El Tor型霍乱弧菌口服活疫苗候选株IEM108的构建

目的 构建能够诱导抗菌抗毒素免疫和抵抗CTXΦ转染的霍乱弧菌生物安全性口服活疫苗候选株。方法 以不产毒的EI Tor型霍乱弧菌疫苗候选株IEMl01为出发菌株，以管家基因thyA为选择压力，在IEMl01的thyA基因缺失株IEMl01-T中，通过质粒．染色体致死平衡系统表达霍乱毒素B亚单位基因ctxB和介导CTXΦ噬菌体免疫的rstR基因。在家兔模型中，通过检测血清杀弧菌抗体和抗CTB的IgG抗体来评价该新建疫苗候选株的免疫原性；以对家兔攻毒试验后肠段积液量来评价其保护力。结果 含ctxB、rstR和大肠杆菌来源的thyA基因的重组质粒在：IEMl01-T中稳定存在，GMI-ELISA检测ctxB基因能够很好表达。动物试验表明，该新建疫苗候选株能刺激机体产生高滴度的血清杀弧菌抗体和抗CTB IgG抗体，能较好抵抗至少4μg纯品CT和不同毒株的攻击。结论 应用质粒．染色体致死平衡系统构建了能抵抗CTXΦ转染和稳定表达ctxB的生物安全性抗菌抗毒口服活疫苗候选株，其在家兔模型中有较好的免疫原性和保护力。     

荧光定量PCR检测细菌染色体上基因拷贝数

目的建立一种以细菌染色体上1个已知拷贝管家基因作为基准、通过荧光定量PCR检测其他被检基因拷贝数的方法.方法利用荧光定量PCR检测El Tor型霍乱弧菌染色体上目的基因zot与基准基因thyA的Ct（threshold cycle）值差值,根据已知拷贝数菌株N16961的两基因Ct值之差来推算待测菌株中zot基因的拷贝数.结果利用thyA基因作参照,确定11株E1 Tor型霍乱弧菌中zot基因的拷贝数在1～5个之间,对较少拷贝数的检测与Southern blot确认的相同,对多拷贝数检测优于Southern blot的判定.结论本方法可以准确检测菌株染色体上的基因拷贝数.     

群体感应调控子AphA对河弧菌Ⅵ型分泌系统VflT6SS2的调控研究

目的 研究河弧菌群体感应调控子AphA对Ⅵ型分泌系统VflT6SS2功能活性的调控机制。方法 采用Western Blot检测河弧菌野生株、aphA缺失株（ΔaphA）和aphA回补株中VflT6SS2标志性组件溶血素共调节蛋白（Hcp）的表达和分泌。采用实时荧光定量PCR和启动子-lux 融合冷光系统检测野生株和ΔaphA中VflT6SS2核心基因簇和附属基因簇代表基因tssB2、hcp（tssD2）和vgrG（tssI2）以及群体感应调控子HapR的mRNA相对表达量和启动子活性。采用定点突变实验结合启动子活性测定确定AphA在 tssD2b启动子区的调控结合位点;采用电泳迁移率位移测定（EMSA）确定AphA与hapR启动子的结合。结果 ΔaphA中tssB2、hcp（tssD2）、vgrG（tssI2）和hapR的mRNA相对表达量及Hcp蛋白的表达分泌明显高于野生株。VflT6SS2核心基因簇、tssD2a、tssI2a和hapR的启动子活性在ΔaphA中均高于野生株,而tssD2b启动子活性则低于野生株。tssD2a和tssD2b的启动子序列分析显示-335 bp~-229 bp区差异较大,在tssD2b中该区域存在2个潜在AphA结合位点,将其中的保守位点ATG替换为CGA,tssD2b启动子活性明显降低。EMSA结果显示,AphA与hapR启动子直接结合。结论 AphA在转录水平直接抑制hapR的表达,间接参与对VflT6SS2核心基因簇和附属基因簇的调控。AphA对tssD2a和tssD2b呈现相反的调控模式,AphA可直接与tssD2b启动子区（-335 bp~-229 bp）结合正向调控tssD2b的表达。     

河弧菌VfqI-VfqR密度感应系统对VflT6SS2附属基因簇中vgrG操纵子的调控研究

  目的  探究河弧菌VfqI-VfqR密度感应系统对VflT6SS2附属基因簇hcp-vgrG中vgrG操纵子的调控。   方法  使用荧光定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测野生株和VfqI-VfqR系统缺失株中vgrG的mRNA水平。 利用启动子-lux报告质粒系统检测冷光值,确定vgrG启动子在河弧菌野生株、缺失株、回补株中的活性差异。 在大肠埃希菌中,导入VfqR过表达质粒,检测vgrG启动子-lux报告质粒冷光值,确定VfqR可否激活vgrG启动子。  结果  ?vfqI、?vfqR和?vfqI-vfqR缺失株中vgrG mRNA水平和启动子活性均显著低于野生株;在?vfqR中回补VfqR表达质粒pSRvfqR和在?vfqI中分别添加3-oxo-C₁₀-HSL、C₁₀-HSL和3-oxo-C₁₂-HSL AHLs分子均能恢复vgrG启动子活性,并且3种AHLs分子效果大体一致。 在大肠埃希菌中过表达VfqR并添加上述3种外源AHLs,对vgrG启动子活性没有影响。  结论  VfqI-VfqR密度感应系统在启动子水平正性调控vgrG操纵子,并且该调控作用是间接的。     

沙门菌常规检测方法分段控制技术在网络实验室构建中基础作用的评估

目的评估沙门菌常规检测方法分段控制技术在网络实验室建设中的基础性作用。方法建立经过关键点技术控制评价的沙门菌检测方法,评估上海市参加世界卫生组织一全球沙门菌监测项目(WHO-GSS)、中美新发和再发传染病项目(GFN)网络实验室的实施,培训云南省玉溪市疾病预防控制中心腹泻标本沙门菌常规检测能力,收集2006-2012年省级GSS-GFN监测点年度沙门菌监测阳性率。结果基于分段控制技术设计的沙门菌分离、鉴定和种属鉴定、血清分群方法,能同时满足网络实验室对伤寒、非伤寒沙门菌检测敏感性需求;上海市网络实验室建设从2006年的5个公共卫生实验室和8个临床实验室发展到2011年的9和22个,伤寒、非伤寒沙门菌临床分离菌株从2006年的196株增加到2011年1442株;2012年云南省玉溪市临床腹泻病例沙门菌阳性率为2.4%;除上海外还有3个省级监测点将亚硒酸盐磺绿增菌液(SBG)作为沙门菌选择性增菌液,以上海市沙门菌监测基线最稳定。结论常规沙门菌检测分段优化的方法是构建区域网络实验室的基础,由此可上升为具有精确表型鉴定和分子分型能力的国家网络实验室。     

耶尔森菌病诊断团体标准解读

耶尔森菌病是我国丙类法定报告传染病“其他感染性腹泻”中的一种，是一种较为重要的食源性疾病，但我国在诊断上一直缺乏依据或标准。中华预防医学会组织中国CDC传染病预防控制所等单位撰写《耶尔森菌病诊断（T/CPMA 005－2019）》团体标准，以“合法性、科学性、先进性、可行性”为原则，给出了耶尔森菌病的明确定义，对其诊断依据、原则和主要鉴别诊断等进行了规定，并提供了耶尔森菌病的流行病学和临床表现作为资料性附录，耶尔森菌病的实验室检测作为规范性附录，为我国各级医疗机构和CDC工作人员进行耶尔森菌病的诊断提供准确依据和方法，解决在临床个案和暴发事件中耶尔森菌病无法明确诊断的问题。     

霍乱弧菌宿主整合因子亚单位的可溶性克隆表达

目的 克隆表达霍乱弧菌全局性调节子宿主整合因子(integration host factor, IHF)亚单位基因ihfB。方法 以C7258染色体为模板, 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增ihfB基因, 扩增产物经NheⅠ和SapⅠ酶切后克隆入表达载体pXTB1;将ihfB的N端和亚单位基因ihfA的C端通过搭桥PCR重组, 重组片段N-ihfB-C-ihfA经NheⅠ和SapⅠ双酶切后克隆入表达载体pXTB1。重组质粒导入大肠埃希菌ER2566, 0.4 mmol/L IPTG诱导表达, 超声裂解, 上清经CBD柱吸附纯化, 二硫苏糖醇(DTT)柱上裂解洗脱。结果 成功构建表达野生型ihfB基因和嵌合体N-ihfB-C-ihfA的重组表达质粒pXTB1-ihfB和pXTB1-N-ihfB-C-ihfA, 并在宿主菌ER2566中诱导表达。pXTB1-ihfB为不溶性的包涵体表达, pXTB1-N-ihfB-C-ihfA为可溶性表达, 并获得高纯度的表达产物。结论 克隆表达了IHF 亚单位基因ihfB, IHF-的C端可显著提高IHF-的可溶性, 获得可溶性表达的纯化IHF-嵌合体蛋白, 为后续调控功能研究奠定了基础。     

一起沙门菌食物中毒的实验室诊断与分析

目的 查明内蒙古某市某村发生食物中毒突发公共卫生事件的性质规模,调查可疑危险因素及其污染来源,控制疫情蔓延. 方法 制定病例定义,开展病例主动搜索,采集患者肛拭子及粪便样品、可疑食品及环境样品,进行病原菌的分离培养.分离菌株进行生化和血清学鉴定,PFGE分子分型和药敏检测. 结果 共出现43例感染病例,均参加了2014年5月6日的婚宴聚餐.19份检测样品中从7份患者肛拭子分离到肠炎沙门菌,志贺菌、致泻性大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及蜡样芽孢杆菌检测阴性.7株肠炎沙门菌XbaⅠ酶切后的PFGE谱型完全相同,说明感染菌株来自同一个克隆,即有共同的感染源头.PulseNet China数据库比对分析显示,本次疫情菌株的PFGE图谱与我国肠炎沙门菌分离株中常见的PFGE带型JEGX01.CN0002 完全相同. 结果 此次事件为一起肠炎沙门菌引起的食物中毒,感染菌株具有国内优势的PFGE带型.     

霍乱弧菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因mtlD的克隆表达

目的克隆表达霍乱弧菌甘露醇特异性磷酸烯醇式丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统操纵子中的甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因mtlD。方法以测序株N16961染色体为模板,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增mtlD基因,扩增产物经NdeⅠ和XhoⅠ酶切后克隆入表达载体pET-30a。0.1 mmol/L IPTG诱导表达,超声裂解上清经Ni柱亲和层析纯化,比色法测定酶活性。结果 mtlD基因成功克隆入表达载体pET-30a,在宿主菌BL21中诱导表达,利用Ni亲和层析柱获得较高纯度的羧基端带His标签的MtlD蛋白,并具有酶活性。结论表达纯化了有活性的霍乱弧菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶,为进一步的功能研究打下了基础。     

河弧菌研究概况

河弧菌(Vibrio fluvialis)被认为是新发的食源性致病菌,能够引起腹泻暴发流行,对全球公共卫生安全造成潜在危险,尤其在发展中国家的沿海地区和卫生条件差的区域。经过30多年的研究和探索,人们对河弧菌及其致病性和感染的流行病学特征有了一定的了解和认识,本研究就河弧菌的发现、病原学特征,致病性、流行病学特征,临床表现等相关研究进展做一综述。