问号钩端螺旋体胶原酶结构和功能分析

目的：研究问号钩端螺旋体(简称问号钩体)致病机理，预测问号钩体胶原酶结构和功能，为进一步实验验证提供线索。方法：利用各种公共核酸及蛋白数据库资源，运用多种生物学软件对钩体胶原酶基因及其编码产物的结构和功能深入分析。结果：对问号钩体胶原酶进行了结构域归类；对其基因、蛋白的一般特性，蛋白一级结构，二级结构和超二级结构等作了对比性分析；对其序列中的部分片段：进行三维结构模拟；并绘制了其分子进化树，分析其垂直进化关系。结论：问号钩体胶原酶和其它多：种致病性微生物胶原酶具有不同层次、程度不等的相似性。它属于锌蛋白酶超家族和M9-蛋白酶家族。它可能在钩体浸润宿主并造成宿主多脏器出血等方面起重要作用。     

双曲钩端螺旋体溶血素基因tlyA的克隆、表达及初步功能鉴定

目的研究双曲钩端螺旋体(简称双曲钩体)是否含有溶血素基因,并鉴定其溶血活性。方法对双曲钩体LEBIa2503基因编码产物进行结构域预测、序列比对后,PCR扩增目的片断,克隆到原核表达载体pET28b( ),转化宿主细胞,并诱导表达产物进行初步功能鉴定。同时,以RT-PCR检测LEBIa2503的转录情况。另外,也对双曲钩体菌体本身有无溶血活性进行检测。结果双曲钩体LEBIa2503基因与问号钩体tlyA溶血素基因在蛋白水平上有相同的结构域,属于直系同源基因(orthologues gene)。原核表达的重组融合蛋白在羊血平板上出现β-溶血环。以RT-PCR的方法能检测到在双曲钩体中有LEBIa2503基因的转录,但双曲钩体菌体本身则检测不到溶血活性。结论未发现双曲钩体有溶血活性,但其含有溶血素基因tlyA,并且在普通培养环境下能被转录,这对进一步研究其内在机制奠定了基础,并对探索致病性问号钩体致病机制提供了一定线索。     

应重视幽门螺杆菌的分离培养

目的通过比较3种不同幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染诊断方法之间的差异,使临床重视Hp的分离培养工作.方法对2000年我院胃镜检查者312例同时作Hp分离培养、病理切片和快速脲酶试验,比较其检出率.结果近期未用抗菌药物治疗的十二指肠溃疡患者活检材料中Hp分离培养检出率达93.75%,把其他2种方法与分离培养相比,则快速脲酶试验存在20.72%的假阳性和3.98%的假阴性结果,病理切片存在8.11%的假阳性和32.84%的假阴性结果;快速脲酶试验和病理切片组合后与分离培养相比,则存在2.99%的假阴性和23.42%的假阳性.结论分离培养是Hp感染诊断的金标准,临床上应积极推广应用.     

致病性钩端螺旋体对豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的抑制作用

目的通过比较不同毒力钩端螺旋体对豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响,探讨固有免疫在钩端螺旋体病发病机制中的作用。方法用三种不同毒力的钩体（致病性问号钩端螺旋体赖型有毒株Lai株、赖型无毒株IPAV株以及非致病性双曲钩端螺旋体Patoc型Patoc Ⅰ株）分别感染体外培养的豚鼠腹腔巨噬细胞,并分别于感染后0.5、1．5、3和6h加入热灭活表皮葡萄球菌孵育30min,通过计算巨噬细胞对灭活表皮葡萄球菌的吞噬率和吞噬指数,检测钩体对巨噬细胞吞噬功能的影响;感染后3h透射电镜观察巨噬细胞对钧体的吞噬、降解和细胞超微结构的变化;     

豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬钩端螺旋体的机制研究

目的 研究豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬钩端螺旋体毒力株的机制,探讨天然免疫在钩端螺旋体病发病机制中的作用。方法 提取豚鼠腹腔巨噬细胞,感染1 h前分别加入细胞微丝阻断剂cytochalasin D、微管阻断剂colchicine和PI3K信号通路阻断剂LY294002,同时设立不含阻断剂的对照组,1 h后检测细胞活性。与致病性问号钩体赖型Lai株共同孵育3 h后,激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞吞噬钩体的形态学特征,流式细胞术检测各组吞噬率。结果 对照组巨噬细胞对钩体的吞噬率为（38.98±0.91）%;cytochalasin D组、colchicine组和LY294002组的吞噬率分别为（23.99±1.40）%、（40.81±0.91）%和（39.64±3.56）%;cytochalasin D组吞噬率明显低于对照组（P<0.05）;colchicine组和LY294002组与对照组比较差异无统计学意义（均P>0.05）。结论 微丝参与了豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬毒力钩体的过程,微管在吞噬过程中不起关键作用,微丝的变化不依赖PI3K信号通路。     

问号钩体趋化相关基因特征分析

目的 预测问号钩体黄疸出血群赖型赖株的趋化信号传导途径，并深入分析趋化相关基因。方法 使用ProtParam tool，NCBI／Blastp进行蛋白参数分析和结构域分析，使用Clustalw软件进行多序列对比，与大肠埃希菌K-12趋化相关基因进行比较。结果 问号钩体趋化相关基因共30个，分为MCPs和che两组基因，功能与大肠埃希菌趋化相关基因相似，并预测出问号钩体趋化信号传导途径。结论 问号钩体趋化相关基因较大肠埃希菌、苍白密螺旋体和伯氏疏螺旋体多，提示其趋化传导途径更为复杂，适应宿主的能力也更强，可能是钩体的重要毒力因子之一。     

问号钩端螺旋体全基因组的更新注释

目的对问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库中未注释的基因进行重新注释,并寻找可能的新致病基因.方法将钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库中功能未知的编码序列(CDSs)在BLASTP/NCBI数据库中比较,初步预测基因功能,对可能的致病基因及其编码产物运用多种生物学软件进行深入分析.结果未知CDSs中有82个与NCBI数据库中的编码蛋白序列有很高的同源性,其中LA0063和LA3291编码金属蛋白酶,可能与致病有关.结论通过钩端螺旋体黄疸出血群赖株全基因组数据库中功能未知的CDSs进行定期比对,可以不断完善该数据库的功能注释,同时可以发现新的致病基因,有助于钩端螺旋体病致病机理的最终阐明.     

医学功能学网络虚拟实验室构建与使用探索

为克服传统功能学实验教学中存在的实验室资源、课时限制等不足．尝试构建与初步应用医学功能学网络虚拟实验室教学平台。相应虚拟教学软件采用c#语言、PhotoShop,3DSMAX、Flash等编写制作,并通过TCP／IP建立的Web服务器实现网络教学平台功能。网络实验室平台架构中,包含学生实验操作前台系统和实验教学管理后台系统。通过3届医学生的使用表明,网络虚拟实验室教学平台已初步实现其教学功能,其应用有利于提升学生自主学习能力和创新能力,解决了课时缩减和资源短缺等实验教学发展的瓶颈问题。