应用亲和磷酸蛋白质组学筛选氧化应激重塑型LPS通路的侯选信号分子

目的： 研究低剂量LPS刺激的Thp-1细胞在有或无H₂O₂预处理时磷酸化蛋白组的差异，以初步筛选氧化应激重塑型LPS通路中的新信号分子。方法： 使用PMA刺激Thp-1单核细胞36 h使之分化成为成熟的巨噬细胞，静息36 h后，先以等体积的培养基或100 μmol/L H₂O₂刺激1 h，再以培养基或10 μg/L LPS刺激 30 min。采用PMAC ( phosphoprotein metal affinity column)富集各组细胞的磷酸化蛋白质，经超滤除盐后进行二维凝胶电泳，比较LPS组和H₂O₂+LPS组的磷酸化蛋白图谱的差异，并挑选部分斑点进行质谱鉴定。结果： 相对于LPS组（仅用LPS刺激的细胞)，在H₂O₂+LPS组（LPS刺激前经H₂O₂提前处理的细胞)中，有29个磷酸化蛋白斑点在双向电泳图谱中表现出可重复的差异，其中，17个斑点发生了上调（包括新出现的斑点），12个发生了下调（包括消失的斑点）。我们已经鉴定出其中5个差异蛋白，这些蛋白参与多种多样的细胞过程例如蛋白质降解、信号转导和蛋白质折叠等。其中，在H₂O₂+LPS组中显著下调的proteasome beta-4亚基与LPS信号传递关系密切。结论： 亲和磷酸蛋白组学有效减少了高丰度的结构蛋白的干扰并增加了信号分子检出的可能性。上述５个蛋白尤其是proteasome beta-4亚基可能是氧化应激重塑型LPS通路的重要调节分子。     

晚期糖基化终末产物受体胞外段不同功能段真核表达载体的构建及其在前列腺癌细胞中的表达与定位

构建晚期糖基化终末产物受体（RAGE)胞外段不同功能段V/VC1真核细胞表达载体,并在前列腺癌细胞株PC-3中表达,为进一步研究其在前列腺癌发病中的作用和机制打下基础。方法 采用PCR方法扩增RAGE不同功能段V/VC1的序列,利用分子克隆技术将其重组于pcDNA3-HA载体中。利用PCR和测序鉴定克隆正确性。转染PC-3细胞,用Western-Blotting检测其表达,免疫荧光检测其在细胞中的定位。结果 克隆的RAGE不同功能段V/VC1真核表达载体完全正确,Western-Blotting检测到RAGE不同功能段V/VC1的表达,免疫荧光检测其主要定位于细胞浆中。结论成功地构建了RAGE不同功能段V/VC1真核表达载体,其能够在PC-3细胞中表达。     

应激相关的热休克信号转导通路的研究进展

随着社会的发展和医疗技术的不断进步与完善,人们的健康水平有了大幅度的提高。但急性梗塞(如脑梗、心梗)、感染性疾病(如败血症)等仍有较高的发病率和死亡率。特别是随着我国社会和经济的发展,老年人群的结构比例明显增高,心脑血管疾病和感染引起的疾病将进一步增加。而且随着     

BRCA1调节乳腺癌细胞黄体酮受体A和B蛋白的表达

目的 研究BRCA1能否在乳腺癌细胞中调节黄体酮受体A和B的表达.方法 在乳腺癌细胞MCF-7中,用lipofectamine 2000转染含有野生型BRCA1 cDNA的pFlag-CMV2-BRCA1 wt质粒或BRCA1特异性的小干扰RNA,过表达BRCA1或敲低BRCA1的表达.转染24 h以后,加入含有100 nmol/L黄体酮完全培养基刺激24 h.提取全细胞蛋白或总RNA,进行Western blotting和RT-PCR检测BRCA1、黄体酮受体A(PRA)和黄体酮受体B(PRB)在蛋白质水平和mRNA水平的表达.结果 在MCF-7细胞中过表达BRCA1,PRA和PRB蛋白的表达下降,而PRA和PRB在mRNA水平无变化;BRCA1的表达被敲低后,PRA和PRB的表达升高.结论 在乳腺癌细胞中,外源性和内源性BRCA1都可以下调PRA和PRB蛋白的表达.     

晚期糖基化终末产物受体真核表达载体的构建与表达

目的 构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体真核细胞表达载体.方法 采用PCR方法从人cDNA文库中扩增RAGE基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定.以RAGE/pcDNA3重组质粒为模板,运用突变方法在RAGE氨基末端信号肽后插入HA序列.利用Western blotting在HEK 293细胞中对经过测序鉴定的HA-RAGE\pcDNA3重组质粒的表达进行了检测.结果 RAGE/pcDNA3重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,HA-RAGE\pcDNA3重组质粒可在HEK 293细胞中表达.结论 成功构建了带HA标签的RAGE真核细胞表达载体,该载体能在真核细胞中表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导途径中的作用提供了一个重要的工具.     

沉默Toll样受体4基因表达的RNAi慢病毒载体的构建

背景：Toll样受体4（toll-like receptor4,TLR4）是介导内毒素/脂多糖应答的主要受体,在由内毒素诱导的炎性反应的信号通路中发挥着重要作用。目的：构建人TLR4基因的RNA干扰慢病毒载体,并观察其对人脐静脉内皮细胞TLR4在蛋白水平的沉默效应。方法：利用Invitrogen在线软件设计人TLR4基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核苷酸后克隆到线性载体pENTRTM/H1/TO的黏性末端,并进行DNA测序。得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组反应,从而获得干扰TLR4基因真核表达的慢病毒载体。在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助复合体和TLR4基因的真核表达慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人脐静脉内皮细胞,检验其干扰TLR4基因表达的有效性。结果与结论：实验成功构建TLR4基因真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8.7×106U/mL。免疫印迹杂交结果表明,所获得的慢病毒感染人脐静脉内皮细胞TLR4基因在蛋白水平的表达显著降低。实验成功构建了人TLR4基因慢病毒RNA干扰表达载体,并验证了其在人脐静脉内皮细胞上的有效性。     

p38丝裂原活化蛋白激酶基因敲除对小鼠胚胎成纤维细胞增殖的影响

目的 研究p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因敲除对小鼠胚胎成纤维细胞增殖的影响.方法 用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测小鼠胚胎成纤维细胞中p38+/+和p38-/-的表达;利用噻唑蓝(MTT)比色法绘制p38+/+和p38-/-细胞的生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期各时相所占百分比.结果 绘制的生长曲线表明,p38-/-细胞的生长速率明显下降,增殖受到抑制,细胞倍增时间延长,培养96 h时,p38-/-细胞数量较p38+/+减少了15.5%,说明p38基因敲除明显抑制了G2/M的进程.流式细胞仪检测结果显示,p38+/+细胞中G0/G1期细胞占34.47%,G2/M期占10.81%,S期占54.72%;p38-/-细胞中G0/G1期占48.49%,G2/M期占4.06%,S期占47.44%.与p38+/+细胞相比,G1期的p38-/-细胞增加了40.7%,S期则减少了13.3%,说明p38基因敲除抑制了G1/S的进程.结论 p38基因敲除能够阻滞细胞周期进展,减慢细胞增殖速度.     

腺病毒5型和7型感染诱导呼吸道上皮细胞黏蛋白1表达的差异性研究

目的 为探讨人类呼吸道腺病毒感染自限性的分子机制,对人类常见呼吸道腺病毒5型(Ad5)和7型(Ad7)感染对呼吸道上皮细胞抑炎分子——黏蛋白1(MUC1)表达的影响进行初步研究,并探讨两者差异性.方法 分别用Ad7和Ad5感染呼吸道上皮细胞A549构建感染模型.qRT-PCR和Western blot分别检测感染后MUC1 mRNA转录水平及蛋白表达水平变化.结果 Ad5感染A549细胞后MUC1 mRNA转录水平及MUC1蛋白表达水平均可见上调,且呈一定的时间效应;而Ad7感染后未观察到此现象,延长Ad7感染时间后,仍未观察到MUC1 mRNA转录上调.结论 人类呼吸道Ad5感染呼吸道上皮细胞初期,可诱导上调抑炎分子MUC1表达,提示MUC1全部或部分参与到Ad5感染的自限性过程.但Ad7感染不能诱导上调MUC1表达,其感染的自限性来源于其他机制.     

晚期糖基化终末产物受体不同突变体真核表达载体的构建和表达

目的 构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体(RAGE)不同突变体的真核细胞表达载体.方法 采用定点突变技术将亚克隆在载体pcDNA3-HA上的野生型RAGE构建成不同突变体pcDNA3-HA-RAGE(S391A)、pcDNA3-HA-RAGE(S399A)、pcDNA3-HA-RAGE(S400A)、pcDNA3-HA-RAGE(T401A),经测序鉴定正确后转染HEK293细胞,利用Western blotting检测各突变体的表达.结果 RAGE不同突变体经测序鉴定正确无误后.在HEK293细胞中得到高量表达.结论 成功构建了RAGE不同突变体的真核表达载体,并在真核细胞中进行了表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导中的作用奠定了基础.     

新教学方法——“换位教学法”在医学教学过程中的探索

针对在有限的教学课时内医学专业某些复杂章节授课有难度的现象,借鉴美国大学教授们的教学方法,提出"换位教学法"。这种教学方法的实施,既可以使老师在个别复杂章节的授课中知道学生理解上的难点和兴趣所在,利于老师有针对性的备课;又可以给学生提供制作幻灯片和讲演的锻炼机会。当然本法也存在学生讲解的内容和形式难以控制等缺点,但相信,经过进一步的完善,这些缺点能够得到有效的克服。