1995-2016年新疆维吾尔自治区伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳分子分型分析

目的 通过对新疆维吾尔自治区（新疆）1995-2016年伤寒沙门菌进行分子流行学特征分析,为今后监测和疫情预警提供依据。方法 利用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对527株伤寒沙门菌进行分子分型和流行特征研究。结果 527株伤寒沙门菌分为145个PFGE带型,条带相似度为57.42%~100.00%。有部分带型多年持续存在,且出现在不同地区。共发现32组分子分型成簇性病例。结论 新疆伤寒沙门菌在基因型上存在高度多态性,同时也有优势带型长期连续存在,且存在分子分型成簇性病例,需要加强实验室监测。     

利用实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测鸭沙门菌

目的为快速检测、鉴定鸭沙门菌，避免血清型误判，提高鸭沙门菌暴发应对能力，建立一种实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测方法。方法随机挑选60株鸭沙门菌及238株肠道常见病原菌代表菌株，针对鸭沙门菌血清型特异基因AW58_15605设计引物并建立qPCR检测体系，通过纯菌菌株、模拟粪便样本及临床样本评价该体系的特异度、灵敏度及检测下限。结果60株鸭沙门菌株及临床感染的50份样本扩增结果均为阳性，而对鸭沙门菌血清型以外的其他沙门菌及肠道菌的扩增均为阴性。 对鸭沙门菌纯菌DNA的最低检测下限为8拷贝/反应。 粪便模拟样本检测中，增菌后qPCR检测下限达59.10 cfu/g，明显低于分离培养及增菌前。结论本研究建立的基于特异基因的鸭沙门菌分子检测方法具有可操作性强、特异度高、灵敏度高的特点，建议在应急情况下优先选择qPCR用于沙门菌暴发筛查、鉴别及诊断由其引起的腹泻性疾病。     

河弧菌VfqI-VfqR密度感应系统对VflT6SS2附属基因簇中vgrG操纵子的调控研究

  目的  探究河弧菌VfqI-VfqR密度感应系统对VflT6SS2附属基因簇hcp-vgrG中vgrG操纵子的调控。   方法  使用荧光定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测野生株和VfqI-VfqR系统缺失株中vgrG的mRNA水平。 利用启动子-lux报告质粒系统检测冷光值,确定vgrG启动子在河弧菌野生株、缺失株、回补株中的活性差异。 在大肠埃希菌中,导入VfqR过表达质粒,检测vgrG启动子-lux报告质粒冷光值,确定VfqR可否激活vgrG启动子。  结果  ?vfqI、?vfqR和?vfqI-vfqR缺失株中vgrG mRNA水平和启动子活性均显著低于野生株;在?vfqR中回补VfqR表达质粒pSRvfqR和在?vfqI中分别添加3-oxo-C₁₀-HSL、C₁₀-HSL和3-oxo-C₁₂-HSL AHLs分子均能恢复vgrG启动子活性,并且3种AHLs分子效果大体一致。 在大肠埃希菌中过表达VfqR并添加上述3种外源AHLs,对vgrG启动子活性没有影响。  结论  VfqI-VfqR密度感应系统在启动子水平正性调控vgrG操纵子,并且该调控作用是间接的。     

一起沙门菌爆发的菌株鉴定和分子溯源研究

[目的]1起沙门菌爆发的菌株鉴定和分子溯源研究。[方法]收集2007年上海市黄浦区1起食源性沙门菌爆发病例的菌株,使用3种不同产地沙门菌分型血清进行菌株比对鉴定,测试菌株耐药性并对部分菌株进行多位点基因序列分型(MLST)。通过Pluse Net China非伤寒沙门菌数据库聚类分析上海市与重庆市爆发菌株的脉冲凝胶电泳(PFGE)图谱。[结果]发生在上海市黄浦区某工地爆发的1起食源性菌株,经血清学和MLST鉴定为汤卜逊沙门菌ST26型;菌株对6种抗生素(四环素、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、氯霉素、萘啶酸、磺胺异恶唑)的耐药率均为100%。2007年重庆市报告多起食源性爆发案例中的C群沙门菌,经鉴定亦为汤卜逊沙门菌ST26型,与上海市的菌株间存在高度遗传同源性。[结论]兰州生物制品研究所和泰国S&A的沙门菌分型血清的H因子"c"和"k"间存在交叉凝集。2007年上海市黄浦区发生的食源性爆发病例可能为输入性汤卜逊沙门菌ST26型的多重耐药克隆株引起。     

四川省2005年霍乱分子流行病学特征

目的：分析四川省2005年霍乱弧菌分子特征,以及霍乱暴发疫情分离的菌株与菌株之间,疫情分离的菌株与海、水产品监测分离的霍乱弧菌之间的遗传相关性,查找霍乱传染来源,为预测疫情和制定防治措施提供依据.方法：利用聚合酶链反应（PCR）检测O139群霍乱弧菌特异性编码脂多糖基因（LPS）和霍乱毒力基因（ctxAB）;脉冲场凝胶电泳对菌株进行分子分型,所得结果以BioNumerics V4.0软件UPGMA方法进行聚类分析.结果：所试16株霍乱弧菌14株LPS阳性,为O139群霍乱弧菌;另2株为O1群稻叶型霍乱弧菌.2株稻叶型霍乱弧菌和1株O139群霍乱弧菌ctxAB阴性,其余13株菌均具有ctxAB,为产毒株.对16株菌以NotⅠ酶切后PFGE可分为5个型别.O139群霍乱弧菌优势流行株与从甲鱼分离的O139群霍乱弧菌PFGE型别一致,且同为产毒株.结论：甲鱼等海、水产品被O139群霍乱弧菌污染情况严重,甲鱼中分离的O139群霍乱弧菌与霍乱疫情分离菌株之间高度同源,被污染的甲鱼可能是本年度食源性霍乱暴发的主要传染来源之一,海、水产品的监测是近期霍乱防控的重点.     

扩增片段长度多态性分析用于霍乱弧菌分子分型的方法建立和应用评价

目的建立霍乱弧菌的基于红外荧光标记引物的扩增片段长度多态性(AFLP)分型方法,评价脉冲场凝胶电泳(PFGE)和AFLP对霍乱弧菌的分型能力。方法选择PFGE带型均不相同的47株霍乱弧菌作为评价菌株,建立AFLP对于霍乱弧菌的分型方法;确定操作程序后选择83株分离自1962-2005年11个省的霍乱弧菌,进行AFLP和PFGE对于霍乱弧菌分型能力的比较。AFLP分型方法采用了红外荧光标记PCR引物,利用LI-COR4300自动测序仪完成电泳、SagaMX软件对电泳图谱进行编辑。PFGE采用PulseNet提供的标准化程序。结果AFLP用于霍乱弧菌分型时选择性引物携带碱基数为1,最优引物组合为EcoRⅠ-G／MseⅠ-T,AFLP分型实验的重复性达到99．2％。AFLP将83株霍乱弧菌分为52个型别,D值为0．9545;PFGE将此83株菌分为44种带型,D值为0．9251。结论优化固定了AFLP对于霍乱弧菌的分型程序,重复性好;AFLP比PFGE具有更好的分型能力,能够用于分离菌株的分子分型。结合已成为实验室网络监测标准分析方法的PFGE,可对分离株做更细致的分型比较。     

上海市罕见沙门菌型腹泻的溯源研究

[目的]初步了解本市罕见沙门菌血清型菌株的分子流行病学特征。[方法]对分离自不同来源标本的22株7种不同血清型沙门菌进行脉冲凝胶电泳(PFGE)分析,脉冲凝胶电泳选用XbaⅠ限制性内切酶。[结果]2株列克星敦、2株非丁伏斯沙门菌的电泳图谱显示有较大差异,2株蒙得维的亚、2株朗根萨尔查、2株乌普萨拉、5株胥戈成格隆、4株波摩那的图谱显示存在同源性。[结论]本市沙门菌罕见血清型的流行菌株和食品菌株之间既存在分子水平的同源性也存在非同源性,加强沙门菌综合监测和即时分子分型可预警罕见沙门菌血清型流行。     

上海市肠炎沙门菌流行特征和分子分型研究

[目的]分析上海市2006—2007年肠炎沙门菌菌株,了解上海市肠炎沙门菌分子流行病学特征。[方法]回顾2002—2007年肠炎沙门菌食品株来源并与肠炎沙门菌腹泻株作耐药性比较;对2006—2007年全球沙门菌监测(GSS)病例和食品分离的肠炎沙门菌进行表型验证、药敏试验和脉冲凝胶电泳(PFGE)分析。[结果]2006—2007年肠炎沙门菌在本市非伤寒沙门菌病例中列首位,而80%的食品株源自禽及禽肉制品,食品株的抗生素耐药性高于腹泻株。2007年肠炎沙门菌腹泻株的耐药谱和2006年有较大差异。包括13株食品株在内共76株肠炎菌株可分为21种PFGE带型,遗传同源性接近80%,优势带型依次为3型(34株)、1型(12株)、2型(5株)和5型(5株),除2型外均发现有与腹泻株同型的食源株。2006和2007年的PFGE 1/2型病例分别为4例和12例。[结论]上海市肠炎沙门菌病例与食用污染的鸡肉等禽类制品有密切关系,PFGE 3型肠炎沙门菌是目前上海市肠炎沙门菌流行株的优势菌型,2007年发现由鹅肝传播的1/2型肠炎沙门菌可能是3型的变异株并有取代之成为流行菌株的趋势。开展对腹泻病例和食物链的综合监测和以实验室为主的实时分子分型检测能快速预警肠炎沙门菌散在爆发和追溯污染源。     

群体感应调控子AphA对河弧菌Ⅵ型分泌系统VflT6SS2的调控研究

目的 研究河弧菌群体感应调控子AphA对Ⅵ型分泌系统VflT6SS2功能活性的调控机制。方法 采用Western Blot检测河弧菌野生株、aphA缺失株（ΔaphA）和aphA回补株中VflT6SS2标志性组件溶血素共调节蛋白（Hcp）的表达和分泌。采用实时荧光定量PCR和启动子-lux 融合冷光系统检测野生株和ΔaphA中VflT6SS2核心基因簇和附属基因簇代表基因tssB2、hcp（tssD2）和vgrG（tssI2）以及群体感应调控子HapR的mRNA相对表达量和启动子活性。采用定点突变实验结合启动子活性测定确定AphA在 tssD2b启动子区的调控结合位点;采用电泳迁移率位移测定（EMSA）确定AphA与hapR启动子的结合。结果 ΔaphA中tssB2、hcp（tssD2）、vgrG（tssI2）和hapR的mRNA相对表达量及Hcp蛋白的表达分泌明显高于野生株。VflT6SS2核心基因簇、tssD2a、tssI2a和hapR的启动子活性在ΔaphA中均高于野生株,而tssD2b启动子活性则低于野生株。tssD2a和tssD2b的启动子序列分析显示-335 bp~-229 bp区差异较大,在tssD2b中该区域存在2个潜在AphA结合位点,将其中的保守位点ATG替换为CGA,tssD2b启动子活性明显降低。EMSA结果显示,AphA与hapR启动子直接结合。结论 AphA在转录水平直接抑制hapR的表达,间接参与对VflT6SS2核心基因簇和附属基因簇的调控。AphA对tssD2a和tssD2b呈现相反的调控模式,AphA可直接与tssD2b启动子区（-335 bp~-229 bp）结合正向调控tssD2b的表达。     

中国肠炎沙门菌脉冲场凝胶电泳分子分型数据库的分析

目的 了解近几年我国肠炎沙门菌临床分离株的流行病学及脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型特点,为以实验室为基础的食源性疾病暴发的发现及疫情控制提供依据。 方法 根据PulseNet公布的沙门菌PFGE分型方案,对2004-2012年分离自我国13个省(直辖市)的981株肠炎沙门菌进行流行病学及PFGE分子分型分析。 结果 981株肠炎沙门菌经XbaⅠ酶切,PFGE获得126种带型,其分辨能力(D值)为0.8336。优势带型为JEGX01.CN0003、JEGX01.CN0001、JEGX01.CN0002、JEGX01.CN0005和JEGX01.CN0016。暴发相关带型是JEGX01.CN0003、JEGX01.CN0001和JEGX01.CN0150。肠炎沙门菌优势带型PFGE的共有条带分别为(0.8%)655、325、310、245、178和110 kbp。 结论 我国肠炎沙门菌临床分离株存在PFGE优势型别,PFGE对于肠炎沙门菌XbaⅠ单酶切分型能力有限,用于暴发确认或发现时需多种酶切联合使用,提高分辨能力。