心型脂肪酸结合蛋白对脂多糖所致心肌细胞损伤的保护作用

目的：探讨心型脂肪酸结合蛋白(heart-fatt y acid binding protein,H-FABP)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS) 所致心肌细胞损伤的保护作用。方法：以原代培养的新生大鼠心肌细胞为模型,通过基因转染方式改变H-FABP表 达水平,采用Western印迹、定量PCR检测原代培养中H-FABP的表达。分别检测心肌细胞培养液中TNF-α,IL-1β,乳 酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量以及细胞存活率来反映LPS诱导的心肌细胞损伤与炎症反应。结果：LPS处 理24 h能增加H-FABP表达。SiRNA降低H-FABP后,显著促进LPS引起的心肌细胞存活率下降、LDH释放以及TNF-α和 IL-1β释放。相反,H-FABP过表达能显著抑制LPS引起的心肌细胞损伤与炎症反应。结论：H-FABP对LPS引起的心肌 细胞损伤具有保护作用。     

大鼠心肌缺血预适应相关基因5的克隆与特性分析

目的采用生物信息学分析表达序列标签AW918640以获得其所代表基因的全长序列,并对该基因进行初步的特性分析。方法利用基因银行(GeneBank)数据库,通过BLAST比对等生物信息学方法进行电子克隆,采用逆转录聚合酶链反应和基因测序等技术进行鉴定,采用mapviewer软件进行染色体定位,ExPASy和SMART软件对获得的全长基因进行翻译和蛋白质功能结构分析。结果AW918640(基因银行登录号)为一个在大鼠心肌缺血预适应后3h表达升高的表达序列标签序列,通过电子克隆得到其所代表基因的全长,且为一新基因,经逆转录取合酶链反应和基因测序证实后,将其命名为心肌缺血预适应相关基因5(MIP5),并在基因银行数据库上登录,登录号为AY553870。心肌缺血预适应相关基因5最大开放读码框为909bp,编码302个氨基酸,含有6个kelch重复基序。结论心肌缺血预适应相关基因5为一与大鼠心肌缺血预适应相关的新基因。     

氧化应激所致C2C12肌源细胞核仁损伤的分子机制

目的探讨氧化应激诱导细胞核仁损伤的分子机制.方法向传代培养的C2C12肌源细胞中加入0.5mmol/L过氧化氢以模拟氧化应激.结果甲苯胺兰染色发现正常C2C12细胞可见一个位于中央的,浓染致密的核仁颗粒.过氧化氢处理后3h,可见明显的核仁分离,处理6h最为明显.细胞总蛋白质合成能力分析发现过氧化氢处理后6h细胞总蛋白质合成能力显著下降(与正常对照比P＜O.05),并持续至24h.免疫印迹检测核仁素(又称C23)发现,过氧化氢处理1h后可见-80kDa条带,而其110kDa主带明显减弱,过氧化氢处理6h和12h最为明显.用脂质体将核仁素反义核酸导入细胞后24h,免疫印迹发现核仁素表达明显被抑制,同时也可观察到细胞总蛋白合成能力下降及明显的核仁分离.结论氧化应激通过诱导核仁蛋白质核仁素的裂解并使其110kDa全长分子的量减少,而导致C2Cl2细胞核仁损伤.     

膜表面核仁素对内毒素所致THP-1细胞炎症介质表达的影响

目的探讨THP-1细胞膜定位核仁素作为寡糖链受体在脂多糖所致炎症反应中的作用。方法采用间接免疫荧光、流式细胞术以及细胞膜蛋白免疫印迹等技术证实核仁素在人THP-1细胞膜表面表达。以无血清状态下脂多糖刺激THP-1细胞为炎症细胞模型，采用逆转录聚合酶链反应及酶联免疫吸附测定法等检测核仁素抗体对炎症介质肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的表达与分泌的影响。结果间接免疫荧光、流式细胞术以及免疫印迹证实核仁素可在人THP-1细胞膜表面表达。逆转录聚合酶链反应结果发现，在无血清条件下，500μg/L脂多糖刺激1h、2h、3h或4h后可以明显促进肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达，而核仁素抗体处理1h后再用脂多糖刺激1h、2h、3h或4h，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达明显受到抑制。而先用正常IgG体处理1h后再用脂多糖刺激1h、2h、3h或4h，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达与单用脂多糖刺激水平相当。另外单用正常IgG或核仁素抗体处理1～4h，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达与对照组比较无差异。酶联免疫吸附测定法检测发现，核仁素抗体处理1h后能明显抑制脂多糖所致肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的分泌，而IgG则没有这种作用。结论THP-1细胞膜表面核仁素参与了脂多糖所致炎症反应，提示核仁素可能是脂多糖的一种新受体。     

核仁素在细胞增殖与细胞凋亡中的作用

核仁素（又称C23）是真核细胞核仁中最主要的一种蛋白质，具有多种生物学功能，它不但直接参与核糖体的生物合成与成熟，还直接或间接参与细胞增殖、生长、胚胎发生、胞质分裂、染色质复制与核仁的发生等过程。最新研究表明，细胞凋亡的发生与核仁素蛋白的断裂和转位改变相关。核仁素双向核定位序列决定其在细胞核与细胞浆之间的物质转运以及细胞核功能的细胞外调节中起重要作用。     

热休克反应对氧化应激所致nucleolin裂解的影响

观察热休克反应对氧化应激（0.5 mmol/L H2O2）诱导细胞凋亡发生时 nucleolin(C23)裂解的影响并探讨其机制。方法： 采用caspase-3 活性定量分析及免疫印迹技术检测氧化应激诱导的原代心肌细胞、RAW 264.7巨噬细胞 及K562白血病细胞凋亡及C23的裂解；通过热休克反应观察热休克反应对C23裂解的影响。结果： 0.5 mmol/L H2O2处理细胞2 h caspase-3活性显著升高，12 h达高峰。免疫印迹结果显示上述各种细胞的C23蛋白均发生了裂解（有80 kD裂解片断出现），而且最早出现裂解片段的时间都在H2O2处理30 min到1 h左右；同时热休克反应通过诱导HSP70，HSP25等应激蛋白表达而显著减少氧化应激所致C23的裂解。结论： 氧化应激诱导凋亡发生的同时也引起C23的裂解；热休克反应显著抑制氧化应激所致C23的裂解，其机制与热休克反应诱导多种热休克蛋白表达有关。     

采用反义寡核苷酸探讨HSP70对活性氧所致心肌细胞损伤的影响

目的探讨HSP70对活性氧所致心肌细胞急性损伤的保护作用.方法用热休克预处理诱导新生大鼠心肌细胞中HSP70的表达,采用HSP70反义寡核苷酸阻断HSP70的表达,乳酸脱氢酶释放率和细胞总蛋白质合成能力来反映H2O2 0.5 mM所致心肌细胞损伤程度.结果H2O2引起心肌细胞乳酸脱氢酶释放率明显升高,而细胞总蛋白质的合成降低.热休克预处理导致心肌细胞中HSP70表达明显增加,并使H2O:所致心肌细胞LDH释放率显著降低,细胞总蛋白质的合成基本恢复正常水平.HSP70反义寡核苷酸很大程度上阻断了HSP70的表达及热休克预处理的心肌细胞保护作用.结论在热休克预处理减轻过氧化氢所致乳鼠心肌细胞急性损伤的作用中,HSP70发挥了最主要的作用.     

诱导脂肪干细胞成软骨分化的研究进展

由创伤或其他病因引起的关节软骨病变通常难以自愈,且目前临床上的治疗方法疗效欠佳。脂肪干细胞 (adipose derived stem cells,ADSCs)是一种来自脂肪组织、具有多向分化潜能的干细胞,基于ADSCs成软骨分化能力的 组织工程学疗法为关节软骨缺损的修复再生提供了新的思路。体外诱导ADSCs分化成软骨的方法主要是采用生长因 子和支架材料模拟体内微环境,进而促进ADSCs向软骨细胞分化,其相关应用已取得初步成功。     

HSF1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞的永生化

目的：建立HSF1^-/-，HSF1^＋/＋两种基因型小鼠胚胎成纤维永生化细胞系，为HSF1的功能研究提供实验模型。方法：用脂质体介导的基因转染法将pSV3neo质粒导入HSF1^-/-，HSF1^＋/＋两种基因型小鼠胚胎成纤维细胞，经G418筛选，抗性克隆扩大培养，建立永生化细胞系；用PCR检测两种细胞株中目的基因的整合，用RT—PCR法鉴定SV40T基因在转染细胞中的表达；用Western blot检测所建细胞株的诱导型热休克蛋白70的表达情况。结果：有3个细胞克隆已扩大培养稳定传代达6个月，经鉴定SV40T抗原已整合到两种细胞中且稳定表达，HSF1^-/-胚胎成纤维细胞热休克蛋白70的诱导表达消失。结论：成功建立永生化HSF1^-/-，HSF1^＋/＋两种基因型小鼠胚胎成纤维细胞。     

HSF1抑制热应激所致RAW264.7巨噬细胞凋亡

目的:探讨热休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)对热应激所致Raw2 6 4.7巨噬细胞凋亡的影响。方法:采用热应激(4 2.5℃±0.5℃)处理稳定表达小鼠HSF1基因的Raw2 6 4.7巨噬细胞1h,3 7℃分别恢复6,9,1 2,2 4 h,采用流式细胞术,hoechst3 3 2 5 8染色和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果:流式细胞术结果显示,热应激后对照组(转空载体)细胞凋亡核百分率较热应激前明显升高,9 h达峰值(约为6 0%),此时荧光染色可见3 0%的细胞出现核固缩,凋亡小体等典型的凋亡形态学改变;并于热应激后6,9,1 2 h均能检测到清晰的DNA梯状条带。与转空载体对照组相比,HSF1过表达能显著降低热应激所致凋亡及明显抑制DNA的断裂。结论:HSF1可以抑制热应激所致的Raw2 6 4.7巨噬细胞凋亡。