二甲双胍通过激活AMPK/STAT3通路调控巨噬细胞分化抑制小鼠动脉粥样硬化形成

目的 探究二甲双胍(Met)通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/信号转导及转录激活因子3(STAT3)信号通路调控巨噬细胞表型对小鼠动脉粥样硬化(As)形成的影响。方法 体外培养RAW264.7巨噬细胞,使用脂多糖促进巨噬细胞分化,同时使用Met刺激细胞。流式细胞术检测不同表型(CD86、CD206)巨噬细胞比例。Western blot检测相关信号通路蛋白诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg-1)、AMPK、磷酸化AMPK(pAMPK)、STAT3、磷酸化STAT3(pSTAT3)蛋白表达水平。高脂饲料喂养ApoE－/－小鼠构建As模型。实验组(Met组)小鼠予Met灌胃干预,对照组(CTL组)小鼠给予同体积生理盐水灌胃干预。3个月后,提取小鼠大动脉全长(头臂干至双侧髂动脉)及主动脉根部,分别行油红O染色和免疫荧光染色,评价主动脉脂质沉积情况和脂质斑块内巨噬细胞不同表型比例。提取大动脉蛋白,Western blot验证相关信号通路的AMPK、pAMPK、STAT3、pSTAT3蛋白表达水平。结果 细胞实验表明,Met刺激后M1巨噬细胞比例明显减少,M2巨噬细胞比例明显增加(P＜0.05),AMPK活性明显增加,而STAT3活性明显下降。动物实验表明,在造模3个月后,油红O染色示Met组小鼠大动脉全长和主动脉瓣膜处脂质沉积均较CTL组明显减少(P＜0.05)；免疫荧光染色示Met组脂质斑块内M1巨噬细胞比例较CTL组明显减少,而M2巨噬细胞比例较CTL组明显增多(P＜0.05)。Western blot实验显示,与CTL组相比,Met组AMPK活性明显增加,而STAT3活性明显降低(P＜0.05)。结论 Met通过激活AMPK抑制STAT3活性,调控斑块内巨噬细胞表型分化,抑制小鼠As形成。     

携P-选择素单抗靶向超声微泡评价小鼠下肢缺血-再灌注损伤

目的 探讨自制的携P-选择素靶向微泡(MBp)结合对比超声在小鼠骨骼肌缺血-再灌注损伤(isehemia-reperfusion injury,I-R)中的诊断价值.方法 制备生物素化脂质微泡(MBb)及MBp.研究选用6只7～8周龄的昆明小鼠,以动脉夹夹闭-松开小鼠一侧股动脉制备下肢I-R模型,另一侧下肢作为对照组.分别注入等量(5×106)MBb及MBp后行对比超声检查,分析骨骼肌显影的声强度(video intensity,VI).结果 MBp的VI值在I-R组[(19.5±3.7)U]明显高于对照组[(4.1±0.7)U,P<0.053,MBb在I-R组的VI值[(8.5±2.1)U]较对照组有显著性差异[(3.7±0.7)U,P<0.053,但MBp在I-R组的VI值[(19.5±3.7)U]约为MBb组的2.3倍[(8.5±2.1)U,P<0.05].结论 MBp结合对比超声可有效评价骨骼肌I-R的炎症反应,将可用于评价微血管炎症或相关的血管内皮反应.     

P-选择素靶向超声微泡与普通超声微泡粘附途径和效能的对比研究

目的荧光显微镜直视下对比评价P-选择素靶向超声微泡与普通超声微泡在炎症内皮上的粘附途径和效能。方法构建携荧光FITC、抗P-选择素单抗的靶向超声微泡（MBp）和携荧光FITC普通超声微泡（MB）,随机经静脉弹丸式分别注入对照组（10只）和肿瘤坏死因子（TNF—α）处理组（10只）的小鼠提睾肌炎症模型。同时,20高倍荧光显微镜观测5min内两组不同微泡在提睾肌微血管中的粘附数量和粘附途径。结果TNF—α处理组MBp粘附数量为（12±2．6）个／视野,而MB粘附数量为（3±1．2）个／视野,两者差异有统计学意义（P〈0．01）;且TNF—α处理组MBp粘附数量分别为对照组MBp和MB的（6．4±1．7）倍和（9．9±2．1）倍（P〈0．01）。TNF-Ⅱ处理组和对照组分别有（69．6±2．6）％和（56．6±25．4％）的MBp通过直接与内皮细胞结合实现粘附,而MB内皮粘附率仅为（24．6±23．3）％和（20．0±27．4）％。结论与MB比较,MBp能高效、特异地粘附于炎症组织血管内皮上,应用其可有效评价血管内皮炎症反应或其他组织损伤。     

携Sialyl Lewis^X超声微泡靶向探查缺血心肌的炎症分子“印记”

目的探讨应用靶向超声分子成像探查心肌缺血再灌注损伤炎症“印记”的可行性。方法采用“亲和素-生物素”桥接法构建携唾液酸化路易斯（Sibyl Lewis^X）靶向超声微泡（MBsLex）和同型对照微泡（MBc）。10只心肌缺血再灌注小鼠随机先后注入MBsLex和MBc（间隔30min）,分别于注入5min后行心肌对比超声检查,测量心肌缺血区和非缺血区的声强度（Ⅵ）。结果对比超声图像显示MBsLex组缺血区心肌造影见显著增强,Ⅵ值高达23．52±1．08,而在MBc组缺血区心肌造影仅见轻度增强,Ⅵ缸为9．81±0．41,两者之间差异有统计学意义（P〈0．05）。但无论MBsLex组还是MBc组,缺血区心肌Ⅵ值均明显高于非缺血区心肌Ⅵ值（P〈0．05）。两组非缺血区心肌之间Ⅵ值未见明显差异。结论应用携sLex超声微泡行对比超声能够靶向探查心肌缺血再灌注损伤的炎症“印记”。     

富血小板血浆可减轻大鼠急性心肌缺血-再灌注损伤

目的 探讨富血小板血浆（PRP）对急性缺血-再灌注损伤心肌的保护作用及其机制。方法 制备PRP并测量PDGF-BB和TGF-β1的浓度;SD大鼠乳鼠心肌细胞缺氧3 h后,在复氧条件下分别用1%、5%、10%、20%体积的PRP共培养细胞12 h,检测细胞活力,同时对心肌细胞进行免疫荧光染色,提取蛋白检测AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）及其磷酸化水平;检测PRP对大鼠主动脉内皮细胞增殖及迁移的影响;以SD大鼠建立心肌缺血-再灌注损伤模型,在恢复灌注后立刻在结扎部位周围四个部位注射100 μL的PRP（PRP组,n=20）或生理盐水（Control组,n=20）,1 d后各组随机选6只大鼠取材心脏行TTC染色并测量肌钙蛋白I的浓度,其余动物1周后通过超声心动图检测心功能,并取材心脏进行HE染色;体外对RAW264.7细胞缺氧3 h,分别给予PRP或生理盐水作用24 h后行流式细胞仪检测M1和M2型巨噬细胞的极化情况。结果 PRP中PDGF-BB和TGF-β1的浓度显著高于全血,1%体积PRP可以显著减少缺氧-复氧所导致的心肌细胞死亡,其保护作用与AMPK的激活密切相关;PRP促进内皮细胞的增殖与迁移;动物实验中PRP组梗死面积和肌钙蛋白I浓度均小于生理盐水组（P<0.001）,超声显示PRP组心功能明显改善,HE染色示缺血区域炎症反应较生理盐水组明显减轻;RAW264.7细胞经PRP处理M1型巨噬细胞减少,M2型巨噬细胞增 多。结论 PRP通过促进AMPK磷酸化及巨噬细胞免疫调节作用来改善大鼠心肌急性缺血-再灌注损伤区域的炎症微环境,从而起到心肌保护的作用。     

小鼠心肌缺血再灌注模型制备及其超声分子成像研究

目的以显微外科技术建立小鼠心肌缺血-再灌注模型,用其评价携抗P-选择素单抗靶向微泡(MBp)的"心肌炎症"超声分子成像效果。方法 30只昆明小鼠随机均分为缺血-再灌注(ischemia-reperfusion,IR)和假手术(sham surgery,SH)组,手术组结扎冠脉前降支15min,再灌注1h。心电图、M型超声、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)和HE染色评价模型构建情况,分别将普通微泡和MBp经静脉注射到实验小鼠体内,评价MBp的超声分子成像效果。结果结扎前降支时前壁心肌呈明显充盈缺损,心电图ST段呈弓背向上抬高。再灌注后充盈缺损消失,ST段降至正常;M型超声检查显示,IR组左室短轴缩短率(LV-%FS)明显低于假手术组(P0.05);心脏TTC染色无坏死表现,而HE染色提示缺血区心肌存在炎症改变;MBp造影显示前壁心肌呈选择性显影增强,前壁视频强度(video intensity,Ⅵ)明显高于后壁(P0.01)。增强区域与结扎前降支时的充盈缺损区域高度相关(r=0.95)。结论 MBp可以有效评价心肌缺血再灌注"炎症"损伤,小鼠心肌缺血再灌注模型适宜于超声和其它显像方法的"炎症"分子成像研究。     

携IgG单抗靶向超声造影剂的构建及其靶向效能的体外评价

目的 构建携羊抗小鼠IgG单抗靶向超声造影剂(UCA-IgG)及体外评价其靶向黏附效能.方法 采用"亲和素-生物素"桥接法构建UCA-IgG,体外荧光法鉴定IgG单抗与生物素化造影剂特异结合.利用平行板流动腔在不同时间点、不同浓度小鼠IgG包被和不同剪切应力下,测定相应的UCA-IgG的结合数目及达到半数解离时的剪切应力.设不同浓度小鼠包被的平行板流动腔为实验组,羊抗小鼠IgG封闭组和空白组为对照组.结果 UCA-IgG发出明亮的绿色荧光,而普通脂质造影剂无荧光显示.实验组UCA-IgG结合数量随包被浓度的增高而增加(P<0.05),并与结合时间呈明显正相关(P<0.05),然而与剪切应力呈现双向性(P<0.05).而两对照组均未见明显的UCA-IgG结合.UCA-IgG达半数解离的剪切应力随包被浓度的增加而增大(P<0.05).结论 在不同血流动力学条件下UCA-IgG可与小鼠IgG特异有效结合,携羊抗小鼠IgG单抗造影剂可为其他特异靶向超声造影剂的体外研究提供有力的支持.     

P选择素靶向超声分子成像评价小鼠心肌缺血再灌注损伤

目的 探讨靶向对比超声分子成像评价心肌缺血再灌注损伤的可行性.方法 采用"亲和素-生物素"桥接法构建携抗小鼠P选择素单抗靶向微泡(MBp)和携同型抗体对照微泡(MBC).10只心肌缺血再灌注(IR)小鼠先后注入MBp和MBc(间隔30 min),分别于注入5 min后行心肌对比超声心动图(MCE)检查,测量心肌缺血区和非缺血区的声强度(Ⅵ).结果 对比超声图像显示MBp组缺血区心肌可见造影显著增强,Ⅵ值高达(26.0±6.2)U,而在MBc组缺血区心肌仪见轻度造影增强,Ⅵ值为(9.1±0.9)U,差异有统计学意义(P<0.05).MBp组和MBc组缺血区心肌Ⅵ值均明显高于非缺血区心肌Ⅵ值[(6.5±1.0)U,(6.4±0.8)U,P<0.05].两组非缺血区心肌之间Ⅵ值未见明显差异.结论 应用P选择素靶向对比超声分子成像能够有效评价心肌缺血再灌注损伤.     

心肌型肌球蛋白轻链激酶调控肌球蛋白轻链对心肌肥大的影响

  目的  探讨心肌型肌球蛋白轻链激酶(cardiac myosin light chain kinase, cMLCK)对AngⅡ诱导的心肌肥大的作用。  方法  纯化cMLCK作为激酶,体外激酶反应实验探索cMLCK活性位点。制作野生型cMLCK(WT-cMLCK)及敲除了氨基端(N端)的变异体(ΔNT-cMLCK)腺病毒,感染原代心肌细胞,并用随机数法随机分为6组:对照组、AngⅡ组、WT-cMLCK组、WT-cMLCK+AngⅡ组、ΔNT-cMLCK组、ΔNT-cMLCK+AngⅡ组,每组3个样本。RT-PCR检测心衰因子表达;Western blotting检测cMLCK及底物的表达;免疫荧光检测细胞表面积。  结果  WT-cMLCK在体外体系能对其底物MLC2v进行磷酸化;而ΔNT-cMLCK对MLC2v的磷酸化作用消失;使用AngⅡ处理后,可见细胞面积增大[(1 787.0±142.6)μm2 vs.(2 458.0±211.3)μm2,P < 0.001],ANP、β-MHC表达上调(均P < 0.05);cMLCK及p-MLC2v表达上调(均P < 0.05);过表达WT-cMLCK可逆转心肌肥大[(2 527.0±116.4)μm2 vs.(1 775.0±88.5)μm2,P < 0.001];敲除N端可使cMLCK的保护作用丧失[(1 775.0±88.5)μm2 vs.(2 613.0±118.4)μm2,P < 0.001]。  结论  过表达cMLCK可改善AngⅡ诱导的心肌肥大,该作用依赖于其N端。      

流式细胞术定量评价携抗P-选择素单抗靶向超声微泡配体结合效率

目的 流式细胞术定量评价应用生物素(B)-亲和素(S)-生物素(B)桥连技术构建的携抗P-选择素靶向微泡(MB-BSBp)的配体结合效率.方法 以未标记荧光的MB-B作对照,用不同荧光物质分别标记MB-BSBp不同部位, 应用流式细胞仪分析各组微泡的荧光强度并定量配体结合率.C57小鼠8只建立肾脏缺血再灌注模型载体评价靶向微泡成像质量.结果 MB-B与FITC-streptavidin的结合率达99%;DTAF-二抗与MB-BSBp的结合率为(59.66±2.30)%,明显高出荧光二抗与MB-BS和MB-B的结合,比率分别为(29.87±1.68)%和(26.50±3.86)%(P<0.05).结论 抗P-选择素单抗通过生物素桥连法有效装配在MB-B表面,流式细胞术可能是定量评价靶向微泡配体结合效率的有效方法.