA,建立汉坦病毒感染动物的评价体系。方法将1000LD50的汉坦病毒悬液经肌肉注射感染BALB／c小鼠,在感染后的第3天,分别取小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑等组织研磨后制成病毒悬液,以ELISA法和qRT—PCR法分别检测各组织中的汉坦病毒特异性抗原及病毒RNA。结果BALB／c小鼠感染汉坦病毒后短期内在脑和肝组织中可以检测到大量汉坦病毒特异性抗原以及病毒RNA,而心、脾、肺、肾组织中未检测到特异性抗原及病毒RNA。结论实验结果为建立汉坦病毒感染动物模型的评价体系提供了参考依据。     

Caspase-1对氧诱导视网膜病变中小胶质细胞参与视网膜新生血管生成的促进作用及其机制

目的：探讨Caspase-1对小鼠氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)中小胶质细胞参与视网膜新生血管生成的作用及其机制。

方法：随机将12只7日龄(P7)C57BL/6J小鼠分为正常组、OIR组和OIR+VX-765组,正常组在正常氧环境中饲养,其余两组构建OIR模型; P12～P16,OIR+VX-765组和OIR组分别每天腹腔注射Caspase-1抑制剂VX-765(4mg/kg)和等量0.4%聚乙二醇(VX-765溶剂); 于P17制作视网膜铺片行Lectin染色,比较三组间视网膜无血管区和新生血管区面积的大小; 采用免疫荧光染色法观察视网膜组织中Caspase-1的表达和活化小胶质细胞的分布。培养小胶质细胞BV-2细胞分为对照组、缺氧组及抑制剂组,抑制剂组和缺氧组分别经VX-765和0.4%聚乙二醇预处理3h后,缺氧条件下培养24h; 对照组常规培养相同时间。通过Western blot检测Caspase-1、p20(Caspase-1活化形式)、IL-1β和VEGF的蛋白表达变化; 用各组BV-2细胞培养上清液作为条件培养基,刺激培养血管内皮细胞RF/6A,进行管腔形成和细胞迁移实验,并比较各组间的差异。

结果：P17正常组小鼠视网膜血管化完全,未见明显无血管区及视网膜新生血管; OIR组视网膜无血管区和新生血管面积百分比分别为16.58%±1.14%、4.00%±0.41%; OIR+VX-765组两者明显减少,分别为12.23%±1.02%和2.16%±0.52%(P<0.01)。免疫荧光染色结果显示,Caspase-1在正常小鼠视网膜组织中表达较弱,在OIR小鼠中主要在神经节细胞层和内丛状层有明显的阳性表达,并与活化的小胶质细胞有明确的共定位。Western blot检测结果显示,缺氧处理的培养小胶质细胞BV-2中Caspase-1、p20、IL-1β和VEGF蛋白表达明显提高,而Caspase-1抑制剂则可明显下调p20、IL-1β和VEGF的蛋白表达水平(P<0.05)。管腔形成和细胞迁移实验结果显示,RF/6A细胞经缺氧组BV-2培养上清液处理后,管腔形成长度和细胞迁移数目分别为271±12和347±34个,而加入抑制剂后,二者明显减少,分别为171±22和212±27个(P<0.05)。

结论：在小鼠OIR中,Caspase-1能够调节小胶质细胞促进视网膜新生血管的生成,其作用机制可能与Caspase-1活化小胶质细胞中其下游炎性效应分子IL-1β,并释放VEGF相关。     

整合素αvβ3在SDF-1/CXCR4介导的脉络膜新生血管中的作用

目的　探讨内皮细胞表达的整合素αvβ3在基质细胞衍生因子-1（stromal derived factor-1,SDF-1）/趋势化因子受体4（chemokine receptor 4,CXCR4）调控脉络膜新生血管（choroidal neovascularization,CNV）生成过程中的作用。方法　（1）体内动物实验:采用激光诱导C57BL/6J小鼠CNV模型,实验分为4组:单纯CNV组（对照组）、CNV后立即玻璃体内注射SDF-1组（SDF-1组）、CNV后立即玻璃体内注射SDF-1+CXCR4抑制剂AMD3100组（SDF-1+AMD3100组）和CNV后立即玻璃体内注射SDF-1+αvβ3抑制剂SB273005组（SDF-1+SB273005组）。实时定量PCR观察小鼠激光诱发CNV后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d CXCR4和αvβ3的表达;免疫荧光染色观察4组处理后CNV局部及内皮细胞上αvβ3的表达;OCT观察4组处理后CNV中视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial,RPE）层隆起高度。（2）体外细胞实验:Western blot检测正常对照组、Si-CXCR4敲减组和Si-NC模拟敲减组RF/6A细胞中CXCR4蛋白的表达,同时检测对照组、SDF-1组、SDF-1+AMD3100组、SDF-1+Si-NC组和SDF-1+Si-CXCR4组中整合素αvβ3蛋白的表达。Transwell检测正常对照组、SDF-1组、SDF-1+AMD3100组和SDF-1+SB273005组的细胞迁移能力。结果　（1）体内动物实验:实时定量PCR显示随着CNV诱导后时间的增加,CXCR4 mRNA和整合素亚基β3 mRNA表达开始增加,CXCR4 mRNA在CNV后3 d表达量最高（4.263±0.464）,β3 mRNA在CNV后7 d表达量最高（3.678±0.364）,随后开始下降。免疫荧光结果显示:SDF-1组β3荧光强度显著增加,β3/CD31比率也明显增加,显著高于CNV对照组（P<0.01）;而SDF-1+AMD3100组和SDF-1+SB273005组β3荧光强度和β3/CD31比率显著减弱（P<0.05）。OCT显示SDF-1组RPE层的隆起明显升高（135.503±10.301）μm,显著高于CNV对照组（94.443±12.156）μm（P<0.05）;而SDF-1+AMD3100组和SDF-1+SB273005组RPE隆起的高度显著降低（95.283±20.062）μm和（99.807±10.403）μm（P<0.05）。（2）体外细胞实验:SDF-1组和SDF-1+Si-NC组整合素亚基β3蛋白的表达均升高（1.301±0.043）、（1.273±0.077）,显著高于对照组（0.244±0.069）（P<0.01）;SDF-1+Si-CXCR4组和SDF-1+AMD3100组整合素亚基β3蛋白的水平显著下降（0.322±0.042）、（0.336±0.077）（P<0.01）。Transwell检测显示SDF-1组细胞迁移量增多显著高于对照组,而SDF-1+AMD3100组和SDF-1+SB273005组迁移细胞的数量明显减少。结论　整合素αvβ3在内皮细胞中通过介导SDF-1/CXCR4信号转导,促进CNV的发生发展。