氧化应激所致C2C12肌源细胞核仁损伤的分子机制

目的探讨氧化应激诱导细胞核仁损伤的分子机制.方法向传代培养的C2C12肌源细胞中加入0.5mmol/L过氧化氢以模拟氧化应激.结果甲苯胺兰染色发现正常C2C12细胞可见一个位于中央的,浓染致密的核仁颗粒.过氧化氢处理后3h,可见明显的核仁分离,处理6h最为明显.细胞总蛋白质合成能力分析发现过氧化氢处理后6h细胞总蛋白质合成能力显著下降(与正常对照比P＜O.05),并持续至24h.免疫印迹检测核仁素(又称C23)发现,过氧化氢处理1h后可见-80kDa条带,而其110kDa主带明显减弱,过氧化氢处理6h和12h最为明显.用脂质体将核仁素反义核酸导入细胞后24h,免疫印迹发现核仁素表达明显被抑制,同时也可观察到细胞总蛋白合成能力下降及明显的核仁分离.结论氧化应激通过诱导核仁蛋白质核仁素的裂解并使其110kDa全长分子的量减少,而导致C2Cl2细胞核仁损伤.     

核仁素反义寡核苷酸对RAW264.7细胞增殖与凋亡的影响

【目的】探讨核仁素反义寡核苷酸对RAW264．7细胞增殖与凋亡的影响。【方法】采用反义寡核苷酸技术以抑制RAW264．7细胞中核仁素的表达后,用MTT法检测细胞增殖状况,流式细胞术及DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。【结果】免疫印迹结果显示,反义寡核苷酸导入细胞后24h,核仁素的表达被显著抑制,同时反义寡核苷酸处理组细胞的增殖能力明显受到抑制,细胞凋亡百分率显著升高,并能检测到清晰的“梯状条带”。而正义及随机寡核苷酸导入细胞后不能降低核仁素的表达,对细胞增殖及凋亡均无明显影响。【结论】核仁素表达下调能抑制RAW264．7细胞增殖并能触发RAW264．7细胞凋亡。     

采用反义寡核苷酸探讨HSP70对活性氧所致心肌细胞损伤的影响

目的探讨HSP70对活性氧所致心肌细胞急性损伤的保护作用.方法用热休克预处理诱导新生大鼠心肌细胞中HSP70的表达,采用HSP70反义寡核苷酸阻断HSP70的表达,乳酸脱氢酶释放率和细胞总蛋白质合成能力来反映H2O2 0.5 mM所致心肌细胞损伤程度.结果H2O2引起心肌细胞乳酸脱氢酶释放率明显升高,而细胞总蛋白质的合成降低.热休克预处理导致心肌细胞中HSP70表达明显增加,并使H2O:所致心肌细胞LDH释放率显著降低,细胞总蛋白质的合成基本恢复正常水平.HSP70反义寡核苷酸很大程度上阻断了HSP70的表达及热休克预处理的心肌细胞保护作用.结论在热休克预处理减轻过氧化氢所致乳鼠心肌细胞急性损伤的作用中,HSP70发挥了最主要的作用.     

热休克反应对氧化应激所致nucleolin裂解的影响

观察热休克反应对氧化应激（0.5 mmol/L H2O2）诱导细胞凋亡发生时 nucleolin(C23)裂解的影响并探讨其机制。方法： 采用caspase-3 活性定量分析及免疫印迹技术检测氧化应激诱导的原代心肌细胞、RAW 264.7巨噬细胞 及K562白血病细胞凋亡及C23的裂解；通过热休克反应观察热休克反应对C23裂解的影响。结果： 0.5 mmol/L H2O2处理细胞2 h caspase-3活性显著升高，12 h达高峰。免疫印迹结果显示上述各种细胞的C23蛋白均发生了裂解（有80 kD裂解片断出现），而且最早出现裂解片段的时间都在H2O2处理30 min到1 h左右；同时热休克反应通过诱导HSP70，HSP25等应激蛋白表达而显著减少氧化应激所致C23的裂解。结论： 氧化应激诱导凋亡发生的同时也引起C23的裂解；热休克反应显著抑制氧化应激所致C23的裂解，其机制与热休克反应诱导多种热休克蛋白表达有关。     

热休克因子在过氧化氢所致小鼠胚胎成纤维细胞损伤中的作用

[目的]探讨热休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)对过氧化氢所致小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)损伤的影响.[方法]利用HSF1基因敲除(HSF1-/-)小鼠和转基因技术,通过稳定转染SV40大T抗原基因,建立缺失HSF1基因(HSF1-/-纯合子)和含有HSF1基因(HSF1 / 野生型)的永生化MEFs,并采用免疫印迹和基因组DNA PCR技术进行鉴定.向细胞培养基中加入终浓度为0.5 mmol/L的过氧化氢导致细胞损伤,采用甲苯胺兰染色和总蛋白合成能力分析方法来判定致细胞损伤程度(核仁的结构和功能改变).[结果]PCR产物电泳显示在各种基因型MEFs中均含有SV40大T抗原基因,在HSF1-/-MEFs中仅含有替代基因,在HSF1 / MEFs中仅含HSF1基因,在HSF1-/ MEFs中则含有替代基因和HSF1基因;免疫印迹显示热休克反应(heat shock response,HSR)不能诱导HSF1-/-MEFs中HSP70表达.甲苯胺兰染色和总蛋白合成能力分析显示0.5 mmol/L过氧化氢可引起HSF1 / MEFs及HSF1-/-MEFs核仁分离及蛋白质合成抑制,与正常对照组相比,P＜0.05;HSR能显著抑制过氧化氢所致HSF1 / MEFs核仁分离及蛋白质合成抑制,与单纯过氧化氢损伤组相比,P＜0.05,但HSR对过氧化氢所致HSF1-/-MEFs核仁分离及蛋白质合成抑制没有影响,与单纯过氧化氢损伤组相比,P＞0.05.[结论]HSR以一种HSF1依赖方式显著抑制过氧化氢所致细胞核仁结构与功能损伤.     

热休克蛋白72在氧化应激所致急性乳鼠培养心肌细胞损伤中的作用

目的：探讨HSP72对氧化应激所致心肌细胞急性损伤的保护作用。方法：用热休克预处理诱导新生大鼠心肌细胞中HSP72的表达，采用HSP72反义寡核苷酸阻断HSP72的表达。向原代培养的乳鼠心肌细胞中加入终浓度为0．5mmol／LH2O2，以模拟氧化应激。测定乳酸脱氢酶释放率和细胞总蛋白质合成能力。结果：氧化应激引起心肌细胞乳酸脱氢酶释放率明显升高，而细胞总蛋白质的合成降低。热休克预处理导致心肌细胞中HSP72表达明显增加，并使H2O2所致心肌细胞LDH释放率显著降低，细胞总蛋白质的合成基本恢复正常水平。HSP72反义寡核苷酸能在很大程度上阻断HSP72的表达及热休克预处理所所致的心肌细胞保护作用。结论：在热休克预处理减轻过氧化氢所致乳鼠心肌细胞急性损伤的作用中，HSP72发挥了主要作用。     

Kruppel样因子4过表达对C2C12肌原细胞中热休克蛋白25表达的影响

目的观察Kruppel样因子4过表达对热休克蛋白25表达的影响。方法运用稳定转染pcDNA3.1/myc-His(-)和Kruppel样因子4-pcDNA3.1/myc-His(-)两种细胞株,采用逆转录聚合酶链反应观察Kruppel样因子4在生理状态和热休克反应时对热休克蛋白25 mRNA表达的影响;采用Western blot观察Kruppel样因子4在生理状态和热休克反应时对热休克蛋白25蛋白表达的影响。结果在正常状态下,两种细胞热休克蛋白25 mRNA及蛋白表达水平均较低。生理状态下,热休克恢复1 h及3 h Kruppel样因子4过表达细胞株热休克蛋白25 mRNA表达水平明显高于转空载体细胞;至热休克恢复6 h后两组细胞热休克蛋白25 mRNA表达无明显差异。在生理状态及热休克恢复不同时间后,Kruppel样因子4过表达细胞热休克蛋白25蛋白表达水平均较空载体组明显增加。结论在生理状态下和热休克反应中,Kruppel样因子4过表达均能够促进C2C12肌原细胞中热休克蛋白25高表达。     

一种快速分离C2C12细胞核仁的方法研究

[目的]探讨一种快速分离核仁且能保持其完整结构与功能的方法.[方法]采用低渗裂解分离细胞核,密度梯度离心分离细胞核仁,电镜、免疫印迹检测核仁的纯度.[结果]电镜检测发现在放大2 000倍时C2C12肌源细胞核仁呈现为大小基本一致、形态较为规则的黑色阴影,放大25 000倍时可见单个网孔状的核仁,且核仁各组分清晰可见.免疫印迹检测发现核仁纯度较高,没有胞浆蛋白的污染.[结论]本研究建立了一种快速分离细胞核仁的方法.     

机能实验教学现状分析与学生科研能力培养对策

本文作者以在校七年制医学生的身份调查发现,中南大学湘雅医学院现行的机能实验教学体系(包括生理学、病理生理学和药理学的实验)虽然在训练七年制医学生科研能力方面进行了积极有效的探索与尝试,但仍然无法满足学生的需求,尚需要进一步加强.对此,作者结合自己的学习经历和体会进行了初步分析与思考,并设想建立一种"组织课外科研小组,开放机能实验室"的创新人才培养模式,为确保人才培养质量探索一条新路.     

热休克蛋白70对氧化应激所致核仁素裂解的影响

为探讨热休克蛋白70对氧化应激(0．5mmol／L过氧化氢)所致核仁素裂解的影响及其机制，采用免疫印迹技术检测氧化应激诱导核仁素的裂解；通过热休克反应和构建热休克蛋白70转基因细胞观察热休克反应与热休克蛋白70对核仁素裂解的影响，同时采用免疫共沉淀技术检测热休克蛋白70与核仁素之间的相互作用。结果发现，0．5mmol／L过氧化氢可导致多种细胞的核仁素发生裂解(有80kDa裂解片断出现)，而且最早出现裂解片段的时间都在过氧化氢处理30min到lh左右；热休克预处理及转热休克蛋白70后均引起热休克蛋白70的表达明显增加，同时显著抑制抑制氧化应激所致核仁素裂解片段的出现，免疫共沉淀结果显示在氧化应激时热休克蛋白70与核仁素直接结合，形成复合物。以上结果提示，热休克反应与热休克蛋白70可以显著抑制氧化应激所致核仁素的裂解，其机理与氧化应激时热休克蛋白70与核仁素直接结合有关。