膜表面核仁素对内毒素所致THP-1细胞炎症介质表达的影响

目的探讨THP-1细胞膜定位核仁素作为寡糖链受体在脂多糖所致炎症反应中的作用。方法采用间接免疫荧光、流式细胞术以及细胞膜蛋白免疫印迹等技术证实核仁素在人THP-1细胞膜表面表达。以无血清状态下脂多糖刺激THP-1细胞为炎症细胞模型，采用逆转录聚合酶链反应及酶联免疫吸附测定法等检测核仁素抗体对炎症介质肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的表达与分泌的影响。结果间接免疫荧光、流式细胞术以及免疫印迹证实核仁素可在人THP-1细胞膜表面表达。逆转录聚合酶链反应结果发现，在无血清条件下，500μg/L脂多糖刺激1h、2h、3h或4h后可以明显促进肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达，而核仁素抗体处理1h后再用脂多糖刺激1h、2h、3h或4h，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达明显受到抑制。而先用正常IgG体处理1h后再用脂多糖刺激1h、2h、3h或4h，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达与单用脂多糖刺激水平相当。另外单用正常IgG或核仁素抗体处理1～4h，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达与对照组比较无差异。酶联免疫吸附测定法检测发现，核仁素抗体处理1h后能明显抑制脂多糖所致肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的分泌，而IgG则没有这种作用。结论THP-1细胞膜表面核仁素参与了脂多糖所致炎症反应，提示核仁素可能是脂多糖的一种新受体。     

氧化应激所致C2C12肌源细胞核仁损伤的分子机制

目的探讨氧化应激诱导细胞核仁损伤的分子机制.方法向传代培养的C2C12肌源细胞中加入0.5mmol/L过氧化氢以模拟氧化应激.结果甲苯胺兰染色发现正常C2C12细胞可见一个位于中央的,浓染致密的核仁颗粒.过氧化氢处理后3h,可见明显的核仁分离,处理6h最为明显.细胞总蛋白质合成能力分析发现过氧化氢处理后6h细胞总蛋白质合成能力显著下降(与正常对照比P＜O.05),并持续至24h.免疫印迹检测核仁素(又称C23)发现,过氧化氢处理1h后可见-80kDa条带,而其110kDa主带明显减弱,过氧化氢处理6h和12h最为明显.用脂质体将核仁素反义核酸导入细胞后24h,免疫印迹发现核仁素表达明显被抑制,同时也可观察到细胞总蛋白合成能力下降及明显的核仁分离.结论氧化应激通过诱导核仁蛋白质核仁素的裂解并使其110kDa全长分子的量减少,而导致C2Cl2细胞核仁损伤.     

αB-晶状体蛋白与凋亡相关蛋白相互作用抑制C2C12细胞凋亡

目的 探讨aB-晶状体蛋白抗心肌细胞凋亡的分子机制。方法构建带6个串联组氨酸的aB-晶状体蛋白表达质粒(pcDNA3.1一aBC)，经测序证实后，转染C2C12肌原细胞株，筛选稳定高表达aB-晶状体蛋白的细胞株。采用H2O2(0.5mmol/L)诱导细胞凋亡，检测线粒体细胞色素C释放率和细胞膜磷脂酰丝氨酸细胞色素荧光     

采用反义寡核苷酸探讨HSP70对活性氧所致心肌细胞损伤的影响

目的探讨HSP70对活性氧所致心肌细胞急性损伤的保护作用.方法用热休克预处理诱导新生大鼠心肌细胞中HSP70的表达,采用HSP70反义寡核苷酸阻断HSP70的表达,乳酸脱氢酶释放率和细胞总蛋白质合成能力来反映H2O2 0.5 mM所致心肌细胞损伤程度.结果H2O2引起心肌细胞乳酸脱氢酶释放率明显升高,而细胞总蛋白质的合成降低.热休克预处理导致心肌细胞中HSP70表达明显增加,并使H2O:所致心肌细胞LDH释放率显著降低,细胞总蛋白质的合成基本恢复正常水平.HSP70反义寡核苷酸很大程度上阻断了HSP70的表达及热休克预处理的心肌细胞保护作用.结论在热休克预处理减轻过氧化氢所致乳鼠心肌细胞急性损伤的作用中,HSP70发挥了最主要的作用.     

参麦对小鼠烧伤后胸腺细胞凋亡的保护作用及机制探讨

参麦对小鼠烧伤后胸腺细胞凋亡的保护作用及机制探讨湖南医科大学病理生理教研室（长沙４１００７８）阳剑波邓恭华尢家马录罗正曜本文研究参麦是否具有防止小鼠烧伤后胸腺细胞凋亡的作用，并从ＢＣＬ－２蛋白含量（长寿基因蛋白产物）方面探讨其作用机制。成年昆明纯种健...     

烧伤对胸腺细胞凋亡的影响

小鼠４０％体表面积经６０℃１２ｓ烧伤后胸腺细胞的出现明显的病理性凋亡，表现为：与对照组比，ＤＮＡ断裂（ＤＮＡＦｒｎｍｅｎｔａｔｉｏｎ）百分率显著增高，琼脂糖凝胶电泳出现明显的细胞凋亡特有的“梯状”条带，动态观察发现烧伤后３ｈＤＮＡ断裂百分率明显升高，１２ｈ胸腺活细胞总数明显降低，而胸腺重量和细胞总数降低到烧伤后１８ｈ才才出现，结果提示：（１）烧伤可诱导胸腺细胞发生严重的病理性凋亡；（２）烧伤后胸腺     

小分子HSP对缺血—再灌注所致小鼠心肌actin损伤的影响

目的观察小鼠心肌缺血再灌注损伤时主要骨架蛋白actin的损伤性改变,研究心肌组织中两种含量丰富的小分子热休克蛋白(HSP)-αβ-crystallin和HSP25对上述损伤的保护作用,寻找小分子HSP保护心肌损伤的可能靶蛋白.方法采用Langendorff离体小鼠心脏灌流模型,经停灌30min复灌45min导致缺血-再灌注损伤,测定心肌组织匀浆中脂质过氧化物丙二醛(MDA)的含量;运用光镜和电镜观察心肌组织形态学改变;采用免疫双荧光标记技术和激光共聚焦扫描显微镜(confocalmicroscopy)观察心肌细胞中actin的结构变化、αβ-crystallin及HSP25分布的改变及其与actin的相互关系.进一步采用适宜浓度的活性氧H2O2在体外损伤心肌组织总蛋白,损伤后蛋白质经离心取沉淀,分别或联合加入αβ-crysallin、HSP25和HSc70(组成型HSP70)后,通过Westernblot观察其对上述损伤蛋白质中的actin的解聚和复性作用.结果小鼠离体心脏缺血-再灌注损伤后,心肌组织MDA含量明显增多(P＜0.05);与正常对照组相比,光镜及电镜下可见明显的细胞结构破坏和肌原纤维损伤经免疫双荧光标记和激光共聚焦扫描显微镜观察,发现心肌细胞重要骨架蛋白actin的排列发生紊乱和异常"聚集”,αβ-crystallin和HSP25从胞浆向肌丝移位,其中HSP25与受损聚集的actin存在"共分布”的现象.经蛋白质体外损伤和保护实验进一步发现,200mmolH2O2可导致心肌组织蛋白发生变性、聚集及沉淀,而αβ-crystallin和HSP25可使上述蛋白质沉淀物中的actin重新解聚和复性而出现在上清中,且两者间具有协同的效应,当有HSc70存在时,这种协同效应更加明显.讨论及结论本研究首次观察到缺血再灌注可导致心肌组织主要的收缩蛋白和骨架蛋白actin发生排列紊乱和异常"聚集”,这种变化可能是导致缺血再灌注心脏心律失常、舒缩功能降低和细胞结构破坏的分子机制之一.本实验证实,心肌缺血再灌注时αβ-crystallin和HSP25从胞浆向肌丝移位,其中HSP25和actin"聚集物”形成"共分布”关系.此外,本实验通过蛋白质损伤和保护模型,发现两种小分子热休克蛋白对受损的actin具有解聚和复性作用,且小分子HSP之间及小分子HSP与HSc70之间具有协同的效应.上述发现提示小分子HSP可能在保护心肌损伤方面起着重要的作用,actin可能是HSP25保护的主要靶蛋白之一.另外,我们近期实验发现在上述心肌缺血再灌注损伤时αβ-crystallin有与另一细胞骨架蛋白结蛋白(desmin)形成"共分布”的现象.结蛋白是否为αβ-crystallin保护的主要靶蛋白尚待进一步研究.     

参麦对地塞米松诱导胸腺细胞凋亡的保护作用

参麦对地塞米松诱导胸腺细胞凋亡的保护作用湖南医科大学病理生理教研室（长沙４１００７８）尢家马录阳剑波邓恭华罗正曜本文以地塞米松在体外诱导胸腺细胞凋亡为模型，观察参麦是否能防止地塞米松诱导的胸腺细胞凋亡。实验分四组：Ⅰ生理盐水对照组：胸腺细胞悬液（２×...     

热休克预处理抑制过氧化氢所致心肌细胞Smac的释放及细胞凋亡

目的 :探讨热休克预处理 (heatshockpretreatment,HS)对过氧化氢 (hydrogenperoxide ,H2 O2 )所致心肌细胞凋亡及促凋亡分子线粒体释放的第二种Caspase激活物 (thesecondmitochondria derivedactivatorofcaspases ,Smac)从线粒体释放的影响。方法 :①采用H2 O2 (0 .5mmol/L)导致心肌细胞凋亡 ;②采用热休克预处理 (4 2℃ ,1h ,恢复 12h)诱导热休克蛋白表达 ;③采用Hoechst荧光染色 ,观察细胞凋亡发生并计算凋亡核百分率 ;④采用cas pase活性定量检测及Western blotting观察caspase 3,9的活化 ;采用免疫荧光及Western blotting检测细胞成分分离后Smac从线粒体的释放。结果 :①H2 O2 处理 2h ,Smac从心肌细胞线粒体释放入胞浆 ;处理 4hcaspase 3,9活性升高 ,12h达高峰 ;处理 2 4h心肌细胞明显出现凋亡 ,凋亡核百分率明显升高 ;②热休克预处理可诱导心肌细胞中HSP90 ,HSP70及αB 晶状体蛋白的表达增高 ;抑制Smac释放、caspase 3,9的活化及细胞凋亡的发生。结论 :线粒体信号通路在H2 O2 所致的心肌细胞凋亡中发挥重要作用 ;热休克预处理通过抑制上述通路而减轻H2 O2 所致的细胞凋亡 ,其机制与其诱导热休克蛋白表达、阻断Smac从线粒体向胞浆释放、抑制caspase 3,9的活化有关。     

热休克预处理抑制过氧化氢所致心肌细胞Smac的释放及细胞凋亡

目的：探讨热休克预处理(heat shock pretreatment，HS)对过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)所致心肌细胞凋亡及促凋亡分子线粒体释放的第二种Caspase激活物(the second mitochondria-deftved activator of easpases，Smac)从线粒体释放的影响。方法：①采用H2O2(0．5mmol／L)导致心肌细胞凋亡；②采用热休克预处理(42℃，1h，恢复12h)诱导热休克蛋白表达；③采用Hoechst荧光染色，观察细胞凋亡发生并计算凋亡核百分率；④采用easpase活性定量检测及Western-blotting观察caspase-3，9的活化；采用免疫荧光及Western-blotting检测细胞成分分离后Smac从线粒体的释放。结果：①H2O2处理2h，Smac从心肌细胞线粒体释放入胞浆；处理4hcaspase-3，9活性升高，12h达高峰；处理24h心肌细胞明显出现凋亡，凋亡核百分率明显升高；②热休克预处理可诱导心肌细胞中HSP90。HSP70及αB-晶状体蛋白的表达增高；抑制Smac释放、caspase-3，9的活化及细胞凋亡的发生。结论：线粒体信号通路在H2O2所致的心肌细胞凋亡中发挥重要作用；热休克预处理通过抑制上述通路而减轻H2O2所致的细胞凋亡，其机制与其诱导热休克蛋白表达、阻断Smac从线粒体向胞浆释放、抑制caspase-3，9的活化有关。