多重实时荧光定量PCR检测急性肝炎患者HBV和HCV方法的建立与意义分析

目的建立一种新的可以快速筛查急性肝炎患者HBV和HCV感染的多重实时荧光定量PCR方法。方法收集596例急性肝炎患者血清或血浆样本,应用自主构建的多重实时荧光定量PCR方法同时检测HBV和HCV,同时应用HBV和HCV单管检测试剂进行检测分析。结果新建立的多重实时荧光定量PCR体系,可以有效地检测HBV和HCV的阳性质控品及阳性样本。多重实时荧光定量PCR体系特异性较好,检测HBV和HCV时,两者之间无交叉反应,且以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性;多重实时荧光定量PCR体系检测HBV、HCV的灵敏度分别为20 IU/ml、50 IU/ml;多重实时荧光定量PCR体系精密度好,检测HBV、HCV的CV值分别为0.11%、0.096%。在检测临床样本时,多重复合体系检测血清或血浆中HBV和HCV的检出率与单独检测HBV和HCV具有很好的一致性,且HBV和HCV的一致率分别达到97.7%(k=0.952)、98.8%(k=0.976);同时有6例样本出现HBV和HCV共感染。结论新型多重实时荧光定量PCR方法对快速检测及筛查HBV和HCV较快捷,而且特异性好、灵敏度高、精密度好。因此多重实时荧光定量PCR方法对2种肝炎病毒的检测具有重要意义。     

HIV-1感染者中枢神经系统的病毒学特征研究

目的 探讨HIV-1感染者中枢神经系统(CNS)的病毒学特征.方法 通过克隆测序分析病毒亚型,观察CNS中HIV-1变异性和离散率;依据V3环11/25法则并结合10例有偿献血HIV-1感染者尸检脑组织标本免疫荧光试验分析中枢神经HIV-1复合受体的使用.结果 有偿献血人群感染的HIV-1显示B和B’亚型特征,脑脊液(CSF)和外周血序列有嵌合现象;CSF C2-V5区序列变异性明显低于外周血,两者的离散率差异无统计学意义;依据11/25法则分析V3环序列可见中枢神经HIV-1大多数使用CCR5复合受体.结论 CNS HIV-1病毒变异性明显小于外周血;CNS HIV-1具有CCR5嗜性.     

带有CFP标签的LC3自噬表达载体的构建

目的构建带有樱桃红色荧光蛋白(cherry fluorescent protein,CFP)标签的微管相关蛋白1轻链3(LC3)自噬真核表达载体,并进行初步表达鉴定。方法采用PCR方法,从质粒载体pCMV-GFP-LC3为模板扩增LC3片段,通过T4 DNA连接酶将纯化后的PCR产物LC3与经过ApaI和BamHI双酶切的pm-cherry-c1载体连接,命名为PM-CFP-LC3。该载体经酶切及测序验证后,在fugene6转染试剂介导下转染293细胞,通过荧光显微镜观察CFP在细胞内的分布来观察LC3表达情况。结果带有CFP标签的LC3表达载体构建成功,在荧光显微镜下可观察到转染细胞中樱桃红色荧光以及细胞自噬现象。结论成功构建了带有CFP标签LC3的重组质粒并成功表达,为深入研究细胞的自噬奠定了实验基础。     

多重定量荧光PCR在21-三体及性染色体多倍体畸变诊断中的应用

目的探讨多重定量荧光PCR(QF-PCR)技术在染色体非整倍体畸变诊断中的应用价值。方法抽取脐血样本16份,羊水样本73份,21、X、Y染色体数目异常患者及其父母外周静脉血71份,针对21号染色体和X、Y染色体上7个基因位点21S1435、D21S11、D21S1411、AMXY、DXS981、DXS6809和X22应用QF-PCR方法进行多重扩增,毛细管电泳法检测并分析结果。所有样本同时进行染色体核型分析。结果染色体核型分析中有129例为正常核型46,XX(XY);26例21-三体(其中1例为易位型,余为标准型);1例45,XO/46,XX;2例47,XXX;1例47,XXY;1例45,XX,der(13,21)。QF-PCR结果中,确诊1例47,XXY,26例21-三体征中23例确诊,2例47,XXX被提示可能存在性染色体数目异常,其余为阴性结果。结论多重定量荧光技术可用于染色体非整倍体畸变的快速诊断。     

短期使用齐多夫定抑制p53R2表达及诱导小鼠神经元凋亡的研究

目的探讨齐多夫定(AZT)的中枢神经毒性及其相关机制。方法原代培养小鼠大脑皮层神经元,分别用0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L的AZT作用于细胞,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫荧光观察细胞形态,实时定量PCR(qPCR)检测依赖p53的p53R2、抑癌基因p21、胸苷激酶(TK2)mRNA表达及线粒体DNA含量,蛋白印迹检测p53R2与p21蛋白的表达。结果 AZT 0mmol/L组(对照组)、50 mmol/L组和100 mmol/L组细胞凋亡率分别为(11.9±3.37)%、(24.3±8.94)%和(54.7±17.9)%,差异具有统计学意义(χ2=5.19、19.33,P均0.01);突起长度分别为(869.21±177.75)mm、(495.76±175.20)mm和(120.38±47.12)mm,且差异均具有统计学意义(F=19.558,P=0.002);real-time qPCR检测结果显示AZT 50 mmol/L和100 mmol/L组p53R2、TK2 mRNA拷贝数分别是对照组的0.42和0.04倍、0.52和0.29倍,组间差异均具有统计学意义(Z=-4.54、-6.65、-4.33和-5.24,P均0.01);AZT 50 mmol/L和100 mmol/L组p21 mRNA拷贝数分别是对照组的0.98和0.86倍,差异无统计学意义(P0.05)。线粒体含量用环氧化酶2(COX-2)拷贝数评估,AZT 50 mmol/L组和100 mmol/L组分别是对照组的0.92和0.87倍,差异无统计学意义(P0.05)。蛋白印迹显示对照组、AZT 50 mmol/L组和100 mmol/L组p53R2蛋白含量依次降低,而p21蛋白含量无差异。结论 AZT可诱导神经元凋亡,抑制突起形成,推测其机制与p53R2表达降低有关。短期接触AZT可抑制TK2的表达,但对线粒体DNA含量无影响。     

应用MGB探针检测人乙型肝炎病毒的基因型

目的检测血浆或血清样本中人乙型肝炎病毒HBV的基因型,建立了基于MGB探针的实时荧光定量PCR检测体系。方法在HBV基因组型特异性碱基的聚集区域设计荧光定量PcR引物及探针。为保证特征特异性及高分辨率,选择设计MGB探针,然后将PCR扩增的产物纯化后进行基因克隆．克隆成功后提取的质粒制备为阳性质控品,从而建立完整的MGB探针法的荧光定量PCR检测体系,最后对该检测体系进行方法学评价。结果成功建立了基于MGB探针的HBV荧光定量PCR的基因分型检测体系。方法学评价显示,该检测体系的灵敏度达50IU／mL;重复性好;特异性良好,以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性。结论本研究建立基于MGB探针的HBV荧光定量PCR的基因分型检测方法,可以很好地定性的检测血浆或血清样本及血液制品中的人乙型肝炎病毒HBV的基因型及含量,对于该疾病的临床治疗具有重要的意义。     

HIV感染儿童抗病毒治疗后外周血单个核细胞的TK2表达水平及意义

目的探讨艾滋病病毒(HIV)感染儿童抗病毒治疗后外周血单个核细胞(PBMC)中潜在线粒体毒性标志物表达水平及其相关机制。方法选择60例抗病毒治疗的HIV感染儿童和20例健康儿童,检测PBMC中胸苷激酶2(TK2)基因的mRNA和蛋白质表达水平变化,与治疗方案及治疗时间的相关性分析。结果 HIV感染患儿抗病毒治疗的PBMC中TK2基因mRNA和蛋白质表达水平显著高于对照组儿童(mRNA:2.45/1,蛋白质:3.2/1)差异均有统计学意义(P<0.05)。随着治疗时程的增加,司他夫定治疗组较齐多夫定治疗组的TK2蛋白质水平增加更显著(P<0.05)。将患儿分别按基线CD4+T淋巴细胞计数、基线病毒载量、性别、年龄以及HIV传播途径进行分组比较,各组患儿间TK2水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论外周血PBMC的TK2水平可反映儿童抗病毒治疗后的线粒体毒性,有望成为线粒体毒性检测指标。     

EGFP-线粒体蛋白导入载体的构建及功能验证

目的 构建能够将外源蛋白导入真核细胞线粒体的真核表达载体,并且通过增强型绿色荧光蛋白的表达进行示踪.方法 利用多重PCR扩增法将线粒体导肽序列与EGFP序列融合在一起,并插入真核表达载体pcDNA3.1,构建成真核表达载体pcDNA5.1-EGFP.将P53基因分别插入pcDNA5.1-EGFP和pcDNA3.1构建成pcDNA5.1-P53和pcDNA3.1-P53载体.经酶切和测序验证后在脂质体介导下分别将上述载体转染293T细胞,一方面在荧光显微镜下比较绿色荧光蛋白与细胞色素C在细胞内的分布情况,另一方面通过免疫荧光法比较P53蛋白在细胞内的定位.结果 绿色荧光的表达分布与细胞色素C具有一致性,且转染pcDNA5.1-P53载体的细胞内P53蛋白集中在胞质线粒体中,而转染pcDNA3.1-P53载体的细胞内P53蛋白主要分布在细胞核内.结论 成功构建能够将外源蛋白导入线粒体的真核表达载体.     

EBV-LMP1促CNE2细胞迁移的作用机制

目的：探讨EBV-LMP1对鼻咽癌细胞CNE2迁移表型的影响及作用机制。方法：用RV-LNSX，RV-LMP1和RV-LMP1^TRADD。逆转录病毒分别感染CNE2细胞，G418筛选后，观察和检测转基因细胞的形态学特点，在基质中的运动迁移能力以及R-钙黏蛋白（E-Cadherin）表达的变化；用pLNSX，pLNSX-LMP1和pLNSX—LMPI^TRADD质粒分别与E-Cadherin报告基因共转染293细胞，检测LMP1对E-Cadherin启动子活性的影响。结果：与CNE2和CNE2-LNSX细胞相比，CNE2-LMP1在培养过程中由扁平、鹅卵状上皮细胞形态逐渐演变为细胞间接触消失的长梭状纤维细胞形态，相对迁移明显增大（n=3，P〈0.05）。且E-Cadherin表达明显下调或缺失；随着共转染野生型LMP1（pLNSX-LMP1）剂量的增加（0．2，0、6，1．0μg），对E／-Cadherin启动子转录活化的抑制率增加，呈明显浓度依赖性；LMPI^TRADD不改变CNE2细胞形态学及迁移表型，对E-Cadherin启动子的转录活性及蛋白表达亦无明显影响。结论：抑制E-Cadherin启动子活化可能是EBV-LMP1下调E-Cadherin蛋白表达、促CNE2细胞迁移的机制之一，位于LMP1羧基端的TRADD可能是其促迁移的主要活性部位。