心肌细胞裂解液诱导人脂肪基质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的分离培养人脂肪基质干细胞（ASCs），观察心肌细胞裂解液诱导ASCs分化为类心肌细胞的情况。方法人脂肪组织用胶原蛋白酶I消化，贴壁法培养获得ASCs，流式细胞术鉴定其表型，向ASCs培养体系中加入乳鼠心肌细胞裂解液，培养2周后，利用免疫荧光技术和RT—PCR法分析分化后细胞的心肌特异性蛋白和基因的表达情况。结果培养获得ASCs，表型为CD44^＋、CD105^＋、CD31^-、CD45^-。心肌细胞裂解液诱导培养2周后，细胞表达心脏特异性肌钙蛋白T（cTnT）、结蛋白，同时也表达心脏特异性基因cTnT、ANP、aMHC。结论心肌细胞裂解液可在体外诱导ASCs分化为类心肌细胞。     

他汀类药物和促红细胞生成素对人外周血内皮祖细胞数量和功能的影响

目的:观察他汀类药物和促红细胞生成素对外周血内皮祖细胞数量和迁移功能以及增殖功能的影响,并比较其作用效应。方法:实验于2004-06/2005-10在华中科技大学附属协和医院血研所实验室完成。采集来华中科技大学附属协和医院体检的正常人自愿者外周血标本36份,分离培养内皮祖细胞1周后,将贴壁细胞随机分成4组:①对照组:用含体积分数为0.02的胎牛血清M199培养基。②阿托伐他汀组:用1mmol/L阿托伐他汀处理培养基。③人重组促红细胞生成素组:用100IU/L人重组促红细胞生成素处理培养基。④联合组:用1mmol/L阿托伐他汀与100IU/L人重组促红细胞生成素联合处理培养基。培养24h后,检测并比较各组15个随机选择的×200视野的内皮祖细胞的数量,迁移能力以及增殖能力。结果:①内皮祖细胞数量:他汀组,促红细胞生成素组,联合用药组均较对照组有显著提高(P<0.01),他汀组和促红细胞生成素组间并无差异(P>0.05),而联合用药组与前三组相比均有显著性差异(P<0.01)。②内皮祖细胞迁移能力:他汀组,促红细胞生成素组,联合用药组均较对照组有显著提高(P<0.01),他汀组和促红细胞生成素组间并无差异(P>0.05),而联合用药组与前三组相比均有显著性差异(P<0.01)。③内皮祖细胞增殖能力:他汀组,促红细胞生成素组,联合用药组均较对照组有显著提高(P<0.01),他汀组和促红细胞生成素组间并无差异(P>0.05),而联合用药组与前三组相比均有显著性差异(P<0.01)。结论:他汀类药物阿托伐他汀和人重组促红细胞生成素均能在体外提高内皮祖细胞的数量,迁移能力以及增殖能力,且联合用药该效应更加明显。由于内皮祖细胞在心血管疾病的治疗中起着重要的作用,这两类药的联合应用将具有积极的临床意义。     

雌激素对糖尿病患者内皮祖细胞数量和功能的影响

目的：观察雌激素对2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞数量和功能的改变，并检测趋化因子受体CXCR4的表达。方法：实验于2005-02／09在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。选取武汉市中心医院收治的20例2型糖尿病患者。均根据1999年中国糖尿病学会新的诊断标准确诊。①抽取2型糖尿病患者外周静脉血，常规密度梯度离心法获取单个核细胞，进行内皮祖细胞的分离培养。加入雌二醇培养3d，按其浓度分为雌激素0nmol／L组、雌激素50nmol／L组、雌激素100nmol／L组。②检测内皮祖细胞的生长增殖和凋亡情况，测定其黏附能力。分别以反转录-聚合酶链法及流式细胞术对内皮祖细胞表达CXCR4的水平进行检测。结果：按意向处理分析，实验选取20例2型糖尿病患者血样全部进入结果分析。①内皮祖细胞的培养、鉴定及计数情况：培养4d后可见贴壁的单个核细胞，7d后细胞变为梭形，并慢慢变长。流式细胞仪鉴定细胞表型，可见内皮祖细胞大多表达CD34，且60％-80％表达CD133。对贴壁细胞行荧光染色后，〉80％的细胞双染色阳性，可认为是正在分化的内皮祖细胞。计数结果显示，随着加入雌激素浓度的增加，各组内皮祖细胞数量差异具有显著性意义（P〈0．05）。②内皮祖细胞增殖及凋亡的检测结果：各组内皮祖细胞增殖率基本相似（P〉0．05）。随着雌激素浓度的增加，雌激素0nmol几组、雌激素50nmol／L组、雌激素100nmol／L组的凋亡率呈下降趋势，差异有显著性意义（P〈0．05）。③内皮祖细胞黏附能力检测结果：各组内皮祖细胞黏附能力基本相似（P〉0．05）。（4）CR4在内皮祖细胞上的表达情况：流式细胞术检测各组内皮祖细胞上CXCR4的表达阳性率，可见随着雌激素浓度增加，各组CXCR4表达率也随之增加，差异具有显著性意义（P〈0．05）。反转录-聚合酶链反应法检测CXCR4的表达，亦得到相似结果。结论：雌激素对2型糖尿病患者内皮祖细胞的数量及功能均产生影响，可明显抑制内皮祖细胞凋亡及上调CXCR4的表达。提示雌激素可能在防止糖尿病周围血管病变上发挥一定作用。     

局部注射内皮祖细胞改善糖尿病大鼠后肢血管病变

目的探讨局部注射同种异体内皮祖细胞(EPCs)对糖尿病大鼠后肢血管病变的作用,并探讨其可能机制。方法腹腔注射链佐星制备SD大鼠糖尿病模型,然后将其两后肢股动脉结扎,制成血管病变模型。将模型分为两组,移植组大鼠左后肢为实验侧,自结扎部位以下每0.5 cm注射分离自糖尿病大鼠外周血的以荧光染料标记的EPCs悬液0.5 ml(含EPCs 2.5×105个),右后肢为对照侧,注射等量的磷酸盐缓冲液;空白对照组不注射任何溶液。注射EPCs后1周,采用酶联免疫吸附试验检测后肢局部肌肉组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达;注射EPCs后28 d,切取局部肌肉组织,荧光显微镜下观察组织切片中荧光染料的染色情况,免疫组织化学法检测von Willebrand因子(vWF)表达情况,并计算毛细血管密度。结果注射EPCs后1周,移植组实验侧组织中VEGF含量高于对照侧和空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而空白对照组和对照侧的差异无统计学意义(P>0.05)。注射EPCs后28 d,荧光显微镜下可见注射部位组织中蓝染的毛细血管内皮细胞;注射EPCs的左后肢局部毛细血管密度高于未注射的对照侧和空白对照组,差异有统计学意义(P< 0.05)。结论同种异体EPCs注射至糖尿病大鼠缺血后肢能分化为毛细血管内皮细胞,从而改善局部供血,局部VEGF分泌增加可能参与这一过程。     

高血压人群中HbA1C诊断糖尿病的应用

探讨HbA1C在原发性高血压人群中诊断糖尿病的有效性.结果显示HbA1C诊断糖尿病的切点值为6.0％,对应的受试者工作特征曲线下面积、敏感性及特异性分别为0.895、85.4％及82.2％.提示HbA1C≥6.0％能有效地诊断高血压人群的糖尿病.     

高糖对糖尿病患者内皮祖细胞增殖凋亡的影响及其机制探讨

目的：了解葡萄糖对糖尿病患者内皮祖细胞（EPCs）增殖及凋亡的影响，并探讨其可能机制。方法：以不同浓度葡萄糖分别作用于25例正常人(对照组)和25例2型糖尿病患者(糖尿病组)EPCs，MTT法检测其增殖，Annexin-V/PI法检测其凋亡。RT-PCR法检测bcl-2和bax的表达水平。结果：33 mmol/L葡萄糖使糖尿病组和对照组EPCs增殖率均减低，凋亡率增高；且能使糖尿病组和对照组EPCs表达bax增强，bcl-2表达无明显改变。而5 mmol/L葡萄糖作用下糖尿病组和对照组EPCs增殖率、凋亡率及bax和bcl-2表达无明显改变。结论：高糖使EPCs增殖功能减弱，凋亡增加，bax表达增加可能是其机制之一。     

采用PCR-SSP方法检测强直性脊柱炎患者HLA-B27亚型

目的 建立序列特异性引物-聚合酶链方法(PCR-SSP)检测湖北地区人白细胞抗原B27(Human leueocyte antigen-B27，HLA-B27)阳性强直性脊柱炎患者的HLA-B27亚型组成。方法 盐析法提取100例HLA-B27阳性的强直性脊柱炎患者外周血基因组DNA，采用PCR-SSP技术分别进行HLA-B位点基因型检测和HLA-B27基因亚型分析。结果 100例标本PCR-SSF，扩增均获成功，历时3h。共检出4种亚型：HLA-B*2704、HLA-B*2711、HLA-B*2715、HLA-B*2’722。其中HLA-B*2704纯合子25例、HLA-B*2704杂合子63例；HLA-B*2711杂合子5例；HLA-B*2715杂合子6例；HLA-B*2722杂合子l例。四种亚型所占构成比分别为90．4％、4％、4．8％和0．8％。结论 PCR-SSP方法进行HLA-B27亚型分析，快速、经济、简单；HLA-B*2704是湖北地区强直性脊柱炎患者HLA-B27基因主要亚型。     

脂肪基质干细胞诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的研究脂肪基质干细胞（ASCs）的分离、纯化、扩增以及在体外定向分化为心肌样细胞的能力。方法获取并培养正常人的ASCs，倒置显微镜下观察其形态；流式细胞仪检测其免疫表型。5-氮胞苷诱导ASCs在体外分化为心肌样细胞，倒置显微镜观察心肌样细胞的形态，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测心肌相关基因ANP、cTnT、cTnI和αMHc的表达；免疫荧光法检测cTnT和结蛋白的表达；Western blot法检测Connexin43的表达。结果ASCs呈纤维样贴壁生长，体外培养易扩增；ASCs表达相关抗原CD29和CD105，不表达CD31、CD34、CD45和HLA—DR；ASCs经5-氮胞苷的作用可呈现典型的心肌样细胞形态，ANP、cTnT、cTnI和aMHc基因及cTnT、结蛋白和Connexin43均呈阳性表达。结论脂肪组织中分离培养的ASCs具有体外大量扩增并保持低分化状态的特性，以及定向分化为心肌样细胞的能力，有望成为治疗心肌梗死的种子细胞。     

辛伐他汀对2型糖尿病患者内皮祖细胞增殖的影响及其机制探讨

目的观察辛伐他汀对2型糖尿病患者外周血来源内皮祖细胞（EPCs）增殖的影响，并初步探讨其机制。方法2型糖尿病合并高脂血症患者20例，随机分为辛伐他汀组（给予辛伐他汀20mg/d口服）和对照组（给予安慰剂）。治疗前及治疗后2、4周取外周血获取单个核细胞，培养7d后对获得的细胞进行分析，比较各组EPCs数目，并对血清中低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）浓度与EPCs数目的改变进行相关分析。在EPCs培养体系中分别加入辛伐他汀、磷脂酰肌醇-3激酶，蛋白激酶通路（P13K／Akt）信号转导特异性抑制荆Ly294002。观察对其增殖的影响。结果辛伐他汀组患者治疗后2、4周外周血中EPCs明显增多（P〈0．01），其变化与LDL-C变化无相关性（P〉0．05）。体外实验证明辛伐他汀能促进EPCs的增殖，这种作用能被Ly294002阻断。结论辛伐他汀能促进EPC8的增殖，这种作用可能与激活P13K／Akt信号转导通路有关。