自身启动子调控miR-7真核表达载体的构建及其意义

目的 构建带有miR-7自身启动子的miR-7重组真核表达载体,研究其对人肺癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响.方法 预测miR-7启动子序列,设计含有该序列和miR-7前体序列目的片段的引物,PCR扩增后亚克隆入pGL3.0-Basic载体以构建miR-7自身启动子调控的真核表达载体pGL3.0-Basic-miR-7-promoter(命名为p-miR-7-pro);将所构建载体转染人肺癌95D细胞,Real-time PCR探针法检测95D细胞中miR-7的表达水平;MTT和克隆形成实验分别检测95D细胞的增殖和克隆形成能力;划痕法观察95D细胞体外迁移能力的变化;FACS检测95D细胞的凋亡情况.结果 酶切和测序结果证明成功构建p-miR-7-pro真核表达载体,转染95D细胞后可有效表达miR-7;与对照组相比,p-miR-7-pro转染组95D细胞的体外增殖能力受到明显的抑制(0.60 ±0.03 vs 0.19 ±0.05,P＜0.05);同时其迁移能力也显著降低(473 ±7 vs 99 ±2,P＜0.05);而细胞凋亡则显著增加(9.233 ±0.586％vs 12.967 ±0.643％,P＜0.05).结论 成功构建由自身启动子调控的miR-7真核表达载体,为后续研究miR-7在肺癌基因治疗中的作用提供重要实验基础.     

M2型巨噬细胞标志物CD163与肿瘤的研究进展

CD163是清道夫受体超家族重要成员，主要表达于单核细胞和巨噬细胞表面，被认为是一种高特异性的M2型肿瘤相关巨噬细胞标志物。CD163既可作为免疫调节剂抵抗炎症，又作为肿瘤相关巨噬细胞家族成员对肿瘤的增殖、转移等产生重要影响。CD163分子在恶性肿瘤中的表达日益受到关注，已有研究表明CD163与乳腺癌、膀胱癌、肺癌及结直肠癌等恶性肿瘤密切相关。本文对CD163的结构功能及在多种肿瘤的研究进展进行综述。     

结核分枝杆菌Hsp60 影响小鼠巨噬细胞抗原提呈相关分子表达的研究

目的:探讨结核分枝杆菌热休克蛋白60(MTB Hsp60)对小鼠骨髓巨噬细胞MHCⅡ类分子表达的影响。方法:采用50 ng/ml、100 ng/ml的MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬细胞,分别在24 h、48 h、72 h收集细胞提取mRNA,采用实时荧光定量PCR检测PⅣ、PⅢ、PⅠ、IL-27、CⅡTA的mRNA表达水平;分别用50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml的MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬细胞,流式细胞术检测巨噬细胞MHCⅡ/F4/80、CD86/F4/80的百分比。结果:50 ng/ml MTB Hsp60刺激后CⅡTA、PⅣ、IL-27、PⅠ在3个时间点的总体比较差异有统计学意义(P0.05),3个时间点两两比较,CⅡTA在72 h的表达与24 h的表达相比明显降低(0.543±0.034 vs 1.859±0.689,P0.017),PⅣ在48 h的表达与24 h的表达相比明显降低(0.442±0.061 vs 0.834±0.030,P0.017),IL-27在48 h的表达与24 h的表达相比明显降低(1.519±0.041 vs 1.711±0.016,P0.017),72 h的表达与24 h的表达相比明显增高(2.606±0.193 vs 1.711±0.016,P0.017),PⅠ在48 h的表达与24 h的表达相比明显降低(1.221±0.019 vs 1.567±0.037,P0.017);100 ng/ml MTB Hsp60刺激后CⅡTA、IL-27、PⅠ在3个时间点的总体比较差异有统计学意义(P0.05),3个时间点两两比较,IL-27在48 h、72 h的表达与24 h的表达相比明显增高(2.609±0.246/0.867±0.049 vs 0.602±0.096,P0.017),PⅠ在72 h、48 h的表达与24 h的表达相比明显增高(0.811±0.085/1.361±0.199 vs 0.526±0.140,P0.017)。100 ng/ml MTB Hsp60刺激后的PⅢ、PⅠ、CⅡTA的mRNA表达水平相较于50 ng/ml MTB Hsp60刺激后有所下调(P0.05),而PⅣ的mRNA表达水平增高(P0.05)。MHCⅡ/F4/80的表达百分比在3个不同浓度刺激后比较差异具有统计学意义(P0.05):MHCⅡ/F4/80的表达在200 ng/ml MTB Hsp60刺激后相较于50 ng/ml MTB Hsp60的刺激有所下调,而CD86/F4/80的mRNA表达水平增高。结论:MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬细胞后CⅡTA、PⅣ、IL-27、PⅠ、PⅢ的mRNA表达有显著变化且受到MTB Hsp60浓度和时间的影响,MHCⅡ类分子随MTB Hsp60刺激浓度的增加而减少,CD86随MTB Hsp60刺激浓度的增加而增加,提示MTB Hsp60抑制小鼠骨髓巨噬细胞MHCⅡ类分子的表达,促进黏附分子的表达,即Hsp60可能抑制巨噬细胞抗原提呈功能从而影响其抗原提呈相关分子的表达,使MTB逃避巨噬细胞的免疫杀伤,进一步导致MTB慢性感染和潜伏感染。     

重组hIL-10抗家兔皮肤移植反应中CC、IL-8/CXCL8趋化因子的变化

目的:检测家兔皮肤移植经rhIL-10作用后,血清中CC、IL-8/CXCL8趋化因子的变化,探讨CC、IL-8/CXCL8趋化因子在rhIL-10抗免疫排斥机制中的作用。方法:皮肤移植家兔分6组:①rhIL-10低剂量,②rhIL-10高剂量,③CsA低剂量,④CsA高剂量,⑤rhIL-10+CsA低剂量联合和⑥生理盐水组;每只家兔均于术前1天开始肌注给药,连续注射10天;各组分别于术前1天、术后1、4、7、14、21、28天取外周血,分离血清,以ELISA法检测移植家兔血清CC、IL-8/CXCL8趋化因子水平。结果:(1)术后各组IL-8水平均升高,术后4天、7天⑥组IL-8水平高于各组(P<0.05)。(2)术后各组MCP-1水平明显升高,术后1天、4天,⑥组MCP-1水高于各组(P<0.05),术后7天⑥组MCP-1水平高于①组、⑤组(P<0.05);术后7天、14天CsA抑制组高于联合组(P<0.05)。(3)术后各组MIP-1α明显升高,术后4天⑥组MIP-1α水平高于①、③、⑤组,术后7天⑥组MIP-1α水平高于各组(P<0.05);(4)术后各组MIP-1β水平升高,但同时间段组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CC、IL-8/CXCL8趋化因子在皮肤移植后明显升高,表明在急性排斥反应中发挥了重要作用,随排斥反应加重而进一步增高,皮片排斥后下降,可作为观察和诊断移植排斥的合适标志物。     

过表达microRNA-7对人肺癌95D细胞凋亡的影响

目的 探讨过表达microRNA-7对人肺癌95D细胞体内外凋亡的作用。方法 将miR-7真核表达载体（命名为p-miR-7）体外瞬时转染人肺癌95D细胞,利用TUNEL法观察95D细胞凋亡的变化;免疫荧光技术检测各组细胞磷酸化Caspase3和Caspase9蛋白的表达;建立人肺癌裸鼠模型,肿瘤局部注射p-miR-7后利用TUNEL法检测肿瘤局部细胞凋亡变化,同时,免疫组织化学法检测凋亡相关的磷酸化Caspase3和Caspase9蛋白的表达变化。结果 体外转染p-miR-7后可导致人肺癌细胞的凋亡（P<0.05）。同时,细胞中磷酸化Caspase3和Caspase9蛋白水平显著增加（P<0.05）;肿瘤局部注射p-miR-7后,肿瘤局部miR-7表达水平及细胞凋亡也明显增强（P<0.05）,磷酸化Caspase3和Caspase9蛋白水平也显著增加。结论 过表达miR-7可以导致肿瘤细胞凋亡,这与凋亡相关蛋白Caspase3和Caspase9磷酸化水平增加有关。     

重组人白细胞介素10抗家兔同种异体皮肤移植排斥模型的建立

背景:研究表明,白细胞介素10在移植排斥反应的预防和治疗中具有一定的应用前景,有望成为一种新的临床用免疫抑制剂.动物移植模型是研究免疫抑制剂常用的实验平台,最常用的皮肤移植模型动物是小鼠,但小鼠属于小动物模型,移植技术要求较高.目的:建立家兔同种异体皮肤移植模型,观察重组人白细胞介素10抗家兔皮肤移植排斥反应的效果.方法:取家兔背部皮肤修剪成含真皮层的全厚皮片、中厚皮片和不含真皮层的薄层皮片进行家兔自体皮肤移植,随机分为固定组和非固定组,固定组用自制脖套对家兔头颈部活动进行一定限制;药物抗家兔同种异体移植排斥设重组人白细胞介素10组、环孢素A阳性对照组和生理盐水阴性对照组.采用混合淋巴细胞反应法观察家兔混合淋巴细胞反应增殖指数.在30 d内连续观察移植皮肤出现排斥的时间和移植皮片平均存活时间.结果与结论:供、受体混合淋巴细胞培养呈增殖反应,表明家兔同种异体主要组织相容性复合体不同,相互皮肤移植可发生排斥反应.移植皮片厚度以含真皮的中厚皮片为最佳;自制脖套固定可有效限制家兔脖头颈部活动,有利于移植创面的保护.实验成功建立了重组人白细胞介素10抗家兔同种异体皮肤移植排斥模型,重组人白细胞介素10具有抗移植排斥的作用.     

基因沉默PRDX1 表达对人结直肠癌SW480 细胞侵袭迁移的影响

目的:探讨RNA 干扰过氧化还原酶1(Peroxiredoxin 1,PRDX1)表达对人结直肠癌SW480 细胞侵袭转移能力的影响。方法:筛选RNA 干扰PRDX1 的慢病毒质粒,与阴性对照慢病毒质粒分组转染结直肠癌SW480 细胞,转染后的SW480 细胞可分为PRDX1 基因沉默组(si-PRDX1)和阴性对照组(Vector)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)分别检测两组细胞中PRDX1 mRNA 和蛋白表达;采用Transwell 侵袭和迁移实验检测基因沉默PRDX1 表达对结直肠癌细胞侵袭及迁移能力的影响;通过Western blot 检测两组细胞中基质金属蛋白酶(MMP)家族部分蛋白表达水平。结果:基因沉默PRDX1 表达可有效抑制结直肠癌SW480 细胞中PRDX1 mRNA 和蛋白水平的表达,与阴性对照组相比(Vector),差异均具有统计学意义(P<0.01),说明基因沉默PRDX1 的SW480 细胞系构建成功;Transwell 侵袭和迁移实验显示si-PRDX1组细胞的侵袭及迁移能力较对照组均明显降低(P<0.01);Western blot 结果显示,与Vector 组相比,si-PRDX1 组细胞中组织基质金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)的表达明显增加,而MMP-2 及MMP-9 的表达显著下降,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:基因沉默人结直肠癌SW480 细胞的PRDX1 表达可有效抑制细胞的侵袭、迁移及转移能力,其机制可能会通过调控TIMP-2、MMP-2 及MMP-9 的表达介导。     

卓越医师班人体结构学课程体系中系统解剖学授课初探

卓越医师培养的核心任务是改革医学人才培养体制,包括人才培养观念、培养模式、课程体系建设、教学内容更新、教学方法改革及考核评价体系等各个方面。就遵义医学院基础医学院开设的人体结构学新课程体系中系统解剖学知识的讲授方式,即将互助式、讨论式、案例式等多种教学模式融入教学当中并取得的成绩作一阐述,以期能够为其他学科提供借鉴。     

结核分枝杆菌38KD蛋白对小鼠树突状细胞的功能影响

【立论依据】 结核分枝杆菌(MTB)是结核病的病原菌,属胞内寄生菌。MTB感染机体后由抗原提呈细胞(APC)将抗原分子提呈给初始T细胞,诱导体内产生以细胞免疫为主的适应性免疫应答。树突状细胞(DC)作为提呈能力最强的APC在机体抗结核免疫中起着重要作用。有研究表明MTB可通过影响DC的功能来调节淋巴细胞的应答。如Palma 等发现MTB的PstS1蛋白可刺激DC诱导记忆性T细胞增殖并分泌更多的IFN-γ 和 IL-22;Byun 等则发现Rv0315(一种新的MTB抗原)可促进DC的成熟进而诱导Th1型免疫应答。而38KD蛋白作为MTB的一种具有强免疫原性的免疫原,其对树突状细胞的影响尚不清楚。本课题通过体外诱导表达MTB-38KD蛋白,刺激小鼠DC,研究其相关分子的变化情况,以明确38KD蛋白对DC的功能影响。 【设计思路】 构建38KD载体,诱导蛋白表达纯化后体外刺激小鼠DC,在不同时间点检测DC相关分子表达情况。 【实验内容】 38KD蛋白基因从MTB提取扩增验证后,将其构建到pET28a质粒上转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达并纯化,以不同浓度38KD蛋白刺激小鼠骨髓源DC,在不同时间点用流式细胞术检测表面CD11c、B7、MHC-Ⅱ等分子表达、ELISA检测培养上清IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ分泌情况。 【材料】 昆明小鼠、MTB菌株、质粒pET28a、BL21(DE3)、DNA纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、SDS-PAGE配胶所需试剂、相关细胞因子ELISA检测试剂盒、荧光标记抗体(抗CD11c、B7、MHC-Ⅱ)等。 【可行性】 已有研究表明MTB的抗原成分与DC有关,38KD蛋白作为MTB的主要免疫原,极有可能对DC的功能有一定的影响;项目组已构建38KD蛋白原核表达载体,并参与发表相关科研文章,具有一定的结核研究基础,并可提供相关理论和技术支持。 【创新性】 本课题首次观察MTB-38KD蛋白对小鼠DC的影响,为后续抗MTB感染机制的研究提供理论基础。     

HLA与免疫性疾病的研究进展

近年来,分子生物学技术的发展及其在HLA研究中的应用,使HLA研究取得了极大的进展,人类主要组织相容性复合体即HLA复合体,已完成全部基因的测序工作,基因图发表于1999年10月底的Nature杂志。HLA研究推动了HLA与疾病关联的分子机理研究,这有助于了解遗传因素在疾病发病机制中的作用,而且对促进疾病发病机理、基因调控、诊断及防治等方面的研究起到了积极作用,也是一个揭示MHC功能及其免疫调节机制的极佳切入口。