膀胱逼尿肌细胞与Cajal间质细胞结构和功能联系的实验研究

背景:膀胱运动的效应细胞是逼尿肌细胞,而膀胱Cajal间质细胞如能在膀胱运动中作为起搏细胞而存在,必须能对逼尿肌细胞进行调控.因此,二者在结构和功能上的联系可以从一个方面证明Cajal间质细胞是否具有起搏细胞地位.目的:观察膀胱逼尿肌细胞与Cajal间质细胞结构和功能上的联系,分析膀胱Cajal细胞在逼尿肌细胞兴奋调控中的作用.设计、时间及地点:观察对比实验,于2007-04/10在解放军第三军医大学基础部中心实验室完成.材料:选用SD大鼠用于取膀胱逼尿肌新鲜组织块.方法:应用透射电镜观察Cajal间质细胞和逼尿肌细胞之间的超微结构联系:利用荧光漂白技术模拟信号从Cajal间质细胞传递到逼尿肌细胞的过程,观察Cajal间质细胞与逼尿肌细胞之间的信号交流情况.主要观察指标:Cajal间质细胞和逼尿肌细胞之间的超微结构联系及荧光强度变化.结果:①Cajal间质细胞和逼尿肌细胞之间有缝隙连接.②对单个Cajal间质细胞相邻的逼尿肌细胞进行荧光漂白后,发现逼尿肌细胞内的荧光强度明显恢复,同时Cajal间质细胞的荧光强度逐渐减弱.说明Cajal间质细胞与逼尿肌细胞之间有信号通讯通路.结论:逼尿肌细胞与Cajal间质细胞之间存在结构上的联系,Cajal间质细胞可以将兴奋信号传递给周围的逼尿肌细胞.     

大鼠膀胱ICC样细胞与逼尿肌神经调控关系的形态学研究

目的 从形态学上探讨膀胱ICC样细胞在逼尿肌神经调控中的作用.方法 采用透射电镜观察大鼠膀胱内ICC样细胞、神经和逼尿肌细胞之间的超微结构关系.通过c-kit免疫荧光染色对大鼠膀胱ICC样细胞进行鉴定,并通过c-kit与PGP9.5免疫荧光双标观察ICC样细胞与神经的结构关系.结果 透射电镜显示,ICC样细胞与逼尿肌细胞紧密相邻处可见典型缝隙连接.在局部区域可见ICC样细胞的突起与神经末梢联系紧密.c-kit免疫荧光染色显示,大鼠膀胱内ICC样细胞主要位于黏膜下层、肌束边缘以及肌细胞间.c-kit与PGP9.5免疫荧光双标显示ICC样细胞与神经末梢在结构上关系紧密.结论 从形态学上看,膀胱内ICC样细胞具备参与逼尿肌神经调控的结构基础,进一步从功能学上予以证实将有助于全面阐明逼尿肌神经调控理论.     

不稳定逼尿肌中ICCs细胞与逼尿肌收缩的关系

目的 研究不稳定逼尿肌中ICCs细胞的数量、分布形式的变化及其功能改变对逼尿肌肌条收缩的影响,初步探讨ICCs细胞与逼尿肌不稳定的关系.方法 近端尿道结扎法建立大鼠不稳定膀胱模型.分别于正常及不稳定膀胱的相同部位剪取3 mm×4 mm逼尿肌组织进行免疫荧光组织化学法检测c-kit阳性细胞的表达及分布情况;再于相同部位剪取2 mm×7 mm肌条进行收缩特性测定实验,并检测c-kit受体阻断剂对收缩的影响.结果 不稳定逼尿肌中c-kit阳性细胞的数量较正常逼尿肌明显增多(P＜0.05);正常逼尿肌中c-kit阳性细胞以散在分布为主,不稳定逼尿肌中以细胞网络形式存在;不稳定逼尿肌肌条的收缩频率和收缩幅度显著高于正常膀胱(P＜0.05);加入Glevic后,不稳定逼尿肌肌条的收缩幅度显著减弱(P＜0.05),频率无显著差异(P＞0.05).结论 不稳定膀胱中ICCs细胞的数量明显增加,主要以细胞网络的形式存在;不稳定逼尿肌肌条收缩幅度和频率明显增高,但其收缩幅度可以被Glevic削弱,提示ICCs与逼尿肌不稳定的发生有密切关系.     

膀胱出口梗阻体外细胞生物力学模型的建立的研究

目的建立一种全新的膀胱出口梗阻(BOO)体外细胞水平的生物力学模型,为BOO的研究提供一个更为稳定科学的实验平台.方法应用负压发生装置对贴壁生长在BioFlex培养皿内的正常膀胱平滑肌细胞施加不同程度的周期性张力,使其硅胶底部分别发生10%、20%、30%的形变,利用免疫细胞化学检测收缩表型标志物α-actin,RT-PCR检测增殖指标PCNA的mRNA表达以及Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)、cdk2 kinase蛋白表达,观察它们的动态变化,利用MTT法观察细胞增殖性的变化.结果随着形变量的增大,免疫细胞化学发现α-actin先代偿增加后失代偿降低;RT-PCR和Western blotting发现PCNA的mRNA表达量逐渐增加,PCNA、cdk2 kinase的蛋白表达量逐渐增加,30%形变组显著高于正常对照组(P<0.01);MTT实验发现与正常对照组比,细胞的增殖活性显著增加(P<0.01).结论①对培养逼尿肌细胞施加周期性张力负荷作用的方法建立了一种全新的体外细胞水平的BOO模型;②随周期性张力增加,逼尿肌细胞由"收缩型"逐渐转化为"分泌型".     

大鼠不稳定膀胱中ICCs细胞中HCN蛋白表达的变化

目的 研究HCN离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)蛋白在膀胱Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)中的表达及在不稳定膀胱ICCs细胞中表达的变化,探讨ICCs细胞兴奋性变化与逼尿肌不稳定(detrusor instability,DI)的关系.方法 ①将30只大鼠随机分为正常对照(10例),逼尿肌稳定组(DS,n=12),逼尿肌不稳定组(DI,n=8):大鼠尿道近端结扎,建立膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction,BOO)模型.②对各组进行HCN和c-kit免疫荧光双标,确定HCN蛋白是否在ICCs细胞上存在及HCN表达的变化.③以Western blot法检测HCN蛋白表达量的变化.结果 ①免疫荧光双标显示,在c-kit阳性的ICCs细胞膜上,有HCN抗原的表达,c-kit阴性细胞未见HCN表达;与正常组相比,DI组、DS组HCN蛋白表达增加.②Western blot检测显示,与正常组相比,DI组、DS组的HCN表达增高,DI组增高显著(P＜0.01).结论 大鼠膀胱ICCs细胞可表达HCN通道蛋白,且DI膀胱ICCs细胞HCN通道明显增多,由此导致的ICCs细胞兴奋性增高可能在DI发生中起重要作用.     

膀胱Cajal间质细胞对膀胱逼尿肌细胞兴奋调控的结构和功能特征的初步研究

目的 探讨膀胱Cajal细胞(ICC细胞)在逼尿肌细胞兴奋调控中所起的作用.方法 ①透射电镜观察ICC细胞和逼尿肌细胞之间的超微结构联系;②以荧光光漂白恢复(FRAP)对相邻的ICC细胞和逼尿肌细胞进行检测,观察ICC细胞和相邻逼尿肌细胞之间的荧光强度的变化.结果 ①超微结构可见 ICC细胞和逼尿肌细胞之间有缝隙连接;②对与单个ICC细胞相邻的逼尿肌细胞进行荧光漂白后,可发现逼尿肌细胞内的荧光强度有显著恢复(P<0.01),同时ICC细胞的荧光强度逐渐减弱,说明ICC细胞与逼尿肌细胞间有信号通讯的通路.结论 ①ICC细胞与逼尿肌细胞之间存在结构上联系;②ICC细胞可以将兴奋信号传递给周围的逼尿肌细胞.     

ICCs细胞在正常大鼠膀胱中的分布及对逼尿肌收缩的影响

目的 研究正常SD大鼠膀胱不同部位ICCs细胞(interstitial ceils of Cajal,ICCs)的分布及其对局部逼尿肌收缩的影响.方法 分别于正常SD大鼠膀胱顶部、体部、底部及三角区取3 into×4 mm逼尿肌组织进行免疫荧光组织化学法检测c-kit阳性细胞的表达情况;再于上述部位取2 mm×7 mm肌条进行张力测定实验,比较各部位肌条频率及幅度的变化,分析其与ICCs密度变化的相关性.结果 正常膀胱中存在ICCs,三角区及顶部的ICCs密度较体部和基底部明显增加,差异显著(P＜0.05);三角区和顶部以及体部和基底部的ICCs密度均没有显著区别(P＞0.05);各部位肌条收缩频率和幅度不同,但顶部和三角区的肌条收缩频率和幅度较体部和基底部明显增大,差异显著(P＜0.05),顶部和三角区以及体部和基底部的肌条之间则没有显著区别(P＞0.05).相关性分析结果表明逼尿肌肌条收缩频率和幅度与局部ICCs密度呈显著正相关性(P＜0.05).结论 大鼠膀胱中存在ICCs,膀胱各部位ICCs的分布有显著差异,其与膀胱局部肌条收缩有密切关系.